La medición de γHV68 infección en los ratones

Summary

γ-herpesvirus (γ-VS) establecer la persistencia de toda la vida en su huésped. La infección de ratones con γ-HV68 ofrece un manejable de forma genética

Abstract

γ-herpesvirus (γ-VS) se caracterizan por su capacidad para establecer infecciones latentes de las células linfoides ^1. El rango de hospedadores de los derechos humanos γ-VS, como EBV y HVSK, ha obstaculizado seriamente los estudios detallados patógenos. Murinas herpesvirus γ-68 (γHV68) acciones amplias similitudes genéticas y biológicas con humanos γ-VS y es un patógeno natural de los roedores múridos ^2. Como tal, la evaluación de γHV68 infección de ratones puras cepas en diferentes etapas de la infección viral constituye un modelo importante para la comprensión del ciclo de vida viral y patogenia en γ-VS infección.

Tras la inoculación intranasal, γHV68 infección da lugar a una viremia aguda en el pulmón que luego resuelve en una infección latente de esplenocitos y otras células, que puede ser reactivado durante la vida del huésped ^3,4. En este protocolo, se describe cómo utilizar la placa de ensayo para evaluartítulo de s virus infeccioso en el pulmón homogeneizado en monocapas de células Vero en la primera etapa (5-7 días) después de la infección intranasal (dpi). Mientras que la infección aguda es en gran parte aclaró 2-3 postinfección semana, una infección latente de γHV68 se establece alrededor de 14 dpi y mantenido posteriormente en el bazo de los ratones. La infección latente por lo general afecta a una población muy pequeña de células en los tejidos infectados, por el cual el virus permanece latente y se apaga la mayor parte de su expresión génica. Esplenocitos latente infectadas por el virus de reactivar de manera espontánea en explante en cultivo de tejidos, que puede ser recapitulado en un centro de infecciosos (IC) de ensayo para determinar la carga viral latente. A fin de estimar la cantidad de copias del genoma viral en la forma aguda y / o tejidos con infección latente, la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se utiliza para su máxima sensibilidad y precisión. El análisis combinado de los resultados de ensayo qPCR y la placa, y / o ensayo de IC se muestran los perfiles de espacio-temporal de los virusla replicación y la infectividad in vivo.

Protocol

El siguiente protocolo se describe el estudio de los títulos de virus y la carga viral del genoma en el ciclo de infección lítica y latente de γHV68 en ratones, lo que teóricamente se puede utilizar para evaluar la infección por virus que comparten el estilo de vida similar a la de γHV68.

1. La amplificación de γHV68

1. Descongelar un vial congelado de γHV68 de 37 ° C baño de agua.
2. Añadir inóculo viral NIH3T12 o cultivo de células 3T3 (~ 50% de confluencia) en platos de 10 cm y la cultura de las células infectadas a 37 ° C en 5% de CO _2.
3. Examinar la cultura mediante microscopía de efecto citopático (ECP) y recoger los medios de comunicación en un momento en que más del 80% de las células muestran CPE 4 ~ 5 días después de la infección. Para maximizar el rendimiento de los virus, el cultivo de células infectadas pueden ser congelados y descongelados dos veces para liberar a todos los asociados a células γHV68.
4. Centrifugar los medios de comunicación recogieron a 1000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente (TA) para eliminar los restos celulares.
5. Transfiera cuidadosamente los sobrenadantes a nuevos tubos (tubo de alta velocidad de centrifugado) sin tocar los restos celulares en la parte inferior.
6. De alta velocidad se centrifuga a 12.000 rpm (para Sorvall SA-600) a 4 ° C durante por lo menos 1,5 horas de concentración de partículas virales.
7. Descartar el sobrenadante en una solución de lejía 10γ y cuidadosamente vuelva a suspender el pellet (virus y restos celulares residual) con 1 ml de suero libre de DMEM. Transferencia de la re-suspensión de pellets en un 1,5 ml micro-tubo de centrifugadora y mezclar adecuadamente por agitación.
8. Centrifugar durante 2 minutos a velocidad máxima para eliminar los restos celulares residual y la transferencia del sobrenadante (stock de virus) a un nuevo tubo. Este es el balance definitivo de la infección viral. El título de la acción del virus se determina mediante el ensayo de la placa (ver más abajo).

