Misura della γHV68 infezione nei topi

Summary

Herpesvirus-γ (γ-HVS) stabilisce per tutta la vita persistenza nel loro ospite. L'infezione di topi con γ-HV68 offre una geneticamente trattabili

Abstract

Herpesvirus-γ (γ-HVS) si distinguono per la loro capacità di stabilire infezioni latenti di cellule linfoidi ^1. La gamma ristretta di ospitare umano γ-HVS, come EBV e KSHV, ha gravemente ostacolato studi dettagliati patogeni. Murino γ-herpesvirus 68 (γHV68) azioni estese somiglianze genetiche e biologiche umane con γ-HVS ed è un patogeno naturale di roditori murid ^2. Come tale, la valutazione di γHV68 infezione ceppi di topi inbred a diversi stadi di infezione virale fornisce un modello importante per la comprensione del ciclo di vita virale e la patogenesi durante γ-HVS infezione.

Su inoculazione intranasale, γHV68 risultati infezione in viremia acuta nel polmone, che è poi risolto in una infezione latente di splenociti e di altre cellule, che può essere riattivato per tutta la vita dell'ospite ^3,4. In questo protocollo, descriveremo come utilizzare il test per valutare la placcatitolo s virus infettivo nel polmone omogenati su monostrati di cellule Vero in fase precoce (5 - 7 giorni) di post-infezione intranasale (dpi). Mentre l'infezione acuta è in gran parte cancellato 2-3 postinfection settimane, una infezione latente di γHV68 è stabilito circa 14 dpi e mantenuto in seguito nella milza dei topi. Infezione latente di solito colpisce una popolazione molto piccola di cellule nei tessuti infetti, per cui il virus rimane inattivo e si spegne la maggior parte della sua espressione genica. Splenociti latentemente infette spontaneamente riattivare virus su espianto in colture di tessuti, che può essere riassunta da un centro infettivi (IC) test per determinare la carica virale latente. Per ulteriori stimare la quantità di copie del genoma virale nel acuta e / o tessuti latentemente infette, quantitativa real-time PCR (qPCR) è usato per la sua massima sensibilità e precisione. L'analisi combinata dei risultati dei test qPCR e placca, e / o dosaggio IC rivelerà il profilo spazio-temporale del viralereplicazione e l'infettività in vivo.

Protocol

Il protocollo seguito descriverà i titoli di studio dei virus e dei carichi genoma virale nel ciclo di infezione litica e latente di γHV68 nei topi, che può teoricamente essere utilizzato per valutare l'infezione da virus che condividono lo stile di vita simile a quella di γHV68.

1. Amplificazione di γHV68

1. Scongelare una fiala congelata di γHV68 a bagnomaria a 37 ° C.
2. Aggiungi inoculums virale per NIH3T12 o colture di cellule 3T3 (~ 50% di confluenza) in 10 piatti cm e cultura le cellule infette a 37 ° C in 5% di CO _2.
3. Esaminare la cultura al microscopio l'effetto citopatico (CPE) e raccogliere i mezzi di comunicazione in un momento superiore al 80% delle cellule mostrano CPE 4 ~ 5 giorni dopo l'infezione. Per massimizzare il rendimento di virus, la coltura di cellule infettate possono essere congelati e scongelati-due volte di liberare tutti i cellulari associati γHV68.
4. Centrifugare i media raccolti a 1000 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) per rimuovere i detriti cellulari.
5. Trasferire accuratamente l'surnatanti di nuovi tubi ad alta velocità (provetta da centrifuga) senza toccare i detriti cellulari in basso.
6. Centrifuga ad alta velocità a 12.000 giri (per Sorvall SA-600) a 4 ° C per almeno 1,5 ore a concentrarsi particelle virali.
7. Eliminare il surnatante in una soluzione di candeggina 10γ e con attenzione risospendere il pellet (virus e detriti cellulari residua) con 1 ml di DMEM senza siero. Trasferire la ri-precipitato sospeso in un ml 1,5 micro-centrifuga tubo e mescolare bene nel vortex.
8. Centrifugare per 2 minuti alla massima velocità per rimuovere i detriti residui cellulari e trasferire il surnatante (stock virus) in una nuova provetta. Questo è lo stock finale per l'infezione virale. Il titolo dello stock del virus è determinato mediante test placca (vedi sotto).

