Summary
我々は、植物におけるタンパク質間相互作用をテストする手法を開発した。黄色蛍光タンパク質（YFP）がつの非オーバーラップフラグメントに分割されます。各断片は融合タンパク質の発現を可能にする、ゲートウェイのシステムを経由して目的の遺伝子にインフレームでクローニングされる。検死のタンパク質が相互作用するときにYFPシグナルの再構成にのみ発生します。
Abstract
我々は、 生体内の 2つのタンパク質間相互作用をテストするBiFC技術を開発しました。これは二つの非重複フラグメントに分割することにより、黄色蛍光タンパク質（YFPを）実現されます。各断片は、目的の遺伝子にインフレームでクローニングされる。これらのコンストラクトは、融合タンパク質の輸送の発現を可能にする、 アグロバクテリウム媒介形質転換によりタバコbenthamianaに同時形質転換することができる。検死のタンパク質が1-7をやり取りするときにYFPシグナルの再構成にのみ発生します。タンパク質 - タンパク質相互作用をテストおよび検証するために、BiFCは酵母ツーハイブリッド（Y2H）アッセイと一緒に使用することができます。これは、Y2Hで見落とされることができる間接的な相互作用を検出する場合があります。 Gatewayテクノロジは、できるだけ8,9限り多くの発現および機能解析システムにシャトルに興味のある遺伝子（GOI）の研究者を可能にする普遍的なプラットフォームです。方向とリーディングフレームの両方が表現対応のクローンを作るために制限酵素やライゲーションを使用せずに維持することができます。結果として、一つは実験全体で一貫した結果を確保するために、すべての再シーケンシングのステップをなくすことができます。我々はBiFCとY2H両方アッセイ10を実行するために使いやすいツールを研究者に提供するゲートウェイ互換BiFCとY2H一連のベクトルを作成している。ここで、我々は、Nのタンパク質-タンパク質相互作用をテストするために私達のBiFCシステムを使用してのしやすさを示すbenthamiana植物 。
Protocol
1。 アグロバクテリウム培養液の調製
- アグロバクテリウム菌株GV3101は、以前にゲートウェイの互換性のあるBiFCベクトルpEarleyGate201 - YCとpEarleyGate202 - YN、融合GOI構築物を含む各で形質転換。
- BiFC融合タンパク質の5 mlのYEB（5G L -1の牛肉エキス、1G L -1の酵母エキス、5G L -1ペプトン、5G L -1スクロース、2mMのMgSO 4を用い 、pH7.2）で培養に接種することでアグロバクテリウムを形質転換コンストラクト適切な抗生物質選択。 28で一晩培養して成長℃〜200 rpmで振盪。
- 滅菌済み1.5 mL遠心管に培養液1 mlを取り外します。
- 室温で10分間、1,000 gでペレット細胞は、上清を捨てる。
- 浸透培地1ミリリットル（5グラムL -1 D -グルコース、50mMのMES（シグマ）、2mMののNa 3 PO 4、0.1mMのアセトシリンゴン）11を追加することでペレットを洗浄します。ピペッティングでペレットを再懸濁します、10分1,000 gで、再度、細胞をペレット化する。
- 洗浄工程を2回繰り返します。
- 0.5mlの浸潤のメディアでペレットを再懸濁する。
- 600 nmで吸光度を測定し、1.2に1.0にOD 600の最終調整。
- 新しい1.5 mlチューブに各構成要素のアグロバクテリウム懸濁液を同量、10秒間ボルテックスアリコート。単一の浸潤のため、各構築物の100μLは、十分以上のものです。
- アグロバクテリウムの混合物は、現在浸透のための準備ができています。
2。浸潤
- N. benthamiana植物は、16時間明＆8時間暗のサイクルで、21℃で栽培されている。 5〜6週齢の植物は、浸透のために使用する必要があります。
- 気孔が完全に開くことができますinfiltratring前に1時間の白色光の下で成長室と場所から植物を取り出します。
- 1 mlのスリップ先端ツベルクリン注射器の針なしで再懸濁したアグロバクテリウム混合物を描く。
- 葉の裏面に対して、シリンジの先端を置き、静かに直接指一本で葉の表側をサポートしながら、プランジャーを押し下げる。それはmesophyllar空気のスペースを埋めるように液体が葉を通して拡散する。
- 将来の識別用マーカーペンで浸透した領域にラベルを付けます。
- 異なる構造を浸潤する場合は、手袋を変更したり、浸潤の間に70％エタノールでそれらをきれいにするのどちらかを確認してください。可能であれば、交差汚染を防ぐために、異なるサンプル間に1つの中肋のスペースを残す。
- 正常な成長条件下で成長キャビネットに植物を置きます。
3。再構成されたYFP信号の観測
- 浸透ゾーン内の葉組織の税5mm x 5mmのセグメント
- 水の中で、ガラスの顕微鏡スライド上に、カバースリップでサンプルをカバーし、共焦点または蛍光顕微鏡を用いて相互作用を調べ、サンプルをマウントします。
- 時間の経過とともにいくつかの異なる場所を表示する蛍光融合タンパク質をもたらすことができます発現/人身売買以上のように式は最大5日後に浸潤の時間から24時間ごとに監視する必要があります。
4。代表的な結果：
