Summary
Mit Fast-Scan-Cyclovoltammetrie zu elektrisch evozierten präsynaptischen Dopamin-Dynamik in striatalen Hirnschnitten zu messen.
Abstract
Umfangreiche Forschung hat sich auf den Neurotransmitter Dopamin wegen ihrer Bedeutung in der Wirkmechanismus von Drogen (zB Kokain und Amphetamin), seine Rolle in psychiatrischen Erkrankungen (zB Schizophrenie und Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom mit Hyperaktivität), und seine Einbindung in degenerative konzentriert Erkrankungen wie Parkinson und Chorea Huntington. Unter normalen physiologischen Bedingungen wird Dopamin bekannt, Bewegungsaktivität, Kognition, Lernen, emotionale Auswirkungen, und neuroendokrinen Sekretion regulieren. Eines der größten Dichten von Dopamin-Neuronen innerhalb des Striatum, die in zwei unterschiedlichen neuroanatomischen Regionen wie der Nucleus accumbens und die caudate-Putamen bekannt aufgeteilt werden kann. Ziel ist es, ein allgemeines Protokoll für Stück Fast-Scan-Cyclovoltammetrie (FSCV) in der Maus Striatum zu illustrieren. FSCV ist eine gut definierte elektrochemische Technik bietet die Möglichkeit, die Freisetzung von Dopamin und Aufnahme zu messen und in Echtzeit in discrete Hirnregionen. Kohlefaser Mikroelektroden (Durchmesser von ca. 7 um) sind in FSCV zur Dopamin-Oxidation zu erkennen. Die analytische Vorteil der Verwendung FSCV zu Dopamin zu erkennen ist die erweiterte zeitliche Auflösung von 100 Millisekunden und räumlichen Auflösung von weniger als zehn Mikrometer, das ergänzende Informationen zur In-vivo-Mikrodialyse.
Protocol
1. Experimentelle essentials
Electrode Fabrication
- Es gibt zahlreiche Kohlefaser-Mikroelektroden Herstellungsmethoden, da die meisten in-house gemacht werden. In der Regel, was bestimmt die Elektrode Herstellung Details ist das elektrochemische Verfahren, das an der Elektrode (zB Amperometrie vs FSCV) angewendet wird. Für FSCV können Mikroelektroden in-house durchgeführt werden mit dem folgenden Drei-Stufen-Verfahren. Für eine vollständige Beschreibung der Kohlefaser-Elektrode Verarbeitung, siehe kürzlich JOVE Artikel 1. Beachten Sie jedoch, dass die Elektroden unten beschriebenen zylindrischen Kohlefaser Mikroelektroden, die weniger Schritte, um gegen die amperometrische Kohlefaser Mikroelektroden aus dem oben genannten Protokoll fabrizieren erfordern. Dieser vereinfachte Protokoll erfordert keine Kochen der Kohlefaser in Aceton, Feuer-Polieren der Glaskapillaren oder mit Epoxidharz auf die Glasfaser-Kreuzung Siegel.
- Mit Vakuum-Saug-Osmoseaß ein Kohlefaser (Durchmesser 7 um; Goodfellow Oakdale, PA) in ein Borosilikatglas Kapillare mit Mikrofilament (Länge 10 cm, od 1,2 mm, 0,68 mm ID, AM-Systeme, Carlsborg, WA).
- Legen Sie die Gewinde Kapillare in die Elektrode Abzieher (Narishige, Tokyo, Japan), wo die Kapillare in der Hälfte gezogen wird. Ausgabe-Einstellungen für die Elektrode puller tun von Labor zu Labor unterschiedlich sein. Als Referenz sind unsere Ausgangs-Einstellungen für den Abzieher 90,7 Hauptmagnet, 23,2 sub-Magnet, und 53,4 für die Heizung. Die Ausgabe-Einstellungen sollten empirisch verfeinert werden, um ein Glas Kegel, dass etwa 4,4 mm in der Länge, mit einem dicht um die Kohlefaser zu generieren.
- Unter einem Mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan), schneiden Sie die Kohlefaser (mit einem Skalpell), die sich aus dem Glas Spitze, wobei etwa 50-200 um der Kohlefaser aus dem dicht verschlossenen Schnittstelle herausragen.
Herstellung der Lösung
Drei Arten von künstlichen cereLiquor Flüssigkeit (aCSF)-Lösungen müssen im Voraus zubereitet werden, die alle in Reinstwasser (18 MOhm cm) Wasser.
