Farelerde γHV68 Enfeksiyon ölçümü

Summary

γ-herpesvirüslerinin (γ-HVS) ev sahibi ömür boyu kalıcılığı kurmak. Enfeksiyon γ-HV68 ile farelerin genetik çözülebilir sağlar

Abstract

γ-herpesvirüslerinin (γ-HVS) lenfoid hücrelerde ¹ latent enfeksiyonlar kurmak için yeteneklerini dikkat çekicidir. EBV ve KSHV insan olarak γ-HVS, dar ana aralığı ciddi detaylı patojenik çalışmaları engellemiştir. Murin γ-herpesvirus 68 (γHV68) hisse senetleri γ-HVS insan ve yaygın genetik ve biyolojik benzerlik murid ^kemirgenler 2 doğal bir patojen . Viral enfeksiyon farklı aşamalarında fareler kendilenmiş suşları γHV68 enfeksiyon gibi, değerlendirme sırasında viral yaşam döngüsü ve γ-HVS enfeksiyon patogenezinde anlamak için önemli bir model sağlar.

Intranazal aşılama üzerine, daha sonra dalak ve diğer hücrelere, ev ^sahibi 3,4 ömrü boyunca yeniden olabilir gizli bir enfeksiyon, akut akciğer viremi γHV68 enfeksiyonu sonuçları çözümlenir bu. Bu protokol, biz eşek plak testinin nasıl kullanılacağını anlatacağızpost-intranazal enfeksiyonu (dpi) - akciğer bulaşıcı bir virüs titresi erken evre (7 gün 5) Vero hücre mono tabakaları homojenatlarında. Akut enfeksiyon, büyük ölçüde 2 temizlenir, 3 hafta postinfection γHV68 bir latent enfeksiyon 14 dpi etrafında kurulan ve daha sonra farelerin dalak tutulur. Gizli virüs enfeksiyonu genellikle uykuda kalır ve onun gen ekspresyonu çoğu kapanır sayede enfekte dokular, hücrelerin çok küçük bir nüfus etkiler. Latent enfekte splenositlerin kendiliğinden virüs, viral gizli yükü belirlemek için bulaşıcı bir merkezi (IC) yöntemi ile değinmeyecek olabilir doku kültürü içine explanting sonra yeniden etkinleştirin. Akut ve / veya latent enfekte dokular, kantitatif real-time PCR viral genomun kopya miktarını hesaplamak için (qPCR), maksimum hassasiyet ve doğruluk için kullanılır. QPCR ve plak tahlil ve / veya IC tahlil sonuçlarının kombine analizler, viral Spatiotemporal profillerini ortaya koyacaktırin vivo çoğaltma ve enfektivite.

Protocol

Aşağıdaki protokol teorik γHV68, benzer yaşam tarzı paylaşan diğer virüsler tarafından enfeksiyona değerlendirmek için kullanılabilir farelerde γHV68 litik ve latent enfeksiyon döngüsü, virüs titreleri ve viral genomun yükler çalışma anlatacağız.