2. La infección intranasal de ratones con γHV68

1. Infectar a los ratones en unas 6 semanas de edad con 1.000 ~ 5.000 unidades formadoras de placas (UFP) de ratones por γHV68.
2. Anestesiarratones mediante la inyección de ketamina / xilazina (60 l / ratón de una mezcla de 80 mg / ml de ketamina y xilacina 12 mg / ml) en la cavidad peritoneal. Monitor de anestesia pellizcando la punta ratones. Por lo general toma min ~ 10.5. Si los ratones no son totalmente anestesiado, se estornudar el virus.
3. Cuando el ratón está totalmente anestesiado, el uso de una pipeta para inocular ~ 30 l de PBS que contenía γHV68 (15 l en cada fosa nasal) a ratones gota a gota, lentamente pero sin pausa. Asegúrese de que el ratón es de hecho la inhalación de las gotas, sin tratar de formar burbujas.
4. Permitir el ratón para recuperar durante 10-15 minutos y vigilar el bienestar de los ratones (por ejemplo, la conciencia, la respiración, etc) antes de regresar a la jaula. Los animales se comprueban todos los días por enfermedad y la adecuación de los alimentos, el agua y las condiciones de camas. Si los signos clínicos de la enfermedad, el dolor o la angustia desarrollo, el diagnóstico de rutina para determinar la etiología se llevará a cabo. Los animales que pierden más del 20% de su peso corporal se registró la pérdida de peso máximoy la eutanasia. La decisión final para llevar a cabo la eutanasia está en la discreción del veterinario clínico y tras consultar con el investigador principal.

3. Placa de ensayo para determinar el título del virus en los pulmones con infección aguda

1. Los títulos de infectividad del virus se determina por la formación de placas en monocapas de células Vero.
2. Células Vero se siembran en 2.5x10 ⁴ células / pocillo en placas de 12 pocillos, el día antes de la placa de ensayo. Las células deben estar uniformemente distribuida y la densidad celular debe llegar a 30 - 40% en el día de la placa de ensayo.
3. Prepare un 0,5% (w / v) de metilcelulosa (MC) medio de recubrimiento (Tabla 1).
4. Sacrificio γHV68 ratones infectados 5-7 días después de la infección intranasal para determinar la fase aguda de los títulos de virus en los pulmones. Para la eutanasia Ketamina HCl (80-100 mg / kg SC, IM, IP) será administrado IM seguido por sobredosis intravenosa de pentobarbital Na (30-50 mg / kg IP). Este método es aprobado por tque American Veterinary Medical Association.
5. Cosecha de los pulmones y enjuagar dos veces con 1 x PBS para eliminar las células de la sangre. Recoge por un lado de los pulmones en un ml de helado de medio completo DMEM y mantener en hielo. Congelar rápidamente al otro lado de los pulmones y almacenar a -80 ° C para el examen de carga viral del ADN en los pulmones por qPCR (ver más abajo).
6. Use un homogeneizador de tejidos a fin de homogeneizar los tejidos del pulmón a la velocidad máxima durante 1 segundo, congelación y la descongelación tres veces. Lave el homogeneizador con etanol al 70% en cada paso cuando se cambia la muestra.
7. Centrífuga el tejido homogeneizado a 3.000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante y la transferencia de nuevos tubos de ensayo en placa.
8. Prepare diluciones seriadas (generalmente de 10 ° a 10 ^-8) de las muestras de pulmón homogeneizado en 1,5 ml micro-tubos de centrífuga con DMEM normal por vórtice. Rellenar el número apropiado de tubos con 540 l DMEM y diluir 60 homogeneizado l en el primer tubo. Transferencia de 60 l del primer tubo ino el siguiente, y así sucesivamente.
9. Aspirar los medios de comunicación de las monocapas preparado Vero en placas de 12 pocillos y carga de 200 l / homogeneizado bien diluido en serie que contienen virus infecciosos en un orden inverso (de 10 ^-8 a 10 °). Use dos pocillos para cada titulación (por duplicado).
10. Se incuban las células Vero con el virus del inóculo de 1 hora a 37 ° C. Remover con suavidad las placas de cada 15 minutos para distribuir uniformemente el virus a través de la monocapa.
11. Eliminar el inóculo y reemplazarlo con 2 ml / pocillo de medio de recubrimiento (Tabla 1). Las placas se incuban durante una semana a 37 ° C.
12. Quitar medio de recubrimiento (no necesita ser completa) y sustituirlo por la solución / medio de tinción de la placa de ensayo (Tabla 1) y se incuba durante al menos 1 hora a temperatura ambiente.
13. Cuando las placas se secan, contar el número de placas bien aisladas en cada dilución. Para minimizar el error, sólo los pozos que contienen entre 10 y 100 placas se cuentan.
14. Calcular el título del virus con los siguienala fórmula: título (UFP / ml) = [(número de placas / y) / (volumen de inóculo / y)] x factor de dilución.

