Mätning av γHV68 infektion hos möss

Summary

γ-herpesvirus (γ-HVS) etablera livslång persistens i sin värd. Infektion av möss med γ-HV68 ger ett genetiskt lätthanterlig

Abstract

γ-herpesvirus (γ-HVS) är anmärkningsvärda för sin förmåga att skapa latenta infektioner av lymfoida celler ^1. Den smala värdspektrum av mänskliga γ-HVS, såsom EBV och KSHV, har utgjort ett allvarligt hinder detaljerade patogena studier. Murina γ-herpesvirus 68 (γHV68) aktier omfattande genetiska och biologiska likheter med mänskliga γ-HVS och är en naturlig patogen till murid gnagare ^2. Som sådan, utvärdering av γHV68 infektion hos möss inavlade stammar i olika stadier av virusinfektion ger en viktig modell för att förstå virus livscykel och patogenes vid γ-HVS infektion.

Efter nasal ympning, som γHV68 infektion resulterar i akut viremi i lungan är senare lösas in i en latent infektion av splenocytes och andra celler, som kan aktiveras under hela värden ^3,4. I detta protokoll kommer vi att beskriva hur du använder plack analysen att bedömas infektiöst virus titer i lungan homogenat på Vero cell monolager i ett tidigt skede (5 - 7 dagar) av post-intranasalt infektion (dpi). Medan akut infektion är i stort sett rensat 2 - 3 veckor postinfection, en latent infektion av γHV68 är etablerad runt 14 dpi och underhållas senare i mjälten på möss. Latent infektion drabbar oftast en mycket liten population av celler i infekterade vävnader, där viruset stannar vilande och stänger de flesta av dess genuttryck. Latent infekterade splenocytes reaktivera spontant viruset vid explantation i vävnadsodling, som kan rekapituleras av en smittsam centrum (IC) analys för att bestämma virus latent belastning. För att ytterligare uppskatta mängden virala genomet exemplar i akut och / eller latent infekterade vävnader, kvantitativ realtids-PCR (qPCR) används för maximal känslighet och precision. Den kombinerade analyser av resultaten av qPCR och plack analys och / eller IC-analysen kommer att avslöja Spatiotemporal profiler av viralareplikering och smittsamhet in vivo.

Protocol

Följande protokoll kommer att beskriva studiet av viruset antikroppnivåer och virushalt genomet i lytiska och latent infektion cykel γHV68 hos möss, som teoretiskt kan användas för att utvärdera infektion av andra virus med liknande livsstil som γHV68.

1. Förstärkning av γHV68

1. Tina ett fruset injektionsflaska med γHV68 i 37 ° C vattenbad.
2. Lägg virus inoculums till NIH3T12 eller 3T3 cellkultur (~ 50% confluency) i 10 cm rätter och kultur de infekterade cellerna vid 37 ° C i 5% CO _2.
3. Undersök kulturen genom mikroskopi för cytopatisk effekt (CPE) och samla media i en tid då mer än 80% av celler visa CPE 4 ~ 5 dagar efter infektion. För att maximera avkastningen av viruset, kan den infekterade cellen kulturen frysas-och tinade två gånger för att släppa alla cell-associerade γHV68.
4. Centrifugera samlas media vid 1000 rpm i 5 min i rumstemperatur (RT) för att ta bort cellrester.
5. Försiktigt överföra supernatanterna till nya tuber (höghastighetståg centrifugrör) utan att röra cellen skräp på botten.
6. High-speed centrifugera vid 12.000 rpm (för Sorvall SA-600) vid 4 ° C under minst 1,5 timmar att koncentrera viruspartiklar.
7. Kasta supernatanterna i 10γ blekmedel och noggrant återsuspendera pelleten (virus och resterande cellfragment) med 1 ml serum-fri DMEM. Överför resuspenderas pelleten i ett 1,5 ml mikro-centrifugröret och blanda väl genom att vortexa.
8. Centrifugera 2 minuter vid maximal hastighet för att avlägsna rester cellfragment och överför supernatanten (virus lager) till ett nytt rör. Detta är den sista virala lager för infektion. Den titer av viruset beståndet bestäms av plack analys (se nedan).