1. ΓHV68, amplifikasyon

1. 37 ° C su banyosunda γHV68 donmuş bir flakon çözülme.
2. 37 NIH3T12 veya 3T3 hücre kültürü (~% 50 confluency) 10 cm yemekleri ve kültürü enfekte olmuş hücrelerde virüs inoculums ° C,% 5 CO _2.
3. Sitopatik etki (CPE) mikroskopi, kültür inceleyin ve hücrelerin% 80 den daha büyük CPE 4 ~ 5 gün sonra enfeksiyon eklendiğinde, bir anda medya toplamak. Virüs verimi en üst düzeye çıkarmak için, enfekte hücre kültürü ile ilişkili tüm hücre γHV68 serbest bırakmak için iki kez dondurulmuş ve çözülmüş olabilir.
4. Hücre enkaz kaldırmak için toplanan medya Santrifüj için 1000 rpm'de 5 dakika oda sıcaklığında (RT).
5. Süpernatantlar yeni tüpleri (yüksek hızda santrifüj tüp) altındaki hücre enkaz dokunmadan dikkatlice aktarın.
6. 12.000 devirde yüksek hızda santrifüj (Sorvall SA-600 için) 4 ° C'de en az 1.5 saat viral parçacıkların konsantre.
7. Süpernatantlar 10γ çamaşır suyu çözeltisi içine atın ve dikkatle 1ml serum serbest DMEM pelet (virüs ve artık hücre artıkları) yeniden askıya. 1,5 ml mikro-santrifüj tüpü içine yeniden askıya pelet aktarın ve vorteks ile iyice karıştırın.
8. Kalan hücre enkaz kaldırmak ve yeni bir tüp (virüs stok) supernatant aktarmak için maksimum hızda 2 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu enfeksiyon için son viral stoğu. Virüs stokunun titresi plak assay (aşağıya bakınız) tarafından belirlenir.

2. ΓHV68 fareler intranazal Enfeksiyon

1. 1.000 ile yaş ~ 6 hafta fareleri enfekte ~ γHV68 başına farelerin 5000 plak oluşturan birim (PFU).
2. Uyutmakketamin / xylazine (80 mg / ml ketamin ve 12 mg / ml ksilizin bir karışımı 60 ul / fare) periton boşluğuna enjeksiyonu ile fareler. Fareler ayak kısma anestezi izleyin. Genellikle ~ 5-10 dakika sürer. Fareler tamamen anestezi değilse, bu virüs hapşırık.
3. Fare tam anestezi olduğunda, yavaş fakat istikrarlı bir damla bırak farelere PBS içeren γHV68 ~ 30 ul (her bir burun deliğine 15 ul) aşılamak için bir pipet kullanın. Fare gerçekten kabarcıkları oluşturmaya çalışıyor kalmadan damla teneffüs emin olun.
4. Fareyi 10-15 dk kurtarmak ve onları kafes dönmeden önce fareler (örneğin bilinç, solunum, vb.) Refah izlemek için izin verin. Hayvanlar, gıda, su, ve yatak koşulları hastalık ve yeterliliği için günlük olarak kontrol edilir. Hastalık, ağrı veya sıkıntı klinik belirtileri ortaya çıkarsa, etyolojisini belirlemek için rutin teşhis yapılacaktır. Kendi vücut ağırlığının% 20'den fazla kaybetmek Hayvanlar maksimum ağırlık kaybı için kaydedilecektirötenazi. Ötenazi gerçekleştirmek için nihai karar klinik veteriner takdirine ve baş araştırmacısı olan aşağıdaki istişare yapılır.