2. L'infezione intranasale di topi con γHV68

1. Infettare topi a ~ 6 settimane di età con 1.000 ~ 5.000 unità formanti placca (PFU) di topi per γHV68.
2. Anestetizzaretopi mediante iniezione di ketamina / xylazina (60 microlitri / mouse da una miscela di 80 mg / ml di ketamina e 12 mg / ml xilazina) nella cavità peritoneale. Monitor anestesia da pizzicare la punta topi. Di solito ci vogliono 5-10 min ~. Se i topi non sono completamente anestetizzati, saranno starnuto il virus.
3. Quando il mouse è completamente anestetizzato, utilizzare una pipetta per inoculare ~ 30 ml di PBS contenente γHV68 (15 microlitri per ogni narice) a topi goccia a goccia lentamente ma costantemente. Assicurarsi che il mouse è davvero inalare le gocce senza cercare di formare bolle.
4. Lasciare il mouse per recuperare per 10-15 minuti e monitorare il benessere dei topi (es. coscienza, respirazione, ecc) prima di restituirli alla gabbia. Gli animali vengono controllati ogni giorno di malattia e l'adeguatezza di cibo, acqua, biancheria da letto e le condizioni. Se i segni clinici di malattia, dolore o angoscia sviluppare, diagnostica di routine per determinare l'eziologia sarà condotta. Gli animali che perdono più del 20% del loro peso corporeo verrà registrato per la perdita di peso massimoe eutanasia. La decisione finale di eseguire l'eutanasia è a discrezione del veterinario clinico ed è presa previa consultazione con il ricercatore principale.

3. La placca di analisi per determinare il titolo del virus nei polmoni con infezione acuta

1. I titoli di infettività del virus sono determinate dalla formazione di placca su monostrati di cellule Vero.
2. Cellule Vero sono seminate a 2.5x10 ⁴ cellule / pozzetto in 12 piastre a pozzetti del giorno prima analisi della placca. Le cellule devono essere distribuite uniformemente e la densità cellulare dovrebbe raggiungere il 30 - 40% nel giorno del test placca.
3. Preparare 0,5% (w / v) metilcellulosa (MC) mezzo di copertura (Tabella 1).
4. Sacrificio γHV68 topi infettati 5-7 giorni dopo l'infezione intranasale per determinare fase acuta titoli del virus nei polmoni. Per euthanization ketamina HCl (80-100 mg / kg SC, IM, IP) verranno amministrati IM seguita da sovradosaggio per via endovenosa di sodio pentobarbital (30-50 mg / kg IP). Questo metodo è approvato da t'American Veterinary Medical Association.
5. Raccogliere i polmoni e risciacquare due volte con 1 x PBS per rimuovere le cellule del sangue. Raccogliere un lato dei polmoni in 1 ml ghiacciata terreno completo DMEM e tenere sul ghiaccio. Rapidamente congelare l'altro lato dei polmoni e conservare a -80 ° C per l'esame dei carichi DNA virale nei polmoni da qPCR (vedi sotto).
6. Utilizzare un omogeneizzatore ad omogeneizzare il tessuto tessuti polmonari alla massima velocità per 1 secondo, gelo-disgelo e-tre volte. Lavare l'omogeneizzatore con etanolo al 70% ad ogni passo quando si cambia il campione.
7. Centrifugare il tessuto omogeneizzato a 3.000 giri per 10 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e trasferimento in nuovi tubi per il dosaggio della placca.
8. Preparare diluizioni seriali (di solito da 10 ° a 10 ^-8) dei campioni di polmone omogenato in 1,5 ml di micro-tubi con centrifuga pianura DMEM da vortice. Prefill il numero adeguato di appositi tubi con 540 microlitri DMEM e diluire 60 omogenato microlitri nel primo tubo. Trasferire 60 microlitri dal primo tubo inon il prossimo, e così via.
9. Aspirare multimediali dal monostrati preparato Vero nel 12-pozzetti e carico 200 l / omogenato e serialmente diluiti contenenti virus infettivi in un ordine inverso (da 10 ^-8 a 10 °). Utilizzare due pozzi per ogni titolazione (in duplice copia).
10. Incubare cellule Vero con il virus inoculums 1 ora a 37 ° C. Mescolare delicatamente i piatti ogni 15 minuti per distribuire uniformemente il virus per il monostrato.
11. Rimuovere il inoculums e sostituirlo con 2 ml / pozzetto di mezzo di copertura (Tabella 1). Incubare le piastre per una settimana a 37 ° C.
12. Rimuovere il mezzo di copertura (non ha bisogno di essere completa) e sostituirlo con la correzione / media macchia di dosaggio placca (Tabella 1) e incubare per almeno 1 ora a temperatura ambiente.
13. Quando le piastre sono asciugati, contare il numero di ben isolate placche ad ogni diluizione. Per ridurre al minimo errore, solo i pozzetti contenenti tra placche 10 e 100 sono contati.
14. Calcolare il titolo del virus usando il Folloala formula: titolo (pfu / ml) = [(numero di placche / pozzetto) / (volume di inoculums / pozzetto)] x fattore di diluizione.