4. Ensayo Centro infecciosas para determinar la carga del virus en los esplenocitos con infección latente

1. Carga viral latente está determinado por el centro infecciosas (IC) de ensayo sobre la monocapa de células Vero. El día antes de las células IC ensayo de semillas, Vero en placas de 6 pocillos (1 -. 2.5 X 10 ⁵ células / Por lo general, el uso de 11 pozos por muestra bazo, 10 pozos serán utilizados para la suspensión diluida en serie esplenocitos y un bien para la prueba una reactivación espontánea del virus después de ciclos hielo-deshielo.
2. Sacrificio de los ratones infectados después de la latencia se establece (12 - 14 días después de la infección). Cosecha del bazo del ratón y la piscina que en un ml de DMEM frío.
3. Disociación mecánica de bazo de ratón. La transferencia de los bazos de ratón recién aisladas en una placa de 10 cm y añadir 10 ml de medio deseado, tal como DMEM con FBS al 2%. Húmedo dos helados de gama de vidrio microscOpe diapositivas con helado de mediano plazo. Colocar el bazo en el lado poroso de una diapositiva y nick de la cápsula con el borde del extremo esmerilado de la otra guía. Mecánicamente se disocian del bazo entre dos diapositivas hasta que todos los grupos de color rojo son triturados (también eliminar las partículas de grasa si lo hay).
4. Lavar los portaobjetos con DMEM para recuperar las células restantes en los dos diapositivas.
5. Transferir la suspensión de todo el tejido suavemente a través de un colador de células (40 micras de malla de nylon) en un cónico de 50 ml con tapón de rosca del tubo. Lavar el plato de 10 cm que contiene los homogeneizados de bazo con 10 ml de PBS y la transferencia mientras que los filtros.
6. Se centrifuga la suspensión celular solo 10 minutos a 375 xg y desechar el sobrenadante. Flick los gránulos de las células para romper existentes grupos de células. Añadir 5 ml de tampón ACK (Tabla 1) para lisar los glóbulos rojos. Incubar 5 min y se centrifuga de nuevo a 375 x g.
7. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender las pastillas, a fondo, pero suavemente, en PBS con FBS al 2%. Mantener a las células a 4 ° C. Use una pipeta paraeliminar los residuos, en su caso. Recuento de células viables mediante un contador de células automático (Bio-Rad).
8. Centrifugar el esplenocitos PBS-resuspendido en 375 g durante 4 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en DMEM 4 ml completa (2 x 1 ml se utilizará para el ensayo de IC de la suspensión original, 0,6 ml de serie utilizado para la dilución de cinco veces en el ensayo de IC, 0,4 ml de la preparación de ADN viral y qPCR, y 1 ml de suspensión se utilizará para evaluar una reactivación espontánea del virus latente después de tres ciclos de congelación y descongelación)
9. Prepara serie de cinco diluciones (es decir, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) de la suspensión de esplenocitos en los duplicados. Rellenar los tubos de 15 ml cónicos con 2,4 ml de DMEM y se diluye la suspensión de esplenocitos 600 l en el primer tubo y mezclar bien. Transferencia de 600 l de tubo anterior en el tubo que viene, etc No vórtice!
10. Aspirar el medio de los preparados de 6 y monocapa de células Vero. Semillas de 1 ml de esplenocitos en serie diluido en las células Vero con cada dilución DUPLicated (10 pozos se utilizará para 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 diluciones).
11. Incubar las placas 8-12 horas a 37 ° C y 5% de CO _2. No exceda las 24 horas. Aspirar la suspensión de esplenocitos cabeza de serie y la carga de 4 ml superposición de los medios de comunicación (Tabla 1) a cada pocillo. Incubar durante 6 días.
12. Determinar los niveles de los centros de bazo infecciosas mediante la tinción de las placas con un 0,2% (w / v) de cristal violeta, como se muestra en la placa de ensayo.