3. Akut Etkilenmiş Akciğerler Virus titresi belirleme Plak Testi

1. Virüs enfektivite titreleri Vero hücreleri mono tabakaları üzerinde plak oluşumu ile belirlenir.
2. Vero hücreleri 2.5x10 ⁴ hücre / kuyu iyi plakaları 12 gün önce plak tahlil numaralı seribaşı. Hücreler eşit olarak dağıtılmış olmalıdır ve ulaşmak hücre yoğunluğu 30 -% 40 plak testinin günü.
3. % 0.5 (w / v) metilselüloz (MC) kaplama orta (Tablo 1) hazırlayın.
4. 5-7 gün sonra burun içi enfeksiyonu, akciğerlerde akut faz virüs titreleri belirlemek için γHV68-enfekte olmuş fareler Kurban. Euthanization Ketamin HCl (80-100 mg / kg SC, IM, IP) IM Na pentobarbital (30-50 mg / kg IP), intravenöz doz aşımı takip yönetilecek. Bu yöntem, t tarafından onaylanmıştırAmerikan Veteriner Hekimleri Birliği.
5. Hasat ve akciğerlere kan hücreleri çıkarmak için 1 x PBS ile iki kez yıkayın. 1 ml buz gibi komple DMEM orta akciğerlerin bir tarafı toplayın ve buz üzerinde tutmak. Hızla qPCR (aşağıya bakınız) akciğerlere viral DNA yükleri incelenmesi için -80 ° C'de, akciğerler ve mağaza diğer tarafı dondurmak.
6. Akciğer dokularında, 1 sn, donma ve çözülme üç kez maksimum hızda homojenize bir doku Homojenizatör kullanın. Örnek değiştirirken Homojenizatör her adımda% 70 etanol ile yıkayın.
7. 3.000 rpm'de 10 dakika süreyle homojenize doku Santrifüj 4 ° C Süpernatantı toplayın ve plak tayini için yeni tüplere transfer.
8. Girdap tarafından düz DMEM ile 1.5 ml mikro-santrifüj tüplerine akciğer Homojenat örneklerinin seri dilüsyonları (genellikle 10 ° 10 ^-8) hazırlayın. Önceden doldurunuz 540 ul DMEM uygun tüpleri numarası ve ilk tüp içine 60 ul Homojenat sulandırmak. I ilk tüp 60 ul transferbir sonraki, vb.
9. 12 kuyucuğu hazırlanan Vero mono tabakaları medya aspire ve yük / ters sırayla (10 ^-8 10 °) bulaşıcı virüsler içeren iyi seri seyreltilmiş Homojenat 200 ul. Her titrasyon (çift) için iki kuyu kullanın.
10. 37 virüs inoculums 1 saat Vero hücreleri inkübe ° C Her 15 dakikada bir, eşit, tek tabaka üzerinde virüs dağıtmak için plakalar yavaşça girdap.
11. Inoculums çıkarın ve 2 ml / bindirme orta (Tablo 1) ile değiştirin. 37 tabak az bir hafta süreyle inkübe ° C
12. Bindirme orta çıkartın (tam olması gerekmez) ve düzeltme / plak testinin leke orta (Tablo 1) ile değiştirin ve oda sıcaklığında en az 1 saat süreyle inkübe edin.
13. Plakalar kurutulur, her seyreltme iyi izole plakların sayısını. Hatayı en aza indirmek için, sadece 10 ve 100 plaklar arasında içeren kuyu sayılır.
14. Follo kullanarak virüs titresi hesaplayınkanat formül: titresi (pfu / ml) = [/ (/ iyi plakların sayısı) (inoculums / iyi hacmi)] x seyreltme faktörü.

