Summary
We hebben een techniek ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties in planten te testen. Een geel fluorescerend eiwit (YFP) wordt opgesplitst in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van belang via de Gateway-systeem, waardoor de expressie van fusie-eiwitten. Reconstitutie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten met elkaar omgaan.
Abstract
We hebben een BiFC techniek om de interactie tussen twee eiwitten in vivo testen. Dit wordt bereikt door het splitsen van een geel fluorescerend eiwit (YFP) in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van interesse. Deze constructen kunnen vervolgens worden omgezet in co-Nicotiana benthamiana via Agrobacterium gemedieerde transformatie, waardoor de doorvoer expressie van fusie-eiwitten. De reconstructie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten interageren 1-7. Voor het testen en valideren van de eiwit-eiwit interacties, kunnen BiFC worden gebruikt in combinatie met de gist twee-hybride (Y2H) test. Dit kan detecteren indirecte interacties die kunnen worden over het hoofd gezien in de Y2H. Gateway-technologie is een universeel platform dat onderzoekers in staat stelt om de pendelbus van het gen van belang (GOI) in zoveel expressie en functionele analyse systemen mogelijk 8,9. Zowel de oriëntatie en het lezen van frame kan worden onderhouden zonder gebruik te maken van restrictie-enzymen of ligatie tot uitdrukking-ready klonen te maken. Als gevolg daarvan kan men elimineren van alle re-sequencing stappen om consistente resultaten in de gehele experimenten. We hebben een reeks van Gateway compatibele BiFC en Y2H vectoren die onderzoekers met eenvoudig te gebruiken tools om zowel BiFC en Y2H assays 10. Hier laten we zien het gemak van het gebruik van onze BiFC systeem om eiwit-eiwit interacties in N.-test benthamiana planten.
Protocol
1. Voorbereiding van Agrobacterium cultuur
- Agrobacterium stam GV3101 eerder getransformeerd met Gateway compatibele BiFC vector pEarleyGate201-YC en pEarleyGate202-YN, elk met een fusie construct van Indiase overheid.
- Inoculeren een 5-ml YEB (5g L -1 Beef-extract, 1 g L -1 Gistextract, 5g L -1 Peptone, 5g L -1 Sucrose, 2mm MgSO 4, pH 7,2) cultuur van BiFC fusie-eiwit constructen getransformeerd Agrobacterium met de geschikte antibioticum selectie. 'S nachts groeien cultuur bij 28 ° C schudden bij 200 rpm.
- Verwijder 1 ml van de cultuur in een steriele 1,5 ml centrifugebuis.
- Pellet-cellen bij 1.000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gooi supernatans.
- Was de pellet door het toevoegen van 1 ml van infiltratie media (5 g L -1 D-glucose, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na 3 PO 4, 0,1 mM acetosyringone) 11. Resuspendeer pellet door pipetteren, pellet-cellen opnieuw bij 1.000 g gedurende 10 minuten.
- Herhaal de wasstap nog twee keer.
- Resuspendeer de pellet in 0,5 ml infiltratie media.
- Meet de absorptie bij 600 nm en stel laatste OD 600 tot 1.0 naar 1.2.
- Aliquot een gelijke hoeveelheid van Agrobacterium opschorting van elk construct in een nieuwe 1,5 ml tube, vortex voor 10 sec. Voor een enkele infiltratie, 100 pi van elk construct is meer dan genoeg.
- De agrobacterium mengsel is nu klaar voor infiltratie.
2. Infiltratie
- N. benthamiana planten worden gekweekt bij 21 ° C, met 16-h licht en 8 uur donker cycli. Vijf tot zes weken oude planten moeten worden gebruikt voor infiltratie.
- Verwijder planten uit de groei kamer en plaats onder wit licht voor een uur voor infiltratring waardoor de huidmondjes volledig te openen.
- Het opstellen van geresuspendeerd agrobacterium mengsel in een 1-ml slip-tip tuberculine spuit zonder naald.
- Plaats het uiteinde van de spuit tegen de onderzijde van het blad en voorzichtig op de zuiger, terwijl direct ondersteuning van de bovenkant van het blad met een vinger. De vloeistof zal diffunderen door het blad als het vult de mesophyllar luchtruimten.
- Label de geïnfiltreerd gebied met een marker pen voor toekomstige identificatie.
- Bij het infiltreren met verschillende constructen, zorg ervoor dat beide veranderen je handschoenen of ze schoon met 70% ethanol tussen infiltraties. Indien mogelijk, laat een hoofdnerf ruimte tussen de verschillende monsters om kruisbesmetting te voorkomen.
- Plaats planten in een kast groei in normale groeiomstandigheden.
3. Observatie van de gereconstitueerde YFP-signaal
- Accijnzen een 5mm x 5mm segment van bladweefsel binnen de zone geïnfiltreerd
- Monteer de steekproef, in het water, op een glazen microscoopglaasje, het monster te bedekken met een dekglaasje en onderzoekt de interacties met behulp van een confocale of fluorescentie microscoop.