5. La cuantificación del genoma viral

1. Extraer el ADN genómico total de los tejidos γHV68 infectados, como el pulmón y el bazo muestras en este experimento. Utilice la sangre y DNeasy Tissue Kit (Qiagen), siguiendo el protocolo del fabricante.
2. Determinar la concentración de ADN de cada muestra para asegurar la misma cantidad de ADN se utiliza para el ensayo qPCR. El diseño del virus de primers específicos (~ 200 pb de amplificación es el preferido para un ensayo qPCR). Se utilizó el γHV68 ORF56 primers específicos (cebador: 5 y prime; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 'cebador inverso: 5'-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3') para este ensayo y la actina β-primers (cebador: 5'-cacccacactgtggcccatcat-3 'cebador inverso: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3') como un control de la reacción de PCR cuantitativa.
3. Mezclar la muestra de ADN (100 - 500 ng es bueno) y cebadores apropiados con 2 x SYBR maestro de la mezcla (Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix). El uso del Bio-Rad en tiempo real del sistema PCR para cuantificar la carga viral en los tejidos infectados. Realizar PCR en las siguientes condiciones: 95 ° C durante 15 min y 45 ciclos de 95 ° C durante 30 min, 60 ° C durante 30 min y 72 ° C durante 30 minutos, seguido por análisis de las curvas de fusión, tanto para el virus y actina amplificados.
4. Para realizar una curva estándar para la cuantificación de genomas virales, diluir en serie de cantidades conocidas de un ADN γHV68 bácmido con el ADN genómico aislado de las células no infectadas. Ejecutar qPCR en paralelo con el ADN recuperado de la infecciónTed tejidos utilizando los mismos conjuntos de cebadores específicos del virus.
5. Presente la carga del genoma viral en los tejidos como el número de copias de ADN viral por unidad (por ejemplo, 100 ng o 500 ng) de ADN genómico tras la normalización de actina.

6. Los resultados representativos:

La Figura 1 muestra el esquema general de los experimentos para la medición de γHV68 infección en ratones in vivo. Los resultados representativos de los títulos de virus en los pulmones durante la infección aguda de γHV68, según lo determinado por la placa de ensayo, se muestra en la Figura 2A. Una cepa mutante de γHV68 que contiene no funcional viral Bcl-2 (vBcl-2) replica a niveles comparables a los de tipo salvaje γHV68 en los pulmones después de 7 días de la infección intranasal de ratones Balb / c (6-7 ratones por grupo). No se observaron diferencias estadísticamente significativas en los títulos de los pulmones de los virus fueron detectados entre los dos grupos. Estos datos indican que vBcl-2 no es un factor crucial para la infección aguda de γHV68 enratones. Sin embargo, después de la infección en un 28 días, el título de vBcl-2 del virus mutante en el bazo caído 6 - a 10 - veces en comparación con el WT, según lo medido por el ensayo de centro infecciosas (Figura 2B), lo que sugiere que la vBcl-2 mutante virus γHV68 fallas en el mantenimiento de la latencia del bazo después de la infección. De acuerdo con los títulos de centro infecciosa reduce la carga viral del genoma del virus mutante vBcl-2 se redujo drásticamente en comparación con la de los virus de PESO en el día 28 en repetidos experimentos, como se muestra en la Figura 2C. La estrecha correlación entre las cargas del genoma viral y la frecuencia de latente HV68vBcl-2 ex vivo virus mutante en la etapa de reactivación latente de la infección destaca un defecto de la latencia de la infección por el virus mutante.