4. Centro di saggio infettive per determinare la carica virale in splenociti latentemente infette

1. Carico latente virale è determinata dalla infettive centro (IC), saggio sul monostrato di cellule Vero. Il giorno prima del test IC, le cellule Vero seme in 6 pozzetti (1 -. 2,5 x 10 ⁵ cellule / pozzetto Usiamo solitamente 11 pozzi per campione milza, 10 pozzi saranno utilizzati per la sospensione diluita serialmente splenociti e un bene per i test riattivazione spontanea del virus dopo cicli gelo-disgelo.
2. Sacrificare i topi infettati dopo la latenza è stabilito (12 - 14 giorni dopo l'infezione). Raccolto la milza del mouse e la piscina li in 1 ml di DMEM freddo.
3. Dissociazione meccanica della milza del mouse. Trasferire la milza del mouse appena isolato in una tavola 10 cm e aggiungere 10 ml di supporto desiderato, come DMEM con 2% FBS. Wet due-end di vetro smerigliato microscdiapositive con ope ghiacciata media. Posizionare la milza sul lato smerigliato di una diapositiva e nick la capsula con il bordo della fine smerigliata del vetrino altri. Meccanicamente dissociare la milza tra due vetrini fino a quando tutti i grumi rossi sono schiacciati (anche rimuovere le particelle di grasso, se presente).
4. Sciacquare i vetrini con DMEM per recuperare cellule rimanenti su entrambe le diapositive.
5. Trasferire la sospensione intero tessuto delicatamente attraverso un colino cellula (40 mesh di nylon micron) in una conica da 50 ml con tappo a vite del tubo. Lavare i 10 cm contenente il piatto omogenati di milza con 10 ml di PBS e il trasferimento, mentre il filtraggio.
6. Centrifugare la singola cellula sospensioni 10 min a 375 xg ed eliminare il surnatante. Flick il pellet cellulare per rompere grumi di cellule già esistenti. Aggiungere 5 ml di tampone ACK (Tabella 1) per lisare i globuli rossi. Incubare 5 min e centrifugare di nuovo a 375 x g.
7. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet, a fondo, ma delicatamente, in PBS con il 2% FBS. Mantenere le cellule a 4 ° C. Utilizzare una pipetta perrimuovere i detriti, se presente. Conte cellule vitali mediante un contatore automatico di cellule (Bio-Rad).
8. Rallenta il PBS-risospeso splenociti a 375 xg per 4 minuti. Gettare il surnatante e risospendere le cellule in 4 ml di DMEM completo (2 x 1 ml verranno utilizzati per l'analisi IC della sospensione originale; 0,6 ml usato per serie di cinque volte nel test di diluizione IC, 0,4 ml per la preparazione del DNA virale e qPCR, e 1 ml di sospensione saranno utilizzati per valutare la riattivazione spontanea del virus latente dopo tre cicli gelo-disgelo)
9. Preparare serie di cinque diluizioni (cioè 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) di sospensione splenociti di duplicati. Prefill le provette da 15 ml con DMEM 2,4 ml e diluire 600 microlitri sospensione splenociti sul primo tubo e mescolare bene. Trasferire 600 microlitri dal tubo precedente nel tubo successivo, ecc Non vortice!
10. Aspirare il terreno dalla preparato 6-ben monostrato di cellule Vero. Semi di 1 ml di splenociti in serie diluito su cellule Vero con ogni DUPL diluizionedicato (10 pozzi saranno utilizzati per 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 diluizioni).
11. Incubare le piastre 8-12 ore a 37 ° C e 5% di CO _2. Non superare 24 ore. Aspirare la sospensione seminato splenociti e carico di 4 ml di sovrapposizione dei media (Tabella 1) in ogni pozzetto. Incubare per altri 6 giorni.
12. Determinare i livelli di centri milza infettive dalla colorazione i piatti con lo 0,2% (w / v) cristalvioletto come mostrato nel saggio placca.

