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Neuroscience

फास्ट स्कैन चक्रीय Voltammetry के साथ Striatal मस्तिष्क स्लाइसें में presynaptic Dopamine गतिशीलता

Published: January 12, 2012 doi: 10.3791/3464
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Chemistry, Wayne State University
* These authors contributed equally

Summary

Striatal मस्तिष्क स्लाइसें में विद्युत पैदा presynaptic डोपामाइन गतिशीलता को मापने के लिए तेजी से स्कैन चक्रीय voltammetry का उपयोग.

Abstract

व्यापक अनुसंधान neurotransmitter dopamine के दुरुपयोग की दवाओं (जैसे कोकीन और एम्फ़ैटेमिन), मानसिक बीमारियों में यह भूमिका निभाता है (जैसे एक प्रकार का पागलपन और ध्यान घाटे विकार), और अपक्षयी में अपनी भागीदारी की कार्रवाई के तंत्र में इसके महत्व की वजह से ध्यान केंद्रित किया है पार्किंसंस और Huntington रोग की तरह विकारों. सामान्य शारीरिक शर्तों के तहत, डोपामाइन हरकत गतिविधि, अनुभूति, सीखने, भावनात्मक को प्रभावित, और neuroendocrine हार्मोन स्राव को विनियमित करने के लिए जाना जाता है. Dopamine न्यूरॉन्स की सबसे बड़ी घनत्व striatum, जो दो अलग neuroanatomical नाभिक accumbens और पूंछवाला - putamen के रूप में जाना जाता क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है के भीतर है. उद्देश्य माउस striatum के भीतर टुकड़ा तेजी से स्कैन चक्रीय voltammetry (FSCV) के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल वर्णन है. FSCV एक अच्छी तरह से परिभाषित विद्युत घ में वास्तविक समय में dopamine के रिलीज और तेज उपाय करने का अवसर प्रदान तकनीकiscrete मस्तिष्क क्षेत्रों. कार्बन फाइबर microelectrodes (~ 7 सुक्ष्ममापी के व्यास) FSCV डोपामाइन ऑक्सीकरण का पता लगाने में उपयोग किया जाता है. FSCV का उपयोग करने dopamine का पता लगाने के विश्लेषणात्मक लाभ 100 मिसे और कम से कम दस microns के स्थानिक संकल्प, vivo microdialysis में पूरक जानकारी उपलब्ध कराने की अपनी बढ़ाया अस्थायी समाधान है.

Protocol

1. प्रायोगिक अनिवार्य

इलेक्ट्रोड निर्माण

  • वहाँ कई कार्बन फाइबर microelectrodes निर्माण विधियों के बाद से सबसे घर में बना रहे हैं. आमतौर पर क्या इलेक्ट्रोड निर्माण विवरण तय है कि इलेक्ट्रोड (जैसे amperometry बनाम FSCV) के लिए लागू किया जाता है विद्युत तकनीक है. FSCV के लिए, microelectrodes घर में बनाया जा सकता है निम्नलिखित तीन कदम प्रक्रिया का उपयोग कर. कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड निर्माण के अधिक पूर्ण विवरण के लिए, हाल ही में एक जौव 1 लेख देखें . हालाँकि, ध्यान दें कि नीचे वर्णित इलेक्ट्रोड बेलनाकार कार्बन फाइबर microelectrodes है, जो कम करने के लिए उपर्युक्त प्रोटोकॉल से amperometric कार्बन फाइबर microelectrodes बनाम बनाना कदम की आवश्यकता है. यह सरल प्रोटोकॉल एसीटोन में कार्बन फाइबर उबलते की आवश्यकता नहीं है, कांच capillaries आग पॉलिश, या epoxy उपयोग के लिए ग्लास फाइबर जंक्शन मुहर.
  • वैक्यूम चूषण aspir का उपयोगएक borosilicate कांच microfilament (, AM सिस्टम, Carlsborg, WA 10 सेमी लंबाई, आयुध डिपो 1.2 मिमी, आईडी 0.68 मिमी) के साथ केशिका में, एक कार्बन फाइबर (गूड Oakdale, PA व्यास सुक्ष्ममापी 7) खा लिया.
  • जहां केशिका आधा में खींच लिया है इलेक्ट्रोड (Narishige, टोक्यो, जापान) खींचने में पिरोया केशिका रखें. इलेक्ट्रोड खींचने के लिए आउटपुट सेटिंग्स प्रयोगशाला से प्रयोगशाला के लिए अलग अलग करते हैं. संदर्भ के लिए, हमारे खींचने के लिए उत्पादन सेटिंग्स 90.7 मुख्य चुंबक, चुंबक 23.2 - उप, और 53.4 हीटर के लिए कर रहे हैं. उत्पादन सेटिंग्स empirically एक गिलास शंकु कि लंबाई में कार्बन फाइबर के चारों ओर एक तंग सील के साथ लगभग 4.4 मिमी है उत्पन्न करने के लिए परिष्कृत करना चाहिए.
  • एक खुर्दबीन के तहत (ओलिंप, टोक्यो, जापान), कार्बन फाइबर (एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर) कांच टिप से कार्बन फाइबर के लगभग 50-200 सुक्ष्ममापी कसकर मोहरबंद अंतरफलक से बहर करने की अनुमति देने ट्रिम.