2. Intranasalt Infektion av möss med γHV68

1. Infektera möss vid ~ 6 veckors ålder med 1000 ~ 5000 plaque-forming units (PFU) av γHV68 per möss.
2. Bedövamöss genom injektion av ketamin / xylazin (60 l / mus av en blandning av 80 mg / ml ketamin och 12 mg / ml xylazin) i bukhålan. Övervaka anestesi genom att klämma mössen tå. Det brukar ta ~ 5-10 min. Om möss är inte helt bedövad, kommer de att nysa viruset.
3. När musen är helt sövda, använd en pipett för att inympa ~ 30 ìl av PBS innehållande γHV68 (15 l vid varje näsborre) till möss drop-by-släpp sakta men säkert. Se till att musen verkligen andas in dropparna utan att försöka bilda bubblor.
4. Låt musen för att återhämta sig efter 10-15 minuter och övervaka välfärd möss (t.ex. medvetande, andning, etc) innan tillbaka dem till buren. Djur kontrolleras dagligen för sjukdom och tillräckliga mat, vatten och villkor sängar. Om kliniska tecken på sjukdom, smärta eller lidande utvecklas kommer rutinmässig diagnostik för att fastställa etiologi genomföras. Djur som förlorar mer än 20% av sin kroppsvikt kommer att spelas in för maximal viktminskningoch avlivas. Det slutliga beslutet att utföra dödshjälp avgörs av den kliniska veterinär och görs efter samråd med den ansvarige forskaren.

3. Plack Assay att Bestäm Virus titer i akut infekterade lungor

1. Virusinfektivitetsprov titer bestäms av plack på monolager av Vero-celler.
2. Vero-celler är seedade på 2.5x10 ⁴ celler / brunn i 12 väl plattor dagen innan plack analys. Cellerna bör vara jämnt fördelade och celltätheten bör nå 30 - 40% på dagen för plack analysen.
3. Bered 0,5% (w / v) metylcellulosa (MC) overlay medium (tabell 1).
4. Offra γHV68-infekterade möss 5-7 dagar efter intranasal infektion för att bestämma akutfasreaktion virus titrar i lungorna. För euthanization Ketamin HCl (80-100 mg / kg SC, IM, IP) kommer att administreras IM följt av intravenös överdos av Na pentobarbital (30-50 mg / kg IP). Denna metod är godkänd av tHan American Veterinary Medical Association.
5. Harvest lungorna och skölj två gånger med 1 x PBS för att ta bort blodkroppar. Samla på ena sidan av lungorna i 1 ml iskallt komplett DMEM medelstora och hålla på is. Snabbt frysa den andra sidan av lungorna och förvara vid -80 ° C för att pröva virala DNA laster i lungorna genom qPCR (se nedan).
6. Använd en vävnad homogeniseringsapparat att homogenisera lungvävnad vid maximal hastighet för 1 sek, frys-och tö tre gånger. Tvätta homogeniseringsblandare med 70% etanol i varje steg när man byter provet.
7. Centrifugera det homogeniserade vävnaden vid 3000 rpm i 10 min vid 4 ° C. Samla supernatanten och övergång till nya rör för plack analysen.
8. Förbered spädningar (vanligtvis från 10 ° till 10 ^-8) av lung homogenatet prov i 1,5 ml mikro-centrifugrör med vanligt DMEM av virvel. Prefill lämpligt antal rör med 540 l DMEM och späd 60 l homogenatet i det första röret. Överför 60 l från det första röret iinte nästa, och så vidare.
9. Sug media från beredd Vero monolager i 12-brunnar och ladda 200 l / brunn seriellt utspädd homogenatet innehåller smittförande virus i en omvänd ordning (från 10 ^-8 till 10 °). Använd två brunnar för varje titrering (i två exemplar).
10. Inkubera Vero celler med viruset inoculums 1 timme vid 37 ° C. Snurra försiktigt plattorna var 15 minuter att fördela viruset över monolager.
11. Ta bort inoculums och ersätta det med 2 ml / brunn av overlay medium (tabell 1). Inkubera plattorna under en vecka i 37 ° C.
12. Ta bort overlay medium (behöver inte vara komplett) och ersätt med fix / fläcken medium plack analys (tabell 1) och inkubera i minst 1 timme vid RT.
13. När plattorna är torkade, räkna antalet väl isolerade plack vid varje spädning. För att minimera fel, bara brunnarna innehåller mellan 10 och 100 plack räknas.
14. Beräkna viruset titer med följanflygeln formel: titer (PFU / ml) = [(antal plattor / brunn) / (volym inoculums / brunn)] x utspädningsfaktorn.