Figura 1. Esquema para la medición de γHV68 infección en los ratones a través de la formación de placa, un centro de infecciosos, y el ensayo qPCRs.

Figura 2. Infección lítica y latente de la WT y mutantes γHV68 virus in vivo. La replicación aguda (A) de la WT y mutantes vBcl-2 γHV68 virus en los pulmones de los ratones Balb / c de 7 dpi (días después de la infección) se determinó por ensayo en placa. (B y C) del bazo centros infecciosas (B) y la carga del genoma viral (C) en el bazo de los ratones infectados se midieron a los 28 dpi mediante el ensayo de centro infecciosas y qPCR, respectivamente. Las líneas rojas, los promedios de los valores indicados. ns, no significativo.

Discussion

γHV68 ha sido ampliamente utilizada como modelo para entender la patogénesis de los derechos humanos γ-VS ^2,4,5. En este protocolo, se describen tres métodos de rutina utilizados, incluyendo la placa de ensayo para el título de virus infecciosos, ensayo de IC de la carga viral latente, y qPCR para la carga del genoma viral, para evaluar la infección aguda y latente de γHV68 después de la inoculación intranasal en ratones.

La placa de ensayo se ha utilizado ampliamente para determinar el título del virus en las células o tejidos infectados, pero las condiciones óptimas varían para el virus que se utiliza. Esto es así porque la capacidad de los diferentes virus para producir placas (lesiones contable) en una monocapa de células es diferente. γHV68 normalmente produce placas evidentes sobre la monocapa de células Vero mono o células de ratón en cultivo, tales como NIH3T12 o 6 3T3, - 7 días después de la infección. En particular, la sensibilidad celular a la infección viral disminuye a medida que el monocapa o se sobrecarga Por lo tanto,suelen utilizar menos del 50% de confluencia de las células Vero de la placa de ensayo, que, en nuestra experiencia, demuestra los mejores resultados para γHV68. Además, una sola capa uniformemente distribuida y recién hecho, es muy recomendable para la exactitud del conteo placa. Al tiempo que la serie de dilución de las muestras de virus, se debe tener cuidado para evitar las burbujas y puntas de pipeta debe ser cambiado entre cada titulación. Para las muestras de virus de alta titulación, de 10 diluciones se recomienda, en caso contrario, 2 - a 5 veces diluciones en serie se utilizan.

A diferencia de la infección aguda en la que puede ser el virus infeccioso directamente ensayada por la capacidad de formación de placas, latentemente infectadas con tejidos / muestras de γ-VS no suelen contener virus detectable preformados infecciosas, en cambio, el ADN viral se mantiene como un episoma circular con unos pocos genes expresado ^6,7. En este caso, la carga de latencia viral puede ser determinada por la frecuencia de reactivación ex vivo de que el virus de VITRo explantes de células latentes infectadas en una cultura permisiva indicador de la célula (por ejemplo, las células Vero) ^8. Con este fin, la suspensión de células individuales de los tejidos infectados se prepara, se cuentan y chapada en monocapas de células susceptibles, que luego se cubrió con el medio de la placa de ensayo. En este protocolo, hemos descrito la forma de preparar suspensiones de células individuales de bazo para el ensayo de IC para medir la cantidad de virus latente que tiene la habilidad de reactivar por el bazo o la población de esplenocitos por ^4. Dado que sólo una pequeña población de esplenocitos es una infección latente, que suelen preparar en serie de bajo diluciones de la suspensión de esplenocitos para las pruebas de títulos infecciosos. Extrema precaución se debe tomar durante todo el procedimiento para evitar que las células duras pipeta o vortex. Es importante tener en cuenta que las células B del bazo explantados en general, muestran la escasa viabilidad ^9, lo que podría afectar la eficiencia de la reactivación ex vivo. Cualquier gen que mejora la supervivencia de Latenlas células infectadas TLY indirectamente podría facilitar la eficiencia de la reactivación ex vivo del virus.