5. Quantificazione del genoma virale

1. Estrarre il DNA genomico totale dal γHV68 tessuti infetti, come polmone e milza campioni in questo esperimento. Utilizzare il sangue DNeasy e kit di Tissue (Qiagen), seguendo il protocollo del produttore.
2. Determinare la concentrazione di DNA di ogni campione per garantire la stessa quantità di DNA utilizzate per il dosaggio qPCR. Progettare il virus-specifici primer (~ 200 bp amplificato è preferibile per un saggio qPCR). Abbiamo usato il γHV68 ORF56 specifici primer (forward primer: 5 & prime; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 '; primer reverse: 5'-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3') per il dosaggio e β-actina primer (forward primer: 5'-cacccacactgtggcccatcat-3 'Primer inverso: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3') come un controllo per la reazione qPCR.
3. Miscelare il campione di DNA (100 - 500 ng è buona) e primers appropriati con 2 x SYBR Master Mix (Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix). Utilizzare il Bio-Rad Real-Time PCR System per quantificare la carica virale nei tessuti infetti. Eseguire PCR al seguente condizione: 95 ° C per 15 min e 45 cicli di 95 ° C per 30 min, 60 ° C per 30 min e 72 ° C per 30 minuti, seguita da analisi della curva di fusione, sia per il virale e actina ampliconi.
4. Per effettuare una curva standard per la quantificazione di genomi virali, diluire serialmente quantità note di un DNA γHV68 bacmid con il DNA genomico isolato da cellule non infettate. Esegui qPCR in parallelo con il DNA recuperato dal infezioniTed tessuti utilizzando gli stessi set di virus-specifici primer.
5. Presente la carica virale nel genoma dei tessuti come numero di copie di DNA virale per unità (ad esempio 100 o 500 ng ng) di DNA genomico dopo la normalizzazione di actina.

6. Rappresentante dei risultati:

La figura 1 mostra lo schema generale degli esperimenti per la misura di γHV68 infezione nei topi in vivo. Risultati rappresentativi di titoli di virus nei polmoni durante l'infezione acuta di γHV68, come determinato dal saggio di placca, sono stati mostrati in figura 2A. Un ceppo mutante di γHV68 contenente non funzionali virale Bcl-2 (vBcl-2) replicato a livelli paragonabili a wild-type γHV68 nei polmoni dopo 7 giorni l'infezione intranasale di topi BALB / c (6 - 7 topi per gruppo). Nessuna differenza statisticamente significativa nei titoli polmone del virus sono stati individuati tra i due gruppi. Questi dati indicano che vBcl-2 non è un fattore cruciale per l'infezione acuta del γHV68 intopi. Tuttavia, entro il 28 postinfection giorni, il titolo di vBcl-2 virus mutante della milza caduto 6 - a 10 - volte rispetto al WT, misurata con test centro infettive (Figura 2B), suggerendo che la vBcl-2 virus mutante γHV68 è difettoso per il mantenimento della latenza della milza dopo l'infezione. In accordo con il centro infettive titoli ridotta, il carico genoma virale del vBcl-2 virus mutante è stata fortemente ridotta rispetto a quella del virus WT al 28 ° giorno di esperimenti ripetuti, come mostrato nella Figura 2C. La stretta correlazione tra i carichi genoma virale e la frequenza di latente-HV68vBcl-2 mutante ex vivo in fase di riattivazione del virus latente dell'infezione evidenzia un difetto di latenza di questo virus mutante.