4. Smittsamma Center Assay att Bestäm virusmängd i latent infekterade Splenocytes

1. Viral latent belastning bestäms av smittsam centrum (IC)-analysen på monolager av Vero-celler. Dagen innan IC analys, utsäde Vero celler i 6-brunnars plattor (1 -. 2,5 X 10 ⁵ celler / brunn Vi brukar använda 11 brunnar per mjälte urvalet, 10 brunnar användas för serie utspädd splenocytes fjädring och en brunn för att testa spontan reaktivering av viruset efter frys-tö-cykler.
2. Offra den infekterade möss efter latens är etablerad (12 - 14 dagar efter infektion). Harvest musen mjälten och poolen dem i 1 ml kyld DMEM.
3. Mekanisk dissociation av musen mjälte. Överför nyligen isolerade musen mjälte i en 10 cm tallrik och tillsätt 10 ml önskat medium såsom DMEM med 2% FBS. Wet två frostat slut glas microscOPE bilder med iskall medium. Placera mjälten på matta sidan av en bild och nick kapseln med kanten av frostade slutet av den andra bilden. Mekaniskt dissociera mjälten mellan två bilder tills alla röda klumpar krossas (även avlägsna fett partiklar i förekommande fall).
4. Skölj objektglasen med DMEM att återställa kvarvarande celler på båda bilderna.
5. Överför hela vävnaden fjädring försiktigt genom en cell sil (40 ìm nylon mesh) i en 50 ml konisk skruvkork rör. Tvätta 10 cm maträtten innehåller mjälten homogenat med 10 ml PBS och överför samtidigt filtrering.
6. Centrifugera den enda cellsuspensioner 10 minuter vid 375 xg och kassera supernatanten. Flick cellen pellets för att bryta upp existerande cell klumpar. Tillsätt 5 ml ACK buffert (tabell 1) för att lysera de röda blodkropparna. Inkubera 5 minuter och centrifugera igen vid 375 x g.
7. Kassera supernatanten och återsuspendera pellets, noga, men försiktigt, i PBS med 2% FBS. Håll celler vid 4 ° C. Använd en pipett för attbort skräp, om något. Räkna livsdugliga celler med hjälp av en automatisk celltalsräknare (Bio-Rad).
8. Spin ner PBS-återsuspenderade splenocytes vid 375 xg under 4 min. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i 4 ml komplett DMEM (2 x 1 ml kommer att användas för IC-analysen av den ursprungliga fjädring, 0,6 ml används för seriell femfaldig utspädning i IC-analys, 0,4 ml för viralt DNA beredning och realtids-PCR och 1 ml suspension ska användas för att utvärdera spontan reaktivering av latent virus efter tre frys-tö cykler)
9. Förbered seriell fem gånger spädningar (dvs 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) av splenocytes suspension i dubbletter. Prefill 15 ml koniska rör med 2,4 ml DMEM och späd 600 l splenocytes suspensionen i första röret och blanda väl. Överför 600 l från tidigare slang in i nästa rör, etc. inte vortexblandare!
10. Sug mediet från den färdiga 6-väl monolager av Vero-celler. Seed 1 ml av serie-utspädd splenocytes på Vero-celler med varje spädning duplicated (10 brunnar kommer att användas för 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 utspädning).
11. Inkubera plattorna 8-12 timmar vid 37 ° C och 5% CO _2. Överskrid inte 24 timmar. Aspirera seedade splenocytes fjädring och belastning 4 ml overlay medier (tabell 1) i varje brunn. Inkubera i ytterligare 6 dagar.
12. Bestäm halten av mjälten smittsamma centra genom färgning plattorna med 0,2% (w / v) kristallviolett som visas i plack-analysen.

5. Kvantifiering av det virala genomet

1. Utdrag totala genomisk DNA från γHV68-infekterade vävnader såsom lunga och prover mjälte i detta experiment. Använd DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) enligt tillverkarens protokollet.
2. Bestäm DNA-koncentrationen för varje prov för att säkerställa samma mängd DNA som används för qPCR analysen. Design virus-specifika primers (~ 200 bp amplicon är att föredra för en qPCR test). Vi använde γHV68 ORF56-specifika primers (framåt grundfärg: 5 & PRIME - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3, "reverse primer: 5'-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3 ') för denna analys och β-aktin primers (framåt grundfärg: 5'-cacccacactgtggcccatcat-3" omvänd primer: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3) som en kontroll på qPCR reaktion.
3. Blanda DNA-provet (100 - 500 ng är bra) och lämpliga grundfärger med 2 x SYBR Master Mix (Bio-Rad iQ SYBR Grön Supermix). Använd Bio-Rad realtids-PCR-system för att kvantifiera virusmängd i den infekterade vävnaden. PCR på följande villkor: 95 ° C i 15 min och 45 cykler av 95 ° C i 30 min, 60 ° C i 30 min och 72 ° C i 30 minuter, följt av smältning kurva analyser, för både virus och aktin amplicons.
4. För att göra en standardkurva för kvantifiering av virus arvsmassa, seriellt späda kända mängder av ett γHV68 bacmid DNA med arvsmassans DNA isolerat från oinfekterade celler. Kör qPCR parallellt med DNA hämtas från infektionenTed vävnader med samma uppsättningar av virus-specifika primers.
5. Presentera det virala genomet last i vävnader som virus antalet DNA-kopior per enhet (t ex 100 ng eller 500 ng) av arvsmassans DNA efter aktin normalisering.