En comparación con los ensayos de formación de placas y la IC, qPCR proporciona un medio eficaz para cuantificar con precisión linfocítica γ-VS en los ratones infectados _10. Es especialmente útil para un virus con mala formación de placas debido a su capacidad de citotoxicidad mínima para las células Vero u otros indicadores, y se puede aplicar tanto en forma aguda y muestras de una infección crónica. Una curva estándar es necesario e importante para cuantificar con precisión los genomas virales. Hemos desarrollado γHV68 curvas estándar basado en la amplificación del gen ORF56, utilizando un clon que contiene el genoma bácmido γHV68 ^8. qPCR reacción es extremadamente sensible ser capaz de detectar incluso algunas copias de ADN viral por reacción de PCR cuantitativa, más allá de los límites de la placa de ensayo. Precauciones sin embargo debe ser puesto en marcha para evitar la contaminación cruzada entre las muestras, mientras que entre uninfected muestras que sean necesarias controles negativos para cada reacción. La especificidad de la reacción de qPCR puede ser un problema especialmente grave para las muestras de tejido infectado, ya que gran cantidad de ADN celular pueden afectar a la señal de virus específicos de amplificación. Sin embargo, esto puede ser detectada por análisis de la curva de fusión de los productos amplificados inespecíficos. En infectados de forma natural las poblaciones de esplenocitos, la frecuencia de células γHV68 de soporte puede ser muy baja. En este escenario, como complemento al análisis qPCR utilizando ADN cuasiespecies, limitar la dilución PCR (LD-PCR) ofrece una ventaja alternativa para evaluar la frecuencia de los virus teniendo el genoma de las células ^11,12. En pocas palabras, γ-VS-linfocitos infectados se diluyen en serie. ADN extraído de estas células se va a utilizar para un ensayo de PCR anidada sensible, que puede detectar la presencia de una sola copia de ADN viral en muestras individuales. Un análisis combinado de dilución limitante y qPCR se revelan tanto la frecuencia de células con infección latente y the latente de la carga viral del ADN.

En particular, el ensayo de IC no puede ser utilizado como un método independiente para medir la carga viral latente, debido al hecho de que no distingue entre la reducción de cargas viral latente frente a un fracaso del virus latente en sí para la reactivación. Como medida adicional de latencia viral, qPCR se utiliza para evaluar cuantitativamente las copias del genoma viral en los tejidos infectados. Se observó una correlación entre la disminución de las cargas del genoma viral y el título de centro infecciosas sugieren un defecto en la latencia del virus. Por el contrario, una disparidad entre las altas cargas del genoma viral y el título viral latente bajo sostienen que aunque el virus es capaz de mantener una reserva latente de ADN viral, no es capaz de reactivar de manera eficiente de latencia.

En conclusión, los métodos descritos en este protocolo también son de aplicación general a otros herpesvirus que γHV68, para lo cual la célula objetivo y tipos de secuencias genómicas víricas están disponibles y permiten ªe inequívoca de la evaluación del ciclo de vida distinto en vivo. También se puede utilizar para hacer frente a la función biológica de factores específicos de virulencia en el contexto de la infección del ratón. Por ejemplo, mediante la comparación de la replicación viral de diferentes Bcl-2 mutante γHV68 con la de tipo salvaje γHV68, nuestro último trabajo ⁸ nos permite determinar que la función de vBcl-2 (por ejemplo, la apoptosis, autofagia, o ambos) contribuye a la de vivo el comportamiento de este virus en la infección aguda y crónica en ratones. Por lo tanto, también representan una herramienta importante para analizar las interacciones virus-huésped durante la infección.