समाधान तैयार

कृत्रिम चिपकाना के तीन प्रकारbrospinal द्रव समाधान (aCSF) के लिए अग्रिम में तैयार ultrapure पानी (MΩ 18 सेमी) में, की जरूरत है.

  • Sucrose - aCSF टुकड़ा करने की क्रिया से पहले कम से कम एक दिन होने के लिए तैयार कर सकते हैं. बफर sucrose - aCSF (मिमी) के होते हैं: 180 sucrose, 30 NaCl, KCl 4.5, 1.0 2 MgCl, 26 NaHCO 3, 1.2 नाह 2 पीओ 4, और 10 डी ग्लूकोज (7.4 पीएच) oxygenated और 95 का उपयोग किया जाना चाहिए % 15 2 मिनट के लिए हे 2 / 5% सीओ 2 . अगर समय से आगे तैयार है, तो समाधान 4 में प्रशीतित रखा जा सकता है ° सी 1 सप्ताह के लिए.
  • ACSF समाधान voltammetric रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोग के दिन तैयार रहना चाहिए. 126 NaCl, 2.5 KCl, 2.4 CaCl 2, 1.2 से 2 MgCl, 25 NaHCO 3, 1.2 नाह 2 पीओ 4, 11 डी ग्लूकोज, 0.4 ascorbic एसिड (7.4 पीएच): aCSF समाधान (मिमी) के होते हैं. प्रयोग, 95% कमरे के तापमान पर O2 / 5% सीओ 2 के साथ बुदबुदाती आक्सीजन के दौरान .
  • संशोधित -इलेक्ट्रोड शामिल calibrations के लिए aCSF समाधान (मिमी): 2.5 KCl, 126 NaCl, 1.2 2 नाह पीओ 4, 2.4 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, और 25 NaHCO तीन (7.4 पीएच) और एक सप्ताह के लिए रखा जा सकता है है बिना, प्रशीतन या oxygenation.

इलेक्ट्रोड अंशांकन

  • इलेक्ट्रोड व्यवहार्यता और संवेदनशीलता के पूर्व और बाद अंशांकन क्रमशः द्वारा निर्धारित किया जाता है, एक प्रवाह "टी सेल एक मोहरबंद संदर्भ इलेक्ट्रोड (एजी / AgCl) के साथ 3 बंदरगाहों से युक्त का उपयोग. गढ़े microelectrode प्रवाह "टी सेल" में उतारा है. इनलेट पोर्ट एक सिरिंज पंप से जुड़ा है, 2 एमएल / मिनट की एक प्रवाह की दर में एक संशोधित - aCSF के सतत प्रवाह के लिए अनुमति देता है. "टी सेल" के तीसरे बंदरगाह 3 सुक्ष्ममापी डोपामाइन, संशोधित - aCSF में बनाया से भरा सिरिंज से जुड़ा है.
  • पूर्व जांचना, संशोधित aCSF समाधान के बारे में 3 के लिए प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं - 7 सेकंड, और तब मैन्युअल 3 सुक्ष्ममापी डोपामाइन मानक के 1-2 एमएल इंजेक्षन. प्रत्येक इलेक्ट्रोड के लिएपूर्व कैलिब्रेटेड, अंशांकन कम से कम 3 बार और अधिक से अधिक प्रत्येक से प्राप्त धाराओं औसत दोहराएँ.
  • टुकड़ा voltammetry प्रयोग के तुरंत बाद (3 अनुभाग देखें), इलेक्ट्रोड के बाद एक ही तरीके से कैलिब्रेटेड के रूप में ऊपर वर्णित है.
  • अंशांकन कारक (बाद में डेटा विश्लेषण के दौरान इस्तेमाल किया) डोपामाइन मानक की एकाग्रता द्वारा औसत डोपामाइन वर्तमान ऑक्सीकरण (एनए) विभाजित करके निर्धारित किया जाता है. उदाहरण के लिए, वर्तमान प्रतिक्रिया 3 से विभाजित है जब एक 3 सुक्ष्ममापी डोपामाइन मानक का उपयोग कर.