- Saccharose-aCSF können hergestellt mindestens einen Tag vor dem Aufschneiden werden. Die Saccharose-aCSF Puffer besteht aus (in mm): 180 Saccharose, 30 NaCl, 4,5 KCl, 1,0 MgCl 2, 26 NaHCO 3, 1,2 NaH 2 PO 4 und 10 D-Glucose (pH 7,4) und sollte mit Sauerstoff unter Verwendung von 95 werden % O 2 / 5% CO 2 für 15 Minuten 2. Wenn vorbereitet vor der Zeit, kann die Lösung im Kühlschrank aufbewahrt werden bei 4 ° C für bis zu 1 Woche.
- ACSF-Lösung für die voltammetrische Aufnahmen sollte der Tag des Experiments vorbereitet werden. Die aCSF Lösung besteht aus (in mM): 126 NaCl, 2,5 KCl, 2,4 CaCl 2, 1,2 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1,2 NaH 2 PO 4, 11 D-Glucose, 0,4 Ascorbinsäure (pH 7,4). Im Laufe des Experiments, mit Sauerstoff durch Einblasen mit 95% O2 / 5% CO 2 bei Raumtemperatur.
- Modified-aCSF Lösung für Elektrode Kalibrierungen enthält (in mM): 2,5 KCl, 126 NaCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 2,4 CaCl 2, 1,2 MgCl 2 und 25 NaHCO 3 (pH 7,4) und gehalten werden kann für bis zu 1 Woche, ohne Kühl-oder Sauerstoffversorgung.
Kalibrierung der Elektrode
- Electrode Lebensfähigkeit und Empfindlichkeit wird durch Pre-und Post-Kalibrierung, bzw. bestimmt, wobei ein Fluss "t-cell" mit 3 Ports mit einer versiegelten Bezugselektrode (Ag / AgCl). Die gefertigten Mikroelektroden in den Fluss "t-cell" gesenkt. Die Einlassöffnung ist eine Spritzenpumpe verbunden, so dass für einen kontinuierlichen Fluss von veränderter aCSF bei einer Flussrate von 2 ml / min. Der dritte Port des "t-cell" ist eine Spritze mit 3 uM Dopamin, in veränderter aCSF gemacht gefüllt ist.
- Um Pre-Kalibrierung erlauben geändert aCSF Lösung für ca. 3 flow - 7 Sekunden, und dann manuell injiziert 1-2 ml der 3 uM Dopamin-Standard. Für jede Elektrodevor, kalibriert werden, wiederholen Sie die Kalibrierung mindestens 3-mal und der Mittelwert der maximalen Ströme von jeder erhalten.
- Unmittelbar nach der Scheibe Voltammetrie Experiment (vgl. Abschnitt 3), wird die Elektrode in der gleichen Weise post-kalibriert, wie oben beschrieben.
- Der Kalibrierfaktor (später während der Datenanalyse verwendet werden) wird durch Division des durchschnittlichen Dopamin Oxidation Strom (nA) durch die Konzentration des Dopamin-Standard bestimmt. Zum Beispiel ist die aktuelle Reaktion durch 3 geteilt, wenn Sie ein 3 uM Dopamin-Standard.
2. Slice-Vorbereitung
- Gießen Sie 10 ml Saccharose aCSF in ein kleines Becherglas und in einen Eiskübel. Zusätzlich Ort Sekundenkleber (Loctite 404) im Eiskübel, in greifbare Nähe.
- Bereiten Sie eine Rasierklinge und die notwendigen Werkzeuge für die Präparation erforderlich, wie Pinzetten, Spatel und Schere, indem Sie alle mit einem Alkoholtupfer reinigen.
- Sacrifice Maus durch CO 2 Ersticken in einem kleinen Gas-chamber, durch unmittelbare Enthauptung mit einer scharfen Schere an. Schnelles Entfernen des gesamten Gehirns. Legen Sie das Gehirn im Becher eiskaltem Saccharose aCSF für etwa 10 Minuten.