4. Latent Etkilenmiş splenositlerin Virüs Yük belirleme Enfeksiyon Merkezi Testi

1. Latent viral yük Vero hücreleri tek tabaka üzerinde bulaşıcı merkezi (IC) tayini ile belirlenir. 6-kuyucuğu IC tahlil, tohum Vero hücreleri (1 - 2.5 X 10 ⁵ hücre / Biz genellikle dalak örnek başına 11 kuyu, 10 kuyu seri seyreltilmiş splenositlerin süspansiyon için kullanılan olacak ve test etmek için iyi bir gün önce donma-çözülme döngüsünden sonra virüs spontan reaktivasyon.
2. Gecikme süresi (12 - 14 gün sonra enfeksiyon) kurulduktan sonra enfekte olmuş fareler Kurban. Fare dalak ve havuz, 1 ml soğutulmuş DMEM içine Hasat.
3. Mekanik fare dalak çözülmesi. Taze izole fare dalak 10 cm tabak içine aktarın ve 10 ml% 2 FBS ile DMEM gibi istenilen orta ekleyin. Islak iki buzlu uç cam microscbuz orta yerdir slaytlar. Bir slayt nick ve diğer slayt buzlu sonu kenarı ile kapsül buzlu tarafta dalak yerleştirin. Bütün kırmızı kümeleri (eğer varsa da yağ parçacıkları kaldırmak) ezilmiş kadar mekanik iki slaytlar arasındaki dalak ayrıştırmaları.
4. DMEM ile hem slaytlar üzerinde kalan hücreleri kurtarmak için slaytlar durulayın.
5. 50 ml konik vidalı kapaklı tüp içine bir hücre süzgeç (40 mikron naylon mesh) ile tüm doku süspansiyonu yavaşça aktarın. 10 cm çanak dalak homojenatlarında içeren filtreleme ise 10 ml PBS ve transferi ile yıkayın.
6. 375 xg'de tek hücre süspansiyonları 10 dakika santrifüj ve supernatant atın. Mevcut hücre kümeleri break up hücre pelletleri Flick. 5 ml ACK tamponu (Tablo 1), kırmızı kan hücreleri lyse ekleyin. 5 dakika inkübe ve 375 x g. tekrar santrifüj
7. Süpernatantı atın ve PBS içinde yavaşça henüz iyice yeniden askıya pelet,% 2 FBS. Hücreleri, 4 ° C tutun Bir pipet kullanınvarsa pislikleri temizleyin. Canlı hücreler kullanarak bir otomatik hücre sayıcı (Bio-Rad) güvenin.
8. 4 dakika için 375 xg PBS yeniden süspanse splenositlerin dönerler. Süpernatant atın ve 4 ml tam DMEM (2 x 1 ml süspansiyon IC testi için kullanılacak hücreler tekrar süspansiyon; IC tayininde seri beş kat seyreltme için kullanılan 0,6 ml; viral DNA hazırlığı ve qPCR için 0.4 ml, ve 1 ml süspansiyon) üç donma-çözülme döngüsünden sonra latent virüs spontan reaktivasyon değerlendirmek için kullanılır.
9. Çiftleri splenositlerin süspansiyon seri beş kat dilüsyonları (yani 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) hazırlayın. 2.4 ml DMEM ve ilk tüpe 600 ul splenositlerin süspansiyon sulandırmak ve iyice karıştırın önceden doldurunuz 15 ml konik tüpler. Sonraki tüpe bir önceki tüpten 600 ul Transferi, vb girdap etmeyin!
10. Vero hücrelerinden hazırlanan 6 sıra tek tabaka, orta aspire. Tohum 1 ml her seyreltme dupl ile Vero hücreleri üzerine seri olarak seyreltilmiş splenositlerinicated (10 kuyu, 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 dilüsyonları için kullanılır).
11. Plakalar 8-12 saat 37 ° ° C'de ve% 5 CO _2. 24 saat aşmayın. Aspire numaralı seribaşı splenositlerin süspansiyon ve her bir kuyu için 4 ml bindirme medya (Tablo 1) yüklemek. Ek bir 6 gün boyunca inkübe edin.
12. Plak tayininde gösterildiği gibi kristal viyole% 0.2 (w / v) ile tabak boyama dalak bulaşıcı merkezleri düzeylerini belirlemek.