6. Representativa resultat:

Figur 1 visar den övergripande planen av experimenten för mätning av γHV68 infektion hos möss in vivo. Representativa resultat av virus titrar i lungorna vid akut infektion av γHV68, som bestäms av plack-analysen, visades i figur 2A. En mutant stam av γHV68 som innehåller icke-funktionella virala Bcl-2 (vBcl-2) replikeras på nivåer jämförbara med wild-type γHV68 i lungorna efter 7 dagar intranasalt infektion i BALB / c-möss (6-7 möss per grupp). Inga statistiskt signifikanta skillnader i lungan titrar av viruset upptäcktes mellan två grupper. Dessa data indikerar att vBcl-2 är inte en avgörande faktor för akut infektion av γHV68 imöss. Men med 28 dagar postinfection sjönk titer av vBcl-2 mutant virus i mjälte 6 - till 10 - gånger jämfört med WT, mätt som smittsamma centrum analys (figur 2b), vilket tyder på att vBcl-2 mutant γHV68 virus är defekt i underhållet av mjälten latens efter infektion. I samförstånd med den reducerade smittsamma centrum titrar var det virala genomet belastning vBcl-2 muterade viruset kraftigt reducerad jämfört med den WT virus vid dag 28 i upprepade experiment, som visas i Figur 2C. Det nära sambandet mellan virala genomet laster och frekvensen av latent-HV68vBcl-2 muterade viruset reaktivering ex vivo vid latent skede av infektionen belyser en latens fel av detta muterade virus infektion.

Figur 1. Skiss för mätning av γHV68 infektion hos möss med hjälp av plack, infektionssjukdomar centrum och qPCR analysS.

Figur 2. Lytiska och latent infektion i WT och muterade γHV68 virus in vivo. Akut replikering (A) av WT och muterade vBcl-2 γHV68 virus i lungorna av BALB / c möss vid 7 dpi (dag efter infektion) bestämdes av plack-analysen. (B och C) mjälten smittsam center (B) och virusgenom belastning (C) i mjälte av infekterade möss mättes vid 28 dpi med smittsamma centrum analys och qPCR, respektive. Röda linjer, medeltal av angivna värden. ns, inte signifikant.

Discussion

γHV68 har i stor utsträckning använts som en modell för att förstå uppkomsten av mänskliga γ-HVS ^2,4,5. I detta protokoll beskrivs vi tre rutinmässigt används metoder, inklusive plack analys för smittsamma virus titer, IC-analys för virus latent belastning och qPCR för virusgenom last, för att utvärdera akut och latent infektion av γHV68 efter intranasal inokulationen hos möss.

På skylten analys har använts i stor utsträckning att bestämma viruset titer i infekterade celler eller vävnader, men den optimala förutsättningarna varierar för viruset som används. Detta är till stor del på grund av att kapaciteten i olika virus att tillverka minnestavlor (uppräknelig lesioner) i en cell monolager är annorlunda. γHV68 producerar normalt uppenbara plaketter på monolager av apan Vero celler eller odlade celler mus som NIH3T12 eller 3T3, 6 - 7 dagar efter infektion. Särskilt cellen känslighet för virusinfektion nedgångar som cellslager åldras eller blir överfulla Därför har vivanligtvis använder mindre än 50% confluency av Vero celler för plack analys, som enligt vår erfarenhet, visar de bästa resultaten för γHV68. Dessutom är en jämnt fördelad och nygjord cellslager rekommenderas för riktigheten av plack räkna. Samtidigt som den seriella utspädning av virus prov, måste försiktighet vidtas för att undvika bubblor och pipettera tips ska bytas mellan varje titrering. För hög-titered virus prover, är 10-faldig seriespädningar rekommenderas, annars 2 - till 5-faldig seriespädningar används.