- Uitdrukking moeten gecontroleerd worden elke 24 uur vanaf de tijd van infiltratie maximaal 5 dagen later als overexpressie / handel kan resulteren in een tl-fusie-eiwitten het weergeven van verschillende locaties over een tijdsverloop.
4. Representatieve resultaten:
Een voorbeeld van eiwit-eiwit interacties getest door BiFC assay is weergegeven in figuur 1. AtTHP1 en AtSAC3A worden verondersteld om onderdelen van de Arabidopsis homoloog van gist TREX-2 complex. Ze kan interageren met een nuclearporin AtNUP1 en faciliteren mRNA export 10. AtTHP1 en AtSAC3A werden gekloneerd in pEarlyGate201-YC, terwijl AtNUP1 werd gekloneerd in pEarlyGate202-YN. De constructen werden vervolgens omgezet in GV3101. De drie concepten werden gekoppeld met drie mogelijke combinaties (AtTHP1 + AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 + AtSAC3A) voor infiltratie. De gereconstitueerde YFP signaal werd waargenomen onder een LCSM 48 uur na infiltratie. De signalen werden waargenomen in de epidermale cellen en gelokaliseerd in de nucleaire periferie of nucleaire plasma, die in overeenstemming is met de sub-cellulaire lokalisatie van deze eiwitten. De negatieve controles toonde geen YFP signaal.
Figuur 1. Arabidopsis TREX-2 mRNA export complexe componenten met elkaar interageren. N. benthamiana bladeren, co-getransformeerd met constructies van RVI gefuseerd aan pEarleyGate201-YC en pEarleyGate202-YN (zoals aangegeven), werden afgebeeld 48-72 uur na infiltratie, het gebruik van een Leica TCS SP2 confocol microscoop. Beelden worden weergegeven als samengevoegd confocale YFP en bright-field beelden van de epidermale N. benthamiana bladcellen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC assay is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van eiwit interacties. In tegenstelling tot de traditionele Y2H test, BiFC kunnen niet alleen de visualisatie van eiwit-eiwit interacties, maar geeft ook meer informatie van het eiwitcomplex, zoals sub-cellulaire lokalisatie. Ook is het mogelijk om indirecte interacties te detecteren zo lang als de twee kandidaat-eiwitten kan dichtbij genoeg worden gebracht door een derde partner. Net zoals elke technologie, BiFC heeft zijn beperkingen. Als gevolg van de eis van moleculaire zuurstof voor fluorofoor vorming, kan BiFC niet worden gebruikt in obligaat anaëroben, die niet kan overleven in de aanwezigheid van zuurstof. Dit beperkt het gebruik van BiFC om aërobe organismen 6. De vorming van fluorofoor complex is onomkeerbaar. Dit voorkomt dat eiwitten uit interactie met anderen en kan verstoren van de vereniging en dissociatie van eiwitcomplexen in dynamisch evenwicht 6. Echter, dit onomkeerbaarheid stelt ons ook te visualiseren zwakke of doorvoer interacties. Fluorescerend eiwit fragmenten hebben een beperkt vermogen om te associëren, onafhankelijk van de eiwitten waarvoor ze zijn gesmolten. Men moet zorgen voor de nodige en tal van controles om onderscheid te maken tussen ware en vals-positieve eiwit interacties 6. Ook, zoals fluorofoor reconstitutie kan optreden op een afstand van 7nm of meer, kan fluorescentie complementatie wijzen op ofwel een directe of indirecte interactie. Men moet andere methoden, zoals Y2H of co-immunoprecipitatie gebruiken om de exacte interactie relatie 7 te testen.
Om betrouwbare gegevens te genereren, dienen de juiste controles worden gebruikt voor de interpretatie van de resultaten. De lege vectoren mogen niet direct worden gebruikt als controles als ze bevatten de typische gateway fragment tussen attR1 en attR2 cassettes. Zo, deze lege vectoren zijn niet echt "leeg". Om dit probleem te verhelpen, hebben we meestal gebruik van een paar van niet-verwante eiwitten gefuseerd met de vectoren als een controle. Een ander potentieel probleem is de auto-fluoresceren van de plantencellen, in het bijzonder van oude of gestresste planten. Onervaren onderzoekers eerst moeten kijken naar een monster uit de zone uninfiltrated om vertrouwd te raken met de achtergrond fluoresceren.
Onlangs zijn er meer BiFC-gebaseerde methoden ontwikkeld om verder de toepassingen van de BiFC test uit te breiden tot de verschillende aspecten van eiwitten, RNA-eiwit interacties 12, en DNA hybridisatie 13. Bijvoorbeeld, multicolor BiFC en BiFC-based FRET (BiFC-FRET) test zijn ontwikkeld te identificeren en te visualiseren ternair complexen in levende cellen 14.
De combinatie van Gateway en BiFC is een krachtig hulpmiddel voor onderzoekers willen eiwit interacties te begrijpen in intacte cellen. De constructen die in onze BiFC systeem kan