5. Viral Genom, Niceleme

1. Bu deneyde, akciğer ve dalak örnekleri gibi γHV68 enfekte dokular, toplam genomik DNA ayıklayın. Üreticinin protokolü takip DNeasy Kan ve Doku Seti (Qiagen) kullanın.
2. QPCR tayini için kullanılan DNA aynı miktarda sağlamak için her numunenin DNA konsantrasyonu belirleyin. Tasarım virüs spesifik primerler (~ 200 bp Amplikon qPCR testi için tercih edilir). ΓHV68 ORF56 spesifik primerler (ileri astar kullandı: Biz 5 ve prime - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 '; ters astar: CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG 5'-3') bu tahlil ve β-aktin primerler (ileri astar: 5'-cacccacactgtggcccatcat-3 'ters astar: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc 3') qPCR reaksiyon için bir denetim.
3. (- 500 ng 100) ve 2 x SYBR master miks (Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix) uygun primerler DNA örneği karıştırın. Bio-Rad Real-Time PCR sistemi enfekte dokularda viral yükü ölçmek için kullanın. Aşağıdaki koşul PCR yapın: 15 dakika ve 45 döngüleri 95 - 95 ° C ° C, 30 dakika 60 ° C için 30 dakika ve 72 ° C 30 dakika, viral ve her ikisi de, erime eğrisi analizleri ile takip aktin amplikonlarının.
4. Viral genomların ölçümü için bir standart eğri olması, enfekte olmamış hücrelerden izole edilen genomik DNA ile γHV68 bacmid DNA bilinen miktarlarda seri sulandırmak için. Enfeksiyon alınan DNA'lar ile paralel olarak qPCR çalıştırınTed virüs spesifik primerler aynı setleri kullanarak dokular.
5. Aktin normalleşme sonra genomik DNA birim başına viral DNA kopya sayısı (örneğin 100 ng veya 500 ng) gibi dokularda viral genom yük sunun.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1 genel şeması γHV68 enfeksiyon farelerde in vivo olarak ölçmek için deneyler gösteriyor. Şekil 2A plak yöntemi ile belirlenen γHV68, akut enfeksiyon sırasında akciğerlerde virüs titreleri Temsilcisi sonuçlar gösterilmiştir. Içeren γHV68 bir mutant suşu fonksiyonel olmayan viral Bcl-2, 7 gün BALB / c farelerde (grup başına 6 - 7 fareler) intranazal enfeksiyon sonra akciğerlerde yabani tip γHV68 karşılaştırılabilir seviyelerde çoğaltılır (vBcl 2). Virüs akciğer titreleri iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar tespit edildi. Bu veri vBcl-2 γHV68 akut enfeksiyon için önemli bir faktör olmadığını gösterirfareler. Ancak, 28 gün postinfection, dalak vBcl-2 mutant virüs titresi 6 düştü - 10 kat WT, bulaşıcı merkezi assay (Şekil 2B) ile ölçülen ile karşılaştırıldığında, öne vBcl-2 mutant γHV68 virüs , enfeksiyon sonrası splenik gecikme bakım arızalı. Azaltılmış bulaşıcı merkezi titreleri ile anlaşma, vBcl-2 mutant virüs viral genomun yükü ciddi Şekil 2C gösterildiği gibi tekrarlanan deneylerde 28 gün WT virüsler, kıyasla azalmıştır. Enfeksiyon latent aşamada latent-HV68vBcl-2 mutant virüs reaktivasyonu ex vivo viral genomun yükler ve sıklığı arasında yakın bir ilişki, bu mutant virüs enfeksiyonu bir gecikme kusur vurgulamaktadır .

Şekil 1 plak oluşumu sayesinde, bulaşıcı merkezi ve qPCR tahlil farelerde γHV68 enfeksiyon ölçümü için şematiks

Şekil 2, in vivo WT ve mutant γHV68 virüs Parçalayıcı ve latent infeksiyon . 7 dpi (günlük yazılan enfeksiyonu) BALB / c farelerde akciğerlerde WT ve mutant vBcl-2 γHV68 virüsleri akut çoğaltma (A) plak yöntemi ile tespit edildi. Dalak bulaşıcı merkezleri (B) ve enfekte farelerde dalak viral genomun yük (C) (B ve C), sırasıyla, 28 dpi çözünürlükte, bulaşıcı merkezi tahlil ve qPCR tarafından ölçüldü. Kırmızı çizgiler, belirtilen değerlerin ortalamaları. NS, anlamlı değil.

Discussion

γHV68 yaygın insan γ-HVS ^2,4,5 patogenezinde anlamak için bir model olarak kullanılmıştır. Bu protokol, farelerde intranazal aşılama sonrası γHV68 akut ve latent enfeksiyon değerlendirmek, plak için bulaşıcı bir virüs titresi tahlil, viral gizli yük için IC tahlil ve viral genomun yük için qPCR olmak üzere üç rutin olarak kullanılan yöntem tanımlanmıştır.