Till skillnad från akut infektion där infektiösa virus direkt kan analyseras av plaque-forming förmåga, latent infekterade vävnader / prover av γ-HVS vanligtvis inte innehåller detekterbara prefabricerade smittsamt virus, istället är virus-DNA bevaras som en cirkulär episome med få gener uttryckt ^6,7. I detta fall kan virus latens lasten bestäms av frekvensen av ex vivo reaktivering av viruset från i vitro explants av latent infekterade celler till en tillåtande indikator cellkultur (t.ex. Vero-celler) ^8. För detta ändamål är enda cell suspension av infekterade vävnader förberedda, räknas, och pläterade på monolager av mottagliga celler, som sedan belagd med plack analyssubstratet. I detta protokoll har vi beskrivit hur man förbereder en enda cell indragningar av mjälten för IC-analys för att mäta mängden av latenta virus som har förmågan att reaktivera per mjälte eller per invånare splenocytes ^4. Eftersom endast en liten befolkning på splenocytes är latent infekterad, förbereder vi brukar seriell låg-faldig utspädningar av splenocytes suspension för smittsam titer test. Extrem försiktighet måste tas under hela proceduren för att undvika hårda pipettering eller vortexa celler. Det är viktigt att notera att explanterade B celler från mjälte allmänhet visar dålig lönsamhet ^9, vilket kan påverka effektiviteten i ex vivo reaktivering. Varje gen som förbättrar överlevnaden av latently infekterade celler kan indirekt underlätta effektivitet ex vivo reaktivering av viruset.

Jämfört med plaque-forming och IC-analyser ger qPCR ett effektivt sätt att exakt kvantifiera lymfatisk γ-HVS i infekterade möss _10. Det är särskilt användbart för ett virus med dålig plaque-forming förmåga på grund av sin minimala cytotoxicitet till Vero eller andra indikatorer celler, och kan användas för både akut och kroniskt infekterade prover. En standardkurva är nödvändigt och viktigt för att exakt kvantifiera virus arvsmassa. Vi utvecklade γHV68 standardkurvor baserad på ORF56 genamplifiering, använder en bacmid klon som innehåller γHV68 genomet ^8. qPCR reaktion är extremt känslig att kunna upptäcka även några kopior av virus-DNA per qPCR reaktion, långt utöver gränserna för plack analysen. Försiktighetsåtgärder måste dock införas för att undvika korskontaminering mellan prover, medan bland annat uninfected prover som behövs negativa kontroller för varje reaktion. Specificitet qPCR reaktion kan vara ett allvarligt problem framför allt för infekterad vävnadsprover, eftersom enorma mängder cellernas DNA kan påverka signalen av virus-specifika PCR. Detta dock kan upptäckas genom att smälta kurva analys för ospecifik förstärkta produkter. I naturligt infekterade splenocyte populationer kan frekvensen av γHV68-bärande celler vara mycket låg. I detta scenario, som ett komplement till qPCR analys med quasispecies DNA, begränsa utspädning PCR (LD-PCR) är ett alternativ fördel att bedöma frekvensen av virala genomet-bärande celler ^11,12. Kortfattat är γ-HVS-infekterade lymfocyter seriellt utspädd. DNA extraherat från dessa celler ska användas för en känslig kapslade PCR-analys, som kan upptäcka förekomsten av enstaka exemplar virus-DNA i enskilda prov. En kombinerad analys av att begränsa utspädning och qPCR kommer att avslöja både frekvensen av latent infekterade celler och the virus latent DNA belastning.

Noterbart kan IC-analysen inte användas som en fristående metod för att mäta virus latent belastning på grund av det faktum att det inte skiljer mellan minskningar av virus latent belastning kontra ett misslyckande latent virus i sig för att återaktivera. Som en ytterligare åtgärd av viral latens är qPCR används för att kvantitativt utvärdera det virala genomet kopiorna i infekterade vävnader. Ett samband mellan minskad virusgenom laster och smittsamma centrum titer skulle föreslå en latens fel av viruset. Däremot skulle en skillnad mellan hög virusgenom belastning och låg latent viral titer hävdar att även om viruset kan hålla en latent virus-DNA poolen, är det inte effektivt aktivera från latens.

Sammanfattningsvis, de metoder som beskrivs i detta protokoll har också den allmänna tillämpligheten för herpesvirus än γHV68, för vilka riktade celltyper och virus genomiska sekvenser är tillgängliga och ger ee entydig utvärdering av olika livscykler in vivo. Den kan också användas för att ta itu med den biologiska rollen av specifika virulensfaktorer i samband med musen infektion. Till exempel genom att jämföra replikering av olika virus Bcl-2 mutant γHV68 med det av vildtyp γHV68 låter vårt senaste arbete ⁸ för oss att avgöra vilken funktion vBcl-2 (t.ex. apoptos, autophagy, eller både och) bidrar till att i vivo beteende av detta virus i akut och kronisk infektion hos möss. Därmed utgör de också ett viktigt verktyg att dissekera virus-värd interaktioner vid infektion.