- In der Zwischenzeit bereiten Vibratom zum Schneiden. Legen Sie zuerst einige zerstoßenem Eis in der Probe Badewanne. Position der Probenkammer und ziehen Sie sie fest an seinem Platz halten. Fügen Sie mehr Eis um die Probenkammer, um die Lücken zu füllen, so dass Sie sicher, dass kein Eis wird in die Kammer. Setzen Sie den gereinigten Rasierklinge in den Messerhalter am Vibratom und füllen Sie die Probenkammer mit eiskaltem Saccharose aCSF.
- So richten Sie eine Arbeitsfläche für die Vorbereitung des Gehirns, gieße etwas kaltes Saccharose aCSF auf ein Stück Küchenpapier, das auf einem umgedrehten Petrischale gelegt wurde. Mit einer Pinzette Transfer des Gehirns auf die vorbereitete Petrischale. Für koronalen Scheiben schneiden das Kleinhirn an der medial-lateralen Achse mit einer Rasierklinge und zu verwerfen. Dies schafft eine flache Basis, dass die Vibratom Bühne angebracht werden kann.
- Orteinem Rückgang der Loctite-Kleber (platziert in den Eiskübel in Schritt 1) auf dem Objekttisch. Sofort halten befestigen Sie das flache Ende des präparierten Gehirns auf der Bühne, es so aufrecht wie möglich. Legen Sie die Bühne in der Probenkammer und die Schraube anziehen, dass das Gehirn vollständig in die Saccharose aCSF in der Kammer eingetaucht.
- Mit den Bedienelementen auf der Vorderseite des Vibratom Anpassung der Bühne, so dass die Rasierklinge Linie mit der Spitze des Gehirns. Optimale Parameter für die Vibratom werden durch die Einstellung der Frequenz und Geschwindigkeit zu niedrig erhalten. Niedrigere Geschwindigkeiten werden bevorzugt, um die Kraft der Klinge aus Quetschen des Gehirns, die bei höheren Geschwindigkeiten zu beobachten ist zu minimieren. Schichtdicke ist auf 400 um eingestellt.
- Die ersten paar Scheiben nicht enthalten Striatum. Wiederholen Sie das Schneiden bis Scheiben mit dem Striatum erhalten werden. Sobald das Striatum Region erreicht ist (bestätigt durch anatomische Landmarken), verwenden Sie einen Pinsel, um die Scheibe und in ein Becherglas mit LiftSauerstoff, bei Raumtemperatur aCSF. Normalerweise bekommt man 3 bis 4 Scheiben mit den striatalen komplex, so dass die caudate-Putamen und Nucleus accumbens enthalten sind.
- Lassen Sie die Scheiben in Sauerstoff aCSF bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde akklimatisieren, bevor Sie für Experimente.
3. Voltammetric Aufnahmen von Schnitten
Während die Scheiben Inkubation sind, kann die Scheibe Aufnahme Kammer vorbereitet werden.
- Nehmen Sie Schlauch mit dem Untertauchen Aufnahme Kammer (Custom Scientific, Denver, CO) und in sauerstoffartig, Raumtemperatur aCSF. Stellen Sie die Perfusionspumpe (Watson Marlow Limited, Falmouth, England) zu einer Durchflussrate von 1 ml / min. Stellen Sie den Temperaturregler auf 32 ° C. Nach aCSF füllt die custom-built Scheibe Halter (modifizierte Mesh-Disc-Stadium), bereiten sie für die Scheibe, indem Sie alle Luftblasen mit einer Spritze (BD Spinalnadel).
- Prime das Segment Bad durch Anlegen eines Vakuums auf demAbfluss-Schlauch (was zu Glas flüssige Abfälle Flasche) mit einer Spritze zu fließen beginnen. Legen Sie eine Kimwipe als Docht am Rand der Scheibe Inhaber zum Pufferüberlauf Kontrolle handeln.
- Nach 1 Stunde Inkubation, übertragen Sie die Scheiben auf die Scheibe Halter in der Aufnahme Kammer, die kontinuierlich mit 95% O 2 / 5% CO 2-Zimmer-Temperatur aCSF ist perfundiert.
- Tauchen Sie die Ag / AgCl-Referenzelektrode in der Slice-Halter (mit Klebeband an der Scheibe Deckel Kammer) und die Elektrode mit einer Krokodilklemme an die Spitze der Bühne.
- Die Ag / AgCl Referenz-Elektrode kann in Haus durch Eloxieren (+1 V) eine 250 mu m Silberdraht (AM Systems, Carlsborg, WA) in 1 M HCl für 5 Minuten auf eine dünne Schicht von AgCl auf der Oberfläche der Lagerstätte durchgeführt werden Silberdraht.