Plak testi, enfekte olmuş hücrelerde ya da dokularda virüs titresi belirlemek için yaygın olarak kullanılan, ancak virüs olduğu için optimal şartlarda değişiklik olmuştur. Bu büyük ölçüde bir hücreye tek tabakalı plaklar (sayılabilen lezyonlar) üretmek için farklı virüsler kapasitesi farklı olduğundan. 7 gün sonra enfeksiyon γHV68 normal maymun Vero hücreleri veya NIH3T12 veya 3T3, 6 gibi kültürlü fare hücreleri tek tabaka üzerinde belirgin plaklar üretir. Özellikle, viral enfeksiyon, tek tabaka yaşları olarak azalır ya da olur, hücre hassasiyet Böylece, kalabalıkgenellikle% 50'den az, deneyimlerimiz, γHV68 için en iyi sonuçları gösteren, plak testi için Vero hücrelerinde confluency kullanın. Buna ek olarak, eşit olarak dağıtılmış ve taze yapılmış bir tek tabaka çok plak sayma doğruluğu için tavsiye edilir. Virüs örneklerinin seri seyreltme yaparken dikkatli kabarcıklarını önlemek için ve her titrasyon pipetlemeyin ipuçları arasında değiştirilmesi gerektiğini alınmalıdır. Yüksek titre virüs örnekleri için, 10 kat seri dilüsyonları tavsiye edilir, aksi takdirde, 2 - 5 kat seri dilüsyonları kullanılır.

Bulaşıcı bir virüs doğrudan plak oluşturan yeteneğini test edilebileceği akut enfeksiyon aksine g-HVS latent enfekte doku / numuneler genellikle saptanabilir preformed bulaşıcı bir virüs içermez, bunun yerine, birkaç gen viral DNA dairesel bir episome olarak korunur ^6,7 dile getirdi. Bu durumda, viral gecikme yük vitr de ex vivo virüsün reaktivasyonu frekansı ile belirlenir.o müsamahakar bir göstergesi hücre kültürü (örneğin, Vero hücreleri) ⁸ üzerine latent enfekte olan hücreleri eksplantlar. Bu amaçla, enfekte dokuların tek hücre süspansiyonu, hazırlanan sayılır ve duyarlı hücreler, daha sonra plak tahlil orta ile kaplanmış mono tabakaları üzerine kaplama. Bu protokol, dalak, dalak veya ^{splenositlerin} 4 başına düşen nüfus başına yeniden etkinleştirmek için yeteneğine sahiptir latent virüs miktarını ölçmek için IC tahlil için tek hücre süspansiyonları nasıl hazırlanacağını tarif var . Sadece küçük bir nüfusa splenositlerin latent enfekte olduğundan, genellikle bulaşıcı titresi test için splenositlerin süspansiyon seri düşük kat dilüsyonları hazırlamak. Sert pipetleme veya vorteks hücreleri önlemek için bütün prosedür sırasında son derece dikkatli alınmalıdır. Genellikle dalak gelen ex vivo reaktivasyonu verimliliğini etkileyebilecek kötü canlılığı ^9, bu eksplante B hücreleri dikkat etmek önemlidir. Laten hayatta artıran herhangi bir gently bulaşmış hücrelerin ex vivo virüsün reaktivasyonu verimliliğini dolaylı kolaylaştırabilir.