Figura 1. Schema per la misura della γHV68 infezione nei topi mediante la formazione di placca, centro infettive e saggio qPCRs.

Figura 2. Infezione latente e litico del WT e mutanti γHV68 virus in vivo. Replica acuta (A) del WT e mutanti vBcl-2 γHV68 virus nei polmoni dei topi BALB / c a 7 dpi (infezione giorno dopo) è stata determinata mediante saggio placca. (B e C) splenico centri infettive (B) e del carico del genoma virale (C) nella milza di topi infetti sono stati misurati a 28 dpi con il saggio centro infettive e qPCR, rispettivamente. Linee rosse, le medie dei valori indicati. ns, non significativo.

Discussion

γHV68 è stato ampiamente utilizzato come modello per comprendere la patogenesi delle risorse umane γ-HVS ^2,4,5. In questo protocollo, abbiamo descritto tre metodi utilizzati di routine, compreso saggio di placca per titolo virali infettive, test IC per il carico virale latente, e qPCR per il carico del genoma virale, per valutare l'infezione acuta e latente di γHV68 dopo l'inoculazione intranasale nei topi.

Il dosaggio della placca è stato ampiamente utilizzato per determinare il titolo del virus nelle cellule infette o tessuti, ma le condizioni ottimali per variare il virus utilizzato. Ciò è in gran parte perché la capacità di virus diversi per produrre placche (lesioni numerabile) su un monostrato cellulare è diverso. γHV68 normalmente produce placche evidenti sul monostrato di cellule Vero scimmia o cellule di topo in coltura come NIH3T12 o 3T3, 6 - 7 giorni dopo l'infezione. In particolare, la sensibilità delle cellule di infezione virale diminuisce con l'invecchiamento della monostrato o diventa sovraffollati Così, abbiamodi solito usano meno del 50% confluenza delle cellule Vero per il saggio di placca, che, nella nostra esperienza, dimostra i migliori risultati per γHV68. Inoltre, un monostrato uniformemente distribuiti e appena fatto è altamente raccomandato per la precisione di conteggio placca. Mentre si effettua la diluizione seriale dei campioni di virus, la cautela deve essere presa per evitare bolle e puntali dovrebbe essere cambiato tra ogni titolazione. Per l'alta titolati campioni di virus, diluizioni seriali di 10 volte sono raccomandati, altrimenti 2 - a diluizioni seriali di 5 volte vengono utilizzati.

A differenza di infezione acuta in cui virus infettivo possono essere analizzati direttamente dalla targa capacità di formazione, latentemente infette tessuti / campioni di γ-HVS di solito non contengono virus rilevabile preformato infettive, invece, il DNA virale è mantenuto come episoma circolare con pochi geni espresse ^6,7. In questo caso, il carico virale di latenza può essere determinata dalla frequenza di riattivazione ex vivo del virus da in vitrespianti o di cellule latentemente infette su una cultura permissiva cellula indicatore (es. cellule Vero) ^8. A tal fine, la sospensione singola cellula di tessuti infetti è preparata, contati, e placcato su monostrati di cellule sensibili, che vengono poi sovrapposte con mezzo di placca test. In questo protocollo, abbiamo descritto come preparare sospensioni singola cella della milza per il saggio di IC per misurare la quantità di virus latente che ha la capacità di riattivare per milza o popolazione al di splenociti ^4. Poiché solo una piccola popolazione di splenociti è latentemente infette, di solito si prepara seriale a bassa diluizioni di sospensione splenociti per i test titolo infettive. Estrema cautela deve essere presa durante l'intera procedura al fine di evitare dure cellule pipettaggio o vortex. E 'importante notare che le cellule B espiantati da milza mostrano generalmente scarsa vitalità ^9, che potrebbero influire sul rendimento di riattivazione ex vivo. Ogni gene che migliora la sopravvivenza di latenTLY cellule infettate potrebbe indirettamente favorire l'efficienza della ex vivo riattivazione del virus.