- Senken Sie die Wolfram-stimulierenden Elektrode (Plastics One, Roanoke, VA) an die Oberfläche des striatalen Hirnschnitten. Die stimulierenden Elektrode in Kontakt mit der Scheibe, wie es auf der Oberseite liegtdavon, sollte aber keine Löcher in die Scheibe. In unserer Versuchsanordnung ist die Stimulation durch einen Neurolog Stimulator erzeugt.
- Die Kohlefaser arbeiten Mikroelektroden ist wieder gefüllt mit einer 150 mM KCl-Lösung mit einem BD Spinalnadel. Ein Kabel ist dann eingefügt (Squires Electronics, Cornelius, OR), die auf den Kopf Stufe der Low-Noise ChemClamp Potentiostaten (Dagan Corporations, Minneapolis, MN) mit einer Krokodilklemme angeschlossen ist. Die Arbeitselektrode beträgt ca. 100 platziert - 200 pm vom bipolaren Reizelektroden, etwa 75 um tief in die Scheibe.
- Elektrische Stimulationen, entweder mit Einzel-(monophasische, 350 uA, 60 Hz und 4 ms Pulsbreite) oder mehrere (z. B. 5 Impulse, 350 uA, 20 Hz und 4 m breit) Impulse werden von der stimulierenden Elektrode auf Neurotransmitter hervorrufen geliefert Release 3.
- Um elektrisch evozierten Dopamin mit FSCV zu messen, ist ein Dreieck Wellenform an die Elektrode angelegt. Typische Parameter für dopAmin-Erkennung: Potenzial der Kohlefaser-Mikroelektroden ist bei -0,4 V gegen eine Ag / AgCl-Referenzelektrode, hochgefahren, um einen positiven Grenzwert von +1.2 V, dann wieder nach unten auf -0,4 V brachte mit einer Abtastrate von 400 statt V / s .
- Das Segment wird elektrisch stimuliert alle 5 Minuten und voltammetrischen Messungen der resultierenden Dopamin-Efflux für 15 Sekunden vorgenommen werden.
- Nach mindestens drei stabile elektrisch stimuliert die Freisetzung von Dopamin-Aufnahmen (Differenz zwischen Peakhöhe ist <10%), ist aCSF mit pharmakologischer Wirkstoff von Interesse bei einer Flussrate von 1 ml / min über die Scheibe für 30 Minuten, um maximale Wirkung zu erhalten perfundiert. Elektrisch stimuliert Dopamin Aufnahmen werden alle 5 Minuten während der pharmakologischen Perfusion gemacht.
4. Datenanalyse
Resultierende Strom-Zeit-Spuren aus der Scheibe erzielt werden durch nichtlineare Regression, eine Reihe von Michaelis-Menten-basierte Gleichungen fit werden, wie beschrieben Wightmanund Kollegen in Software in LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) 4-6 geschrieben. Und Dopamin-Konzentration pro Impuls (nM; In dieser Software können aktuelle Abhängigkeit von der Zeit Spuren durch Variation zwei Parameter, V max (entsprechend der Geschwindigkeit der Aufnahme durch den Dopamin-Transporter wie der absteigenden Phase der Spur gezeigt nM / s) ausgestattet werden ; entsprechend der Peakhöhe Maximum). Der K m-Wert, so wie die Affinität von Dopamin für die Dopamin-Transporter, ist auf 160 nm eingestellt und nicht verändert. Die Elektrode ist post-Kalibrierfaktor, dass nach dem Experiment bestimmt wird vor der Montage erforderlich. Die LabView-Software enthält das Bestimmtheitsmaß (R 2) Parameter, um die Güte der Anpassung (R 2-Werte> 0,8 verwendet werden) zu bestimmen.