Plak oluşturan ve IC testleri ile karşılaştırıldığında, qPCR ₁₀ bulaşmış farelerde lenfositik γ-HVS doğru bir şekilde ölçmek için etkili bir araç sağlar. O, Vero veya diğer gösterge hücrelerine minimum sitotoksisite nedeniyle kötü plak oluşturma yeteneğine sahip bir virüs için özellikle yararlı olduğunu ve akut ve kronik olarak enfekte örnekleri için uygulanabilir. Bir standart eğri viral genomların doğru bir şekilde ölçülmesi için gerekli ve önemlidir. ΓHV68 genom ⁸ içeren bir bacmid klon kullanan γHV68 ORF56 gen amplifikasyonu dayalı standart eğrileri geliştirdi. qPCR tepki qPCR reaksiyon başına viral DNA, çok plak testinin sınırlarının ötesine bile birkaç kopya tespit edebilmek son derece duyarlıdır. Önlemler Ancak uninfecte dahil olmak üzere örnekler arasında çapraz bulaşmayı önlemek için yerine koymak gerekirHer reaksiyon için gerekli negatif kontrol olarak d örnekleri. Hücresel DNA'nın büyük miktarda virüs spesifik amplifikasyon sinyal etkileyebilir yana qPCR reaksiyon özgüllük, özellikle enfekte doku örnekleri için ciddi bir sorun olabilir. Ancak bu nonspesifik amplifiye ürünler için eğri analizi erime tespit edilebilir. Doğal enfekte splenocyte popülasyonlarında γHV68 taşıyan hücrelerin frekansı çok düşük olabilir. Bu senaryoda, quasispecies DNA qPCR analizi için tamamlayıcı bir sınırlayıcı dilüsyon PCR (LD-PCR) viral genomun taşıyan hücrelerin ^11,12 sıklığını değerlendirmek için alternatif bir avantaj sağlar. Kısaca, γ-HVS-enfekte olmuş lenfositler seri seyreltilir. Bu hücreler elde edilen DNA, tek kopya bireysel örneklerinde viral DNA varlığı tespit edebilen hassas bir nested PCR testi için kullanılacak. Seyreltme ve qPCR sınırlayıcı bir kombine analiz latent enfekte hücreleri sıklığı ve th ortaya koyacaktıre viral gizli DNA yük.

Özellikle, IC tahlil latent virüsün kendisini yeniden etkinleştirmek için bir başarısızlık karşısında, viral gizli yükler azalma arasında bir ayrım yapmaz, bu gerçeği nedeniyle viral gizli yük, ölçmek için bir stand-alone bir yöntem olarak kullanılabilir değil. Viral gecikme ilave bir önlem olarak, qPCR kantitatif enfekte dokularda viral genom kopya değerlendirmek için kullanılır. Azaltılmış viral genomun yükler ve bulaşıcı merkezi titresi arasındaki ilişki virüsün bir gecikme hatası öneririz. Buna karşın, yüksek viral genomun yükler ve düşük latent viral titresi arasında bir farklılık virüs latent viral DNA havuzu sürdürülmesi yeteneğine sahip olmasına rağmen, verimli bir gecikme yeniden etkinleştirmek mümkün olduğunu iddia ediyorum.

Sonuç olarak, bu protokol açıklanan yöntemlerden, aynı zamanda, daha γHV68 diğer herpesvirüslerinin genel uygulanabilirliği için hedeflenen hücre tipleri ve viral genom dizileri mevcuttur ve th izinin vivo olarak farklı yaşam döngülerini e kesin değerlendirme. Aynı zamanda fare enfeksiyon bağlamında spesifik virülans faktörleri, biyolojik rol adresi kullanılabilir. Örneğin, bizim son çalışmaları ⁸ farklı viral Bcl-2 mutant γHV68 çoğaltma, yabani tip γHV68 ile karşılaştırarak, bize katkıda bulunan vBcl-2 (örneğin, apoptoz, otofaji veya her ikisi de) hangi fonksiyonun belirlemenize olanak verir in vivo farelerde akut ve kronik enfeksiyon Bu virüsün davranış. Böylece, aynı zamanda enfeksiyon sırasında virüs-konak etkileşimleri incelemek için önemli araçlar temsil eder.