BiFCアッセイによりタンパク質 - タンパク質相互作用の例を図1に示されています。 AtTHP1とAtSAC3Aは酵母TREX - 2複合体のシロイヌナズナホモログの成分であると考えられている。彼らはnuclearporin AtNUP1と相互作用し、mRNAの輸出10を容易にすることができます。 AtNUP1がpEarlyGate202 - YN中にクローニングされている間AtTHP1とAtSAC3AはpEarlyGate201 - YCにクローニングした。構造は続いてGV3101に形質転換した。浸透のために三つの構成は、3通りの組み合わせ（AtNUP1 + AtSAC3A; AtTHP1 + AtSAC3A AtTHP1 + AtNUP1）と対にされた。再構成されたYFPのシグナルは48時間浸透後LCSM下で観察した。信号は、表皮細胞で観察し、これらのタンパク質のサブ細胞内局在と一致している核周縁部や核プラズマ、に局在していた。ネガティブコントロールは、YFPのシグナルを示していない。
図1 シロイヌナズナ TREX - 2 mRNAの輸出複雑なコンポーネントの相互作用。N. benthamiana葉、GOIの構造との共同変換は、ライカTCS SP2 confocol顕微鏡を使用して、浸潤後48〜72時間をイメージした、pEarleyGate201 - YCとpEarleyGate202 - YN（として示される）に融合。画像は、マージされた共焦点YFPと表皮Nの明視野像として表示されますbenthamiana葉細胞
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Discussion
BiFCアッセイはタンパク質相互作用を研究するための強力なツールです。従来のY2Hアッセイとは異なり、BiFCだけでなく、タンパク質 - タンパク質相互作用を可視化できるだけでなく、サブ細胞内局在などのタンパク質複合体の詳細な情報を提供します。また、2つの候補タンパク質が第三のパートナーが十分に近づけることができる限り、間接的な相互作用を検出することが可能です。あらゆる技術と同様に、BiFCには制限があります。蛍光団の形成のための分子状酸素の要件のために、BiFCは酸素の存在下で生き残ることはできない偏性嫌気性菌、で使用することはできません。これは、好気性生物6 BiFCの使用を制限します。蛍光体の複合体の形成は不可逆的である。これは、他者との相互作用からのタンパク質を防止し、動的平衡6の蛋白質複合体のアソシエーションとアソシエーション解除を混乱させる可能性があります。しかし、この不可逆性はまた、弱いまたはトランジットの相互作用を可視化することを可能にします。蛍光タンパク質断片は、それらが融合しているタンパク質の独立を関連付けるために機能が制限されています。一つは、真と偽陽性のタンパク質相互作用6の間を区別するために必要な、数多くのコントロールを提供する必要があります。また、蛍光体の再構成が7nm以上の距離で発生する可能性があるとして、蛍光相補性は、直接的または間接的な相互作用を示すことがあります。一つは、正確な相互作用の関係7をテストするようなY2Hまたは共免疫沈降法などの他の方法を使用する必要があります。
信頼性の高いデータを生成するために、適切なコントロールは、結果の解釈に使用する必要があります。彼らはattr1およびattr2カセット間の典型的なゲートウェイのフラグメントを含んでいるとして空のベクターを直接コントロールとして使用しないでください。従って、これらの空のベクトルは実際に"空"ではない。この問題を克服するために、我々は一般的にコントロールとしてベクトルに融合された無関係のタンパク質のペアを使用してください。別の潜在的な問題は、特に古いまたはストレスの植物から、植物細胞から蛍光を発する- autoです。経験の浅い調査官は、最初の蛍光を発する背景に慣れるためにuninfiltratedゾーンからサンプルを確認する必要があります。
最近、より多くのBiFCベースの手法は、さらに蛋白質、RNA -タンパク質相互作用12、およびDNAハイブリダイゼーション13のさまざまな側面にBiFCアッセイのアプリケーションを拡張するために開発されている。例えば、多色BiFCとBiFCベースは（BiFC - FRET）アッセイをFRETの生体細胞14の三元複合体を識別し、視覚化するために開発されている。
ゲートウェイとBiFCの組み合わせは、インタクトな細胞でタンパク質間相互作用を理解しようとする研究者にとって強力なツールです。私たちのBiFCシステムで使用される構造は、異なる組織や一過性発現系で観察されていない可能性があります様々な発達段階で、よりダイナミックなタンパク質相互作用を可視化する安定したトランスジェニック植物を生成するために使用することができます。私たちは、それぞれ、私たちのBiFCベクトルにHAタグとFLAGタグ（pEarleyGate201 - YCとpEarleyGate202 - YN）を組み込んでいます。この変更は、相互作用の可視化後、このようなウェスタンブロッティング、共免疫沈降し、アフィニティー精製、など様々なダウンストリームアプリケーションのためにそれが可能になります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、原稿と一般的なラボの援助を読み取るためのVi Nguyenさんに感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD Biosciences | 309602 |
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