5. Repräsentative Ergebnisse
FSCV wurde verwendet, um single-pulse, elektrisch stimuliert die Freisetzung von Dopamin und Aufnahme in die caudate-setzen zu untersuchenAmen (CPU), Nucleus accumbens (NAc) Kern, und NAC-Shell in Mäusen. Repräsentative Ergebnisse in Abbildung 1A dargestellt zeigen aktuelle (oder Konzentration) gegen die Zeit Grundstücke. Der rote Pfeil zeigt an, wann elektrische Impulse an die Scheibe durch einen entsprechenden Anstieg der Menge an Strom, die auf Veränderungen im Dopamin-Konzentration an der Kohlefaser-Mikroelektroden gefolgt angewendet wird. Die vorherrschende Prozess bei der elektrischen Stimulation wird die Freisetzung von Dopamin, aber auch andere Prozesse wie Aufnahme und Verbreitung beitragen, die insgesamt beobachtete Peakhöhe als auch. Der absteigende Phase der Gipfel ist vor allem zurückzuführen auf die Neurotransmitter durch seine Transporter-Wiederaufnahmehemmer seit neuronale Stimulation hat 7 gestoppt worden. Allerdings ist die Peak-Zerfall nicht beschränkt auf Wiederaufnahme, wie Diffusion und den Stoffwechsel auch auf die Abnahme des Stroms beitragen. Es wurde postuliert, dass seit der Zeitskala von elektrochemischen Messungen ist eine Sache von Sekunden, FSCV zu schnell, um contributio Maßnahme istns aus dem Stoffwechsel 7. In dieser aktuellen gegen die Zeit Spuren, die y-Achse die Konzentration (M) mit der post-Experiment Kalibrierfaktor umgewandelt. Der Einschub für die Abbildung 1A ist der jeweilige Hintergrund subtrahiert Cyclovoltammogramme für die aktuelle Funktion der Zeit Spuren. Trägt man die gemessenen Strom (y-Achse) gegen das angelegte Potential an der Elektrode (x-Achse), ist Dopamin chemisch mit einem beobachteten Oxidationspeak auf +0,6 V und eine entsprechende Verringerung Gipfel des Dopamin-ortho-Chinon ist beobachtet identifiziert - 0,2 V gegen eine Ag / AgCl-Referenzelektrode. Die dritte Darstellung der Daten verwendet eine dreidimensionale Falschfarben-Plot (Abbildung 1B) die Kombination der Informationen aus beiden die aktuelle Abhängigkeit von der Zeit Spuren und das Cyclovoltammogramm einer einzigen Handlung bilden. In der repräsentativen Pseudo-Farbdarstellung, die Zeit in Sekunden entlang der x-Achse aufgetragen ist, wird die angelegte Spannung um die Kohlefaser arbeiten Mikroelektroden entlang der y-Achse grafisch dargestellt, und Strom wird als fal vertretense Farbe entlang der z-Achse. Aufgrund der geringen Größe der Kohlefaser-Mikroelektroden (~ 7 &mgr; m im Durchmesser) können elektrisch stimuliert Dopamin Dynamik in diskreten anatomischen Regionen des Striatum (; Abbildung 2 CPU gegenüber NAc Kern gegenüber NAc shell) nachgewiesen werden.
Ein Vorteil der Verwendung striatalen koronalen Scheiben ist, dass sie Beiträge macht aus dem Dopamin Zellkörper, und ermöglicht eine Untersuchung der präsynaptischen Dopamin-Dynamik. Präsynaptische Kontrolle der Freisetzung von Dopamin und die Aufnahme ist nicht streng an Dopamin Autorezeptor oder Transporter Funktionen beschränkt wie andere 16, 17 gezeigt haben. Heterorezeptoren anderer Neurotransmitter-Systeme auch modulieren Dopamin Dynamik 18, 19. Vertreter aktuelle Abhängigkeit von der Zeit Spuren in Abbildung 3A gezeigt zeigen, dass bei Scheiben mit 1 uM Quinpirol (D2/D3-Rezeptor-Agonist) für 30 Minuten, was einem Rückgang in elektrisch evozierte Freisetzung von Dopamin behandelt werden beobachtet. Auf der anderen Seite, wenn ein Substratfür den Dopamin-Transporter, wie Methamphetamin, über die Scheibe für 30 Minuten perfundiert wird, ist kein Unterschied in der Freisetzung von Dopamin (Abbildung 3B). Die Peak-Zerfall ist auf der rechten Seite, die normalerweise mit Veränderungen in Dopamin-Transporter-Kinetik (K m) 3 verbunden ist verschoben. Schließlich ist 3C einer repräsentativen Spur des Stroms über der Zeit verfolgen, sobald die Scheibe wurde in einer 100 ng / mL brain-derived neurotrophic factor (BDNF)-Lösung, die die Hypothese aufgestellt hat, um Einfluss Freisetzung von Dopamin Dynamik 20, 21 wurde gebadet. Aus dieser repräsentativen Spur, erkennt man, dass BDNF die Möglichkeit, elektrisch evozierte Freisetzung von Dopamin zu verbessern hat. Zusammengenommen unterstreichen diese pharmakologische Behandlungen der Nutzen FSCV zu Dopamin Dynamik in das Striatum Sonde.