2. स्लाइस की तैयारी

  1. एक छोटे और एक बर्फ बाल्टी में बीकर जगह में sucrose aCSF के 10 एमएल डालो. इसके अतिरिक्त, जगह बर्फ बाल्टी में तत्काल (404 लॉकटाइट) पहुंच के भीतर, चिपकने वाला.
  2. एक रेजर ब्लेड और संदंश, रंग, और कैंची के रूप में आवश्यक विच्छेदन के लिए आवश्यक उपकरण, एक शराब पैड के साथ उन्हें साफ पोंछते द्वारा तैयार करें.
  3. सीओ 2 asphyxiation के द्वारा एक छोटे गैस चा में माउस का बलिदानmber, तत्काल तेज कैंची का उपयोग करते हुए कत्ल के द्वारा पीछा किया. जल्दी से पूरे मस्तिष्क को हटा दें. मस्तिष्क ठंडा sucrose aCSF के बीकर में लगभग 10 मिनट के लिए रखें.
  4. इस बीच में, टुकड़ा करने की क्रिया के लिए तैयार Vibratome. सबसे पहले, नमूना स्नान में कुछ कुचल बर्फ जगह है. नमूना कक्ष की स्थिति है और यह जगह में मजबूती से पकड़ कस. नमूना कक्ष के आसपास और अधिक बर्फ जोड़ें अंतराल में भरने, यकीन है कि कोई बर्फ कक्ष में हो जाता है. Vibratome पर ब्लेड धारक में साफ धार प्लेस और ठंडा sucrose aCSF के साथ नमूना कक्ष को भरने.
  5. मस्तिष्क की तैयारी के लिए एक काम की सतह की स्थापना के लिए, कागज तौलिया का एक टुकड़ा है कि एक upturned पेट्री डिश पर रखा गया है पर कुछ ठंडे sucrose aCSF डालना. का प्रयोग संदंश तैयार पेट्री डिश पर मस्तिष्क हस्तांतरण. राज्याभिषेक के स्लाइस के लिए, एक रेजर ब्लेड और त्यागने के साथ अक्ष औसत दर्जे का पार्श्व के साथ सेरिबैलम काटा. यह एक फ्लैट आधार है कि Vibratome मंच पर चिपका किया जा सकता है है बनाता है.
  6. जगहलॉकटाइट चिपकने के एक बूंद नमूना मंच पर चरण 1 के दौरान बर्फ बाल्टी में रखा. तत्काल, प्रत्यय मंच पर तैयार मस्तिष्क के फ्लैट अंत, यह संभव के रूप में के रूप में सीधा रखते हुए. नमूना कक्ष में मंच प्लेस और पेंच कस, यह सुनिश्चित करना है कि मस्तिष्क पूरी तरह से कक्ष में sucrose aCSF में डूब जाता है.
  7. समायोजित चरण Vibratome के मोर्चे पर नियंत्रण का उपयोग करना इतना है कि मस्तिष्क के शीर्ष के साथ धार लाइनों. Vibratome के लिए इष्टतम मापदंडों आवृत्ति और गति को कम करने के लिए सेटिंग के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं. लोअर गति दिमाग है, जो उच्च गति पर मनाया जाता है squashing से ब्लेड के बल को कम करने के लिए पसंद कर रहे हैं. स्लाइस की मोटाई 400 सुक्ष्ममापी करने के लिए सेट कर दिया जाता है.
  8. पहले कुछ स्लाइस striatum नहीं शामिल होंगे. टुकड़ा करने की क्रिया को दोहराएँ जब तक striatum युक्त स्लाइसें प्राप्त कर रहे हैं. एक बार striatal क्षेत्र (संरचनात्मक स्थलों द्वारा पुष्टि) तक पहुँच जाता है, एक पेंट ब्रश का उपयोग करने के साथ टुकड़ा और एक बीकर में जगह लिफ्टoxygenated, कमरे के तापमान aCSF. आमतौर पर, एक 3 से 4 स्लाइस striatal जटिल ताकि पूंछवाला putamen और नाभिक accumbens शामिल हैं युक्त प्राप्त कर सकते हैं.
  9. स्लाइस प्रयोगों के लिए उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर oxygenated aCSF में कम से कम 1 घंटे के लिए acclimate करने के लिए अनुमति दें.