Rispetto ai test di formazione di placca e IC, qPCR fornisce un mezzo efficace per quantificare con precisione linfocitica γ-HVS in topi infettati _10. E 'particolarmente utile per un virus con scarsa capacità di formazione di placca grazie alla sua citotossicità minima per le cellule indicatore Vero o altro, e può essere applicata sia per i campioni acutamente e cronicamente infetti. Una curva standard è necessario e importante per quantificare con precisione genomi virali. Abbiamo sviluppato γHV68 curve standard basato sul ORF56 amplificazione genica, utilizzando un clone bacmid contenente il genoma γHV68 ^8. qPCR reazione è estremamente sensibile in grado di rilevare anche alcune copie di DNA virale per reazione qPCR, ben oltre i limiti del saggio della placca. Precauzioni devono però essere messe in atto per evitare la contaminazione incrociata tra campioni, mentre tra uninfectecampioni d, se necessario, controlli negativi per ogni reazione. La specificità della reazione qPCR può essere un problema serio in particolare per i campioni di tessuto infetto, poiché enorme quantità di DNA cellulare può influenzare il segnale di virus specifici per l'amplificazione. Questo però può essere rilevato da analisi della curva di fusione per non specifici prodotti amplificati. Nel naturalmente infetti splenocyte popolazioni, la frequenza di γHV68-cuscinetto cellule possono essere molto basso. In questo scenario, come complemento per l'analisi del DNA utilizzando qPCR quasispecie, limitando la diluizione-PCR (LD-PCR) fornisce un vantaggio alternativa per valutare la frequenza del genoma virale-cuscinetto cellule ^11,12. In breve, γ-HVS-linfociti infettati sono serialmente diluiti. DNA estratto da queste cellule è quello di essere utilizzato per un test sensibile nested PCR, in grado di rilevare la presenza di singole copie di DNA virale in campioni individuali. Un'analisi combinata di limitare la diluizione e qPCR rivelerà sia la frequenza di cellule latentemente infette e THe carico del DNA virale latente.

In particolare, saggio IC non può essere utilizzato come uno stand-alone metodo per misurare il carico virale latente, a causa del fatto che non fa distinzione tra riduzione del carico virale latente rispetto a un fallimento del virus latente in sé per riattivare. Come ulteriore misura di latenza virale, qPCR viene utilizzato per valutare quantitativamente le copie di genoma virale nei tessuti infetti. Una correlazione tra genoma ridotto la carica virale e contagiosa centro titolo suggerirebbe un difetto di latenza del virus. Al contrario, una disparità tra gli alti carichi del genoma virale e titolo virale latente basso sostengono che, anche se il virus è in grado di mantenere un pool di DNA virale latente, non è in grado di riattivare in modo efficiente dalla latenza.

In conclusione, i metodi descritti in questo protocollo anche applicabilità generale a herpesvirus diversi γHV68, per i quali la cellula bersaglio tipi virali e sequenze genomiche sono disponibili e permettono °valutazione e inequivocabile dei cicli di vita distinte in vivo. Può anche essere utilizzato per affrontare il ruolo biologico dei fattori di virulenza specifici nel contesto di infezione del mouse. Ad esempio, confrontando la replicazione di diversi virus Bcl-2 mutante γHV68 con quella di wild-type γHV68, il nostro recente lavoro ⁸ consente di determinare quale funzione di vBcl-2 (ad esempio l'apoptosi, l'autofagia, o entrambi) contribuisce alla in comportamento in vivo di questo virus a infezione acuta e cronica nel topo. Così, essi rappresentano anche importanti strumenti per sezionare il virus-ospite interazioni durante l'infezione.