Die wichtigste Einschränkung der Verwendung von Hirnschnitten zu präsynaptischen Dopamin-Dynamik von FSCV untersuchen ist, dass die neurocircuitry von einem intakten Gehirn verloren geht.Mit Scheibe FSCV ist es unmöglich, die Auswirkungen von Neurotransmittern aus anderen Hirnregionen Studie, was es schwierig macht Beiträgen dieser Systeme auf die Funktionalität der Region untersucht verstehen (z. B. das Striatum) oder nicht-stimulierten Dopaminspiegel bewerten. 24 - Allerdings haben die jüngsten technischen Fortschritte in FSCV für Dopamin transiente Messungen (mit und ohne elektrische Stimulation) in sich frei bewegenden Ratten in Reaktion auf eine pharmakologische Manipulation, Selbstverwaltung, oder Neuheit 22 erlaubt. Insgesamt bietet slice FSCV wertvolle Informationen über präsynaptische Dynamik und Kopplung Scheibe FSCV Ergebnisse zu komplementären neurochemischen Techniken wie Mikrodialyse, Elektrophysiologie und / oder frei beweglichen FSCV bietet eine umfassendere Sicht von Neurotransmitter-Funktion im Gehirn.
Abbildung 1. Dopamin Elektrisch evoziertee Freisetzung gemessen FSCV folgende single-pulse Stimulation in dorsalen CPu Scheiben von C57BL/6J-Mäuse. (A) Die Konzentration gegen die Zeit verfolgen, in denen die Freisetzung von Dopamin durch einen einzelnen Impuls (roter Pfeil) hervorgerufen wurde. Die einzelnen Stern repräsentiert die Faktoren, die zum Anstieg der Konzentration, die überwiegend Freisetzung von Dopamin beitragen, aber die Aufnahme und Verbreitung auch beitragen. Die Doppel-Stern steht für die Peak-Signal wieder auf den Ausgangswert, was hauptsächlich auf die Aufnahme, sondern auch Diffusion beiträgt. Inset zeigt die entsprechenden Cyclovoltammogramme. (B) Vertreter Farbplots aus dem dorsalen CPU Anzeige der Zeit (x-Achse), angewendet Potenzial, die Kohlefaser-Mikroelektroden gegen Ag / AgCl-Referenzelektrode (y-Achse) und Strom in pseudo-Farbe.
Abbildung 2. Dopamin-Freisetzung durch einen einzigen elektrischen Stimulationsimpulses (gekennzeichnet durch den roten Pfeil) in der NAC Kern hervorgerufenund Shell C57BL/6J-Mäuse. (A und C) Die Konzentration gegen die Zeit Spuren und ihre entsprechenden Cyclovoltammogramme (kleines Bild) von der NAC Kern und Schale. (B und D) Wie zuvor beschrieben, Vertreter Farbplots aus dem NAc Kern und Schale.
Abbildung 3 Vertreter Spuren nach der Scheibe wurde mit einem pharmakologischen Wirkstoff für 30 Minuten behandelt;. In allen Fällen ein einzelner Impuls wurde zur Freisetzung von Dopamin in der CPU hervorrufen. (A) Die Anwendung des Dopamin D2-Rezeptor-Agonist, Quinpirol (rote Kurve) vor der Behandlung (schwarze Kurve) verglichen. (B) Methamphetamine Perfusion (lila Linie) vor der Behandlung (schwarze Kurve) verglichen. (C) Die Fähigkeit von brain-derived neurotrophic factor zu beeinflussen Dopamin Dynamik (blaue Kurve) im Vergleich zu vor der Behandlung (schwarze Kurve).