3. स्लाइस से Voltammetric रिकॉर्डिंग

जबकि स्लाइस incubating हैं, टुकड़ा रिकॉर्डिंग कक्ष तैयार किया जा सकता है.

  1. डुबकी रिकॉर्डिंग कक्ष (कस्टम वैज्ञानिक, डेन्वर, CO), कमरे के तापमान aCSF oxygenating में जगह से जुड़े टयूबिंग लो. 1 एमएल / मिनट की एक प्रवाह की दर से छिड़काव पंप सेट (वाटसन मार्लो लिमिटेड, Falmouth, इंग्लैंड). 32 डिग्री सेल्सियस तापमान नियंत्रक सेट बाद aCSF कस्टम निर्मित टुकड़ा धारक (जाल डिस्क चरण संशोधित) भरता है, किसी भी हवाई बुलबुले का उपयोग कर एक सुई सिरिंज (बी रीढ़ की हड्डी में सुई) को हटाने के द्वारा यह टुकड़ा के लिए तैयार करते हैं.
  2. प्रधानमंत्री पर एक वैक्यूम ड्राइंग द्वारा टुकड़ा स्नानबहिर्वाह टयूबिंग (गिलास तरल अपशिष्ट बोतल करने के लिए अग्रणी) एक सिरिंज का उपयोग करने के लिए प्रवाह शुरू. एक टुकड़ा करने के लिए बफर अतिप्रवाह नियंत्रण धारक के किनारे पर एक बाती के रूप में कार्य kimwipe रखें.
  3. 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, रिकॉर्डिंग कक्ष में टुकड़ा धारक, जो लगातार 95% हे 2 / 5% सीओ 2 कमरे के तापमान aCSF के साथ perfused है स्लाइस हस्तांतरण .
  4. एजी / AgCl डूब टुकड़ा धारक में संदर्भ इलेक्ट्रोड (टुकड़ा चैम्बर के ढक्कन के लिए टेप) और एक मगरमच्छ क्लिप सिर मंच का उपयोग कर इलेक्ट्रोड कनेक्ट.
    • संदर्भ / एजी AgCl इलेक्ट्रोड (1 वी) 1 एम एचसीएल में 5 मिनट के लिए एक 250 सुक्ष्ममापी चांदी के तार (AM सिस्टम्स, Carlsborg, WA) anodizing AgCl की एक पतली परत की सतह पर जमा द्वारा घर में बनाया जा सकता है चांदी के तार.
  5. Striatal मस्तिष्क टुकड़ा की सतह को कम टंगस्टन उत्तेजक इलेक्ट्रोड (एक प्लास्टिक, Roanoke, VA). उत्तेजक इलेक्ट्रोड टुकड़ा के साथ संपर्क में आता है के रूप में यह शीर्ष पर टिकी हुई हैयह की, लेकिन टुकड़ा पंचर नहीं किया जाना चाहिए. में हमारे सेट अप प्रयोगात्मक, उत्तेजना Neurolog उत्तेजक औधधि द्वारा उत्पन्न होता है.
  6. कार्बन फाइबर काम microelectrode एक 150 मिमी KCl एक बी.डी. रीढ़ की हड्डी में सुई का उपयोग समाधान के साथ वापस भरा है. एक का नेतृत्व तार तो डाला जाता है (Squires इलेक्ट्रॉनिक्स, कुरनेलियुस, या), जो कम शोर ChemClamp potentiostat (दगन निगमों, Minneapolis, MN) एक मगरमच्छ क्लिप का उपयोग कर के सिर चरण करने के लिए जुड़ा हुआ है. काम कर इलेक्ट्रोड रखा गया है लगभग 100 - 200 सुक्ष्ममापी द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड से दूर के बारे में 75 टुकड़ा में गहरी सुक्ष्ममापी.
  7. बिजली stimulations, या तो एकल (monophasic, 350 μA, 60 हर्ट्ज, और 4 एमएस पल्स चौड़ाई) या एकाधिक (जैसे दालों 5, 350 μA, 20 हर्ट्ज, और 4 एमएस विस्तृत) दालों का उपयोग कर, उत्तेजक neurotransmitter आह्वान इलेक्ट्रोड के द्वारा दिया जाता है 3 जारी.
  8. विद्युत पैदा FSCV का उपयोग डोपामाइन को मापने के लिए, एक त्रिकोण तरंग इलेक्ट्रोड को लागू किया जाता है. मदिरा के लिए विशिष्ट पैरामीटर्सamine का पता लगाने: कार्बन फाइबर microelectrode के संभावित एजी / AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड, 1.2 वी की एक सकारात्मक सीमा ramped है, तो वापस नीचे 400 के एक स्कैन दर पर -0.4 वी लाया बनाम -0.4 वी पर आयोजित किया जाता है वी / s .
  9. टुकड़ा विद्युत प्रेरित है हर 5 मिनट और voltammetric परिणामस्वरूप डोपामाइन तपका के माप 15 सेकंड के लिए बना रहे हैं.
  10. कम से कम तीन स्थिर विद्युत उत्तेजित dopamine जारी रिकॉर्डिंग (पीक ऊंचाई के बीच अंतर <10% है) के बाद, 1 / 30 मिनट के लिए अधिक से अधिक प्रभाव प्राप्त करने के लिए टुकड़ा पर एमएल मिनट की एक प्रवाह दर पर ब्याज की औषधीय एजेंट युक्त aCSF perfused है. विद्युत उत्तेजित डोपामाइन रिकॉर्डिंग औषधीय छिड़काव के दौरान हर 5 मिनट में बना रहे हैं.

4. डेटा विश्लेषण

परिणामस्वरूप वर्तमान बनाम समय टुकड़ा से प्राप्त निशान nonlinear प्रतिगमन द्वारा Michaelis - Menten आधारित समीकरणों का एक सेट करने के लिए फिट हो सकता है, के रूप में Wightman द्वारा वर्णितऔर LabVIEW (नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स, ऑस्टिन, TX) 4-6 में लिखा सॉफ्टवेयर में सहयोगियों. और नाड़ी प्रति dopamine एकाग्रता (एनएम, इस सॉफ्टवेयर में, वर्तमान बनाम समय निशान दो पैरामीटर, वी अधिकतम (डोपामाइन ट्रांसपोर्टर द्वारा तेज की दर का पता लगाने के उतरते चरण द्वारा प्रदर्शन के रूप में करने के लिए इसी एनएम / ओं) को अलग से फिट किया जा सकता है ; पीक ऊंचाई अधिकतम करने के लिए इसी). कश्मीर मीटर मूल्य, डोपामाइन ट्रांसपोर्टर के लिए dopamine के आकर्षण का चिंतनशील, 160 एनएम के लिए सेट कर दिया जाता है और नहीं बदला. इलेक्ट्रोड के कारक के बाद अंशांकन है कि प्रयोग के बाद निर्धारित किया जाता है फिटिंग के लिए पहले आवश्यक है. LabVIEW सॉफ्टवेयर दृढ़ संकल्प के गुणांक (2 आर) फिट की भलाई (आर 2 मूल्यों 0.8> उपयोग किया जाता है) निर्धारित करने के लिए पैरामीटर शामिल हैं.