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Discussion
Das Protokoll hier vorgestellten demonstriert, wie die Vorbereitung und Verwendung der Maus koronalen Hirnschnitten für FSCV Experimente. 11 - Diese Methode ist zwar spezifisch für den Erhalt und die Messung Dopamin Dynamik, andere Neurotransmitter wie Adenosin, haben Wasserstoffperoxid, Noradrenalin und Serotonin in vivo oder in vitro mit FSCV 3, 8 überwacht. FSCV können verwendet werden, um einige dieser anderen neurochemicals durch einfache Modifikationen der Wellenform angewendet auf die Arbeitselektrode 3, 11 zu überwachen. Da viele dieser neurochemischen Spezies ähnlich Oxidationspotentiale haben, bieten die Cyclovoltammogramme erzeugt eine einzigartige chemische Fingerabdruck für jedes oxidierbare Spezies, die chemische Identifizierung ermöglicht. Darüber hinaus hat FSCV in verschiedenen Arten verwendet wurden, von Fruchtfliegen auf nicht-menschliche Primaten, zu einem besseren Verständnis der Neurotransmission in diesen Modellorganismen 12 zu gewinnen - 15. Einer der Hauptgründe dafür, dass FSCV hat been in einer solchen Vielfalt von Arten eingesetzt wird aufgrund des geringen Durchmessers der Kohlefaser Mikroelektroden, typischerweise weniger als 7 m im Durchmesser. Als Folge machen diese Mikroelektroden es möglich, Gewebe aus sehr kleinen Umgebungen Probe, wie im Fall der Fruchtfliege Gehirn (NL) oder von diskreten Sub-anatomischen Regionen wie dem NAc Kern gegenüber der Shell in größeren Spezies 12 diskriminieren -14.
Abschließend stellte die Ergebnisse hier zeigen, dass slice Voltammetrie ein unschätzbares Werkzeug, um elektrochemische präsynaptischen Dopamin-Dynamik in der Maus striatum Sonde ist. Die repräsentativen Daten konzentriert sich auf die Perfusion pharmakologische Wirkstoffe über einen Hirnschnitt von einem "normalen oder gesunden" Kontrolle und die Fähigkeit, Parameter der Freisetzung von Dopamin und Aufnahme zu charakterisieren. Darüber hinaus können FSCV verwendet werden, um Unterschiede in elektrisch stimulierte Freisetzung und Aufnahme-Parameter in gentechnisch veränderten oder behandelten Tiere auf ihren eigenen oder nach pharmac bewertengischen Behandlung von 15 bis 16. Scheiben FSCV bietet eine einzigartige Gelegenheit, Dopamin-Neurotransmission Dynamik in diskreten anatomischen Regionen, die auf einer Zeitskala von Millisekunden auftreten zu untersuchen. Insgesamt bietet die elektrochemische Technik FSCV sowohl eine verbesserte räumliche und zeitliche Auflösung im Vergleich zu anderen neurochemischen Techniken.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Förderung des National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIAAA; AA-016967 und AA016967-01S1; TAM), Start der Wayne State University von Fonds und der Wayne State University Research Grant Program. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und repräsentieren nicht die offiziellen Ansichten der NIAAA oder den National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | 7447407 | |
| Sodium chloride | EMD Millipore | 7647145 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 7791186 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035048 | |
| Sodium bicarbonate | EMD Millipore | 144558 | |
| Sodium phosphate,Dibasic | EMD Millipore | 7558794 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | 50997 | |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | 50817 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 57501 | |
| Carbon fiber | Goodfellow | ||
| Glass capillary | A-M Systems | 602000 | |
| Silver wire | A-M Systems | 787000 | |
| Tungsten stimulating electrode | Plastics One | ||
| Platinum wire | |||
| Lead wire | Squires Electronics, Cornelius, OR | ||
| Loctite 404 instant adhesive | Hankal Corp. | ||
| Razor blade | World Precision Instruments, Inc. | ||
| BD Spinal needle | BD Biosciences | REF 405234 | |
| Surgical Blade | Feather Safety Razor Co, Ltd. | ||
| TH software | ESA Inc.,Chelmsford, MA | ||
| Submersion recording chamber | Custom Scientific | ||
| Neorolog stimulus isolator |  Digitimer Ltd. |
NL800A | |
| Automatic temperature controller | Warner Instruments | ||
| Microscope (SZX7) | Olympus Corporation | ||
| Microscope | Fisher Scientific | ||
| Vibratome 3000 sectioning system | St. Louis , MO. | ||
| Perfusion pump | Watson-Marlow Pumps Group | H110708 | |
| Micropipette puller | Narishige International | ||
| ChemClamp potentiostat | Dagan Corporations |
References
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