5. प्रतिनिधि परिणाम

FSCV एकल नाड़ी, विद्युत प्रेरित dopamine और पूंछवाला - डाल में जारी तेज की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया थातथास्तु (सीपीयू), नाभिक accumbens (एनएसी) कोर, और चूहों में एनएसी खोल. प्रतिनिधि 1A चित्र में दिखाया गया है परिणाम (या एकाग्रता) वर्तमान समय बनाम भूखंडों प्रदर्शित करता है. लाल तीर इंगित करता है जब बिजली की उत्तेजना डोपामाइन एकाग्रता में कार्बन फाइबर microelectrode पर परिवर्तन करने के लिए attributable वर्तमान की राशि में एक इसी वृद्धि के द्वारा पीछा टुकड़ा करने के लिए लागू किया जाता है. बिजली की उत्तेजना के दौरान प्रमुख प्रक्रिया dopamine जारी है, लेकिन तेज और प्रसार जैसे अन्य प्रक्रियाओं समग्र मनाया शिखर ऊंचाई के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए योगदान. चोटी के उतरते चरण के लिए मुख्य रूप से अपने ट्रांसपोर्टर द्वारा neurotransmitter के अवरोध के बाद neuronal उत्तेजना 7 रोक दिया गया है के लिए जिम्मेदार ठहराया है. हालांकि, शिखर क्षय करने के लिए अवरोध सीमित नहीं है, प्रसार और चयापचय के रूप में भी वर्तमान में कमी के लिए योगदान. यह माने किया गया है कि विद्युत रासायनिक माप के समय के पैमाने के बाद से सेकंड के एक मामले, FSCV भी contributio को मापने के लिए तेजी से है7 चयापचय से एनएस. इन वर्तमान समय बनाम निशान में y-अक्ष (सुक्ष्ममापी) एकाग्रता अंशांकन के बाद प्रयोग कारक का उपयोग करने के लिए बदल जाती है. चित्रा 1A के लिए इनसेट संबंधित पृष्ठभूमि वर्तमान बनाम समय निशान के लिए चक्रीय voltammograms घटाया है. (X-अक्ष) इलेक्ट्रोड के लिए लागू संभावित के खिलाफ मापा वर्तमान (y-अक्ष) साजिश रचने, डोपामाइन रासायनिक 0.6 वी पर एक मनाया ऑक्सीकरण चोटी और dopamine का ortho quinone की एक इसी कमी चोटी पर मनाया के साथ की पहचान की है - एक संदर्भ / एजी AgCl इलेक्ट्रोड बनाम 0.2 वी. इस डेटा के तीसरे प्रतिनिधित्व एक तीन आयामी छद्म रंग (चित्रा 1 बी) साजिश के लिए एक एकल साजिश के रूप में दोनों वर्तमान बनाम समय निशान और चक्रीय voltammogram से जानकारी के संयोजन का उपयोग करता है. प्रतिनिधि साजिश छद्म रंग में, समय x-अक्ष के साथ सेकंड में प्लॉट किए जाते है, microelectrode काम कर कार्बन फाइबर के लिए लागू वोल्टेज y-अक्ष के साथ रेखांकन है, और वर्तमान fal के रूप में प्रतिनिधित्व किया हैz-अक्ष से रंग के साथ. कार्बन फाइबर microelectrodes (~ व्यास में 7 सुक्ष्ममापी) छोटे आकार के कारण, विद्युत प्रेरित डोपामाइन गतिशीलता striatum (, चित्रा 2 CPU बनाम एनएसी कोर बनाम एनएसी खोल) की असतत संरचनात्मक क्षेत्रों में पता लगाया जा सकता है.

Striatal राज्याभिषेक स्लाइस का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि यह डोपामाइन सेल निकायों से योगदान समाप्त, और presynaptic dopamine गतिशीलता की जांच के लिए अनुमति देता है. Dopamine के रिलीज और तेज के presynaptic नियंत्रण कड़ाई से dopamine autoreceptor या ट्रांसपोर्टर कार्यों तक सीमित नहीं है के रूप में दूसरों को 16, 17 से पता चला है . अन्य neurotransmitter प्रणाली के Heteroreceptors भी डोपामाइन 18 गतिशीलता, 19 मिलाना. प्रतिनिधि वर्तमान बनाम समय चित्रा 3A में दिखाया निशान दिखाना है कि मनाया जब स्लाइस 30 मिनट के लिए 1 सुक्ष्ममापी (D2/D3 रिसेप्टर agonist) quinpirole, विद्युत पैदा dopamine जारी में एक कमी के साथ व्यवहार कर रहे हैं. दूसरी ओर, जब एक सब्सट्रेटके लिए methamphetamine जैसे dopamine ट्रांसपोर्टर, 30 मिनट के लिए टुकड़ा से अधिक perfused है, dopamine के रिलीज में कोई फर्क नहीं (3B चित्रा) मनाया जाता है. चोटी क्षय सही है, जो आमतौर पर dopamine ट्रांसपोर्टर कैनेटीक्स में परिवर्तन (कश्मीर मीटर) 3 के साथ जुड़ा हुआ है के लिए स्थानांतरित कर दिया है. अंत में, चित्रा 3C वर्तमान बनाम समय का पता लगाने के एक प्रतिनिधि ट्रेस एक बार टुकड़ा एक 100 मस्तिष्क व्युत्पन्न एनजी / एमएल neurotrophic कारक (BDNF) समाधान है, जो dopamine जारी गतिशीलता 20, 21 प्रभावित किया गया धारणा है में नहाया है . इस प्रतिनिधि ट्रेस से यह देखा जा सकता है कि BDNF विद्युत पैदा dopamine जारी बढ़ाने की क्षमता है सकते हैं. साथ में ले ली, इन औषधीय उपचार FSCV की उपयोगिता पर जोर striatum भीतर dopamine गतिशीलता जांच.

मस्तिष्क स्लाइसें का उपयोग करने के लिए FSCV द्वारा presynaptic डोपामाइन की गतिशीलता की जांच के प्राथमिक सीमा यह है कि एक अक्षुण्ण मस्तिष्क से neurocircuitry खो दिया है.टुकड़ा FSCV के साथ यह अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से न्यूरोट्रांसमीटर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए असंभव है, यह जांच की जा रही क्षेत्र की कार्यक्षमता पर मुश्किल इन पद्धतियों के योगदान को समझने के लिए (जैसे striatum) या गैर उत्तेजित dopamine के स्तर का मूल्यांकन कर रही है. 24 - हालांकि, FSCV में हाल ही में तकनीकी प्रगति औषधीय हेरफेर स्वयं प्रशासन, या 22 नवीनता के जवाब में स्वतंत्र रूप से चूहों बढ़ने में dopamine क्षणिक माप (के साथ और बिजली की उत्तेजना के बिना) के लिए अनुमति दी गई है. कुल मिलाकर, टुकड़ा FSCV presynaptic डोपामाइन गतिशीलता पर बहुमूल्य जानकारी प्रदान करता है, और जैसे microdialysis, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, और / या स्वतंत्र रूप से FSCV चलती पूरक neurochemical तकनीक टुकड़ा FSCV परिणाम युग्मन मस्तिष्क में एक neurotransmitter कामकाज की और अधिक व्यापक दृश्य प्रदान करता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 dopamin विद्युत पैदा.ई रिलीज C57Bl/6J चूहों से पृष्ठीय CPU स्लाइस में FSCV निम्नलिखित एकल पल्स उत्तेजना का उपयोग करके मापा. (ए) एकाग्रता बनाम समय का पता लगाने में जो dopamine जारी एक नाड़ी (लाल तीर) द्वारा पैदा किया गया था. एकल तारांकन कारक है कि एकाग्रता, जो मुख्य रूप से dopamine जारी है में वृद्धि करने के लिए योगदान का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन तेज और प्रसार भी योगदान. डबल तारांकन चोटी संकेत आधारभूत लौटने के मुख्य कारण तेज करने के लिए है लेकिन यह भी प्रसार योगदान देता है, का प्रतिनिधित्व करता है. इनसेट इसी चक्रीय voltammograms प्रदर्शित करता है. (बी) के प्रतिनिधि पृष्ठीय CPU प्रदर्शन (x-अक्ष) समय से रंग भूखंडों, एजी / AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड (y-अक्ष) बनाम कार्बन फाइबर microelectrode करने की क्षमता है, और छद्म रंग में वर्तमान लागू.

चित्रा 2
चित्रा Dopamine 2. एक एकल एनएसी कोर में बिजली की उत्तेजना पल्स (लाल तीर द्वारा संकेत) द्वारा पैदा की रिहाईC57Bl/6J चूहों से खोल. (ए और सी) बनाम समय और एनएसी कोर और खोल से निशान उनके इसी चक्रीय voltammograms (इनसेट) एकाग्रता. (बी और डी) जैसा कि पहले वर्णित है, एनएसी कोर और खोल से प्रतिनिधि रंग भूखंडों.

चित्रा 3
चित्रा 3 टुकड़ा के बाद प्रतिनिधि के निशान 30 मिनट के लिए एक औषधीय एजेंट के साथ इलाज किया गया था, सभी मामलों में, एक भी नाड़ी CPU में dopamine जारी आह्वान किया था . (ए) डोपामाइन D2 रिसेप्टर agonist के आवेदन, quinpirole लाल (ट्रेस) पूर्व उपचार (काला ट्रेस) की तुलना में. (बी) Methamphetamine छिड़काव (बैंगनी ट्रेस) पूर्व उपचार (काला ट्रेस) की तुलना में. (सी) मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक की क्षमता dopamine गतिशीलता को प्रभावित करने के लिए पूर्व उपचार (काला ट्रेस) की तुलना में (नीला ट्रेस).

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल को दर्शाता है कैसे तैयार और FSCV प्रयोगों के लिए माउस राज्याभिषेक मस्तिष्क स्लाइसें का उपयोग. 11 - हालांकि इस पद्धति डोपामाइन गतिशीलता को प्राप्त करने और मापने के लिए विशिष्ट है, जैसे अन्य न्यूरोट्रांसमीटर adenosine, हाइड्रोजन पेरोक्साइड, norepinephrine और serotonin FSCV 3, 8 के साथ किया गया है या इन विट्रो में vivo में निगरानी. FSCV काम कर रहे 3 इलेक्ट्रोड, 11 के लिए लागू तरंग के सरल संशोधनों द्वारा इन अन्य neurochemicals के कुछ की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चूंकि इन neurochemical प्रजातियों के इसी तरह के कई ऑक्सीकरण क्षमता है, चक्रीय उत्पन्न voltammograms प्रत्येक oxidizable प्रजातियों के लिए एक अद्वितीय रासायनिक अंगुलांक, जो रासायनिक पहचान की अनुमति देता है प्रदान करते हैं. इसके अलावा, FSCV विभिन्न प्रजातियों में इस्तेमाल किया गया है, फल मक्खियों से गैर मानव प्राइमेट के लिए, इन मॉडल 12 जीवों में neurotransmission की एक बेहतर समझ पाने - 15 . एक प्राथमिक कारण है कि FSCV ख हैऐसी प्रजातियों की एक किस्म में इस्तेमाल किया een कार्बन फाइबर microelectrodes, व्यास में आम तौर पर कम से कम 7 सुक्ष्ममापी के छोटे व्यास के कारण है. नतीजतन, इन microelectrodes यह बहुत छोटे वातावरण से संभव ऊतक का नमूना करने के लिए, के रूप में फल मक्खी मस्तिष्क (NL) के मामले में, या बड़े 12 प्रजातियों में असतत उप संरचनात्मक खोल बनाम एनएसी कोर की तरह क्षेत्रों से भेदभाव -14.

अंत में, परिणाम यहाँ प्रस्तुत दिखाना है कि टुकड़ा voltammetry एक अमूल्य विद्युत उपकरण माउस striatum में presynaptic डोपामाइन गतिशीलता जांच है. 'एक सामान्य या स्वस्थ' नियंत्रण से एक मस्तिष्क टुकड़ा और dopamine के रिलीज और तेज के मापदंडों विशेषताएँ करने की क्षमता से अधिक औषधीय एजेंटों perfusing प्रतिनिधि डेटा पर ध्यान केंद्रित है. इसके अलावा, FSCV विद्युत उत्तेजित रिलीज में मतभेद और अपने दम पर या pharmac के बाद तेज मापदंडों आनुवंशिक रूप से संशोधित या इलाज पशुओं में मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैological उपचार 15 - 16. स्लाइस FSCV असतत संरचनात्मक क्षेत्रों है कि मिसे के एक timescale पर होते भीतर dopamine neurotransmission गतिशीलता की जांच के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है. कुल मिलाकर, FSCV की विद्युत तकनीक अन्य neurochemical तकनीक की तुलना में दोनों बढ़ाया स्थानिक और लौकिक संकल्प प्रदान करता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

शराब सेवन और शराब पर राष्ट्रीय संस्थान (ए.ए., 016,967 और AA016967-01S1, NIAAA टीएएम) द्वारा प्रदान की अनुदान, वेन स्टेट यूनिवर्सिटी धन शुरू, और वेन स्टेट यूनिवर्सिटी अनुसंधान अनुदान कार्यक्रम. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और NIAAA या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium Chloride Fisher Scientific 7447407
Sodium chloride EMD Millipore 7647145
Magnesium chloride Fisher Scientific 7791186
Calcium chloride Fisher Scientific 10035048
Sodium bicarbonate EMD Millipore 144558
Sodium phosphate,Dibasic EMD Millipore 7558794
D-glucose Fisher Scientific 50997
Ascorbic acid Fisher Scientific 50817
Sucrose Fisher Scientific 57501
Carbon fiber Goodfellow
Glass capillary A-M Systems 602000
Silver wire A-M Systems 787000
Tungsten stimulating electrode Plastics One
Platinum wire
Lead wire Squires Electronics, Cornelius, OR
Loctite 404 instant adhesive Hankal Corp.
Razor blade World Precision Instruments, Inc.
BD Spinal needle BD Biosciences REF 405234
Surgical Blade Feather Safety Razor Co, Ltd.
TH software ESA Inc.,Chelmsford, MA
Submersion recording chamber Custom Scientific
Neorolog stimulus isolator Digitimer Ltd. NL800A
Automatic temperature controller Warner Instruments
Microscope (SZX7) Olympus Corporation
Microscope Fisher Scientific
Vibratome 3000 sectioning system St. Louis , MO.
Perfusion pump Watson-Marlow Pumps Group H110708
Micropipette puller Narishige International
ChemClamp potentiostat Dagan Corporations

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References

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तंत्रिका विज्ञान 59 अंक पूंछवाला putamen नाभिक accumbens microelectrodes dopamine ट्रांसपोर्टर dopamine जारी
फास्ट स्कैन चक्रीय Voltammetry के साथ Striatal मस्तिष्क स्लाइसें में presynaptic Dopamine गतिशीलता
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Maina, F. K., Khalid, M., Apawu, A.… More

Maina, F. K., Khalid, M., Apawu, A. K., Mathews, T. A. Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry. J. Vis. Exp. (59), e3464, doi:10.3791/3464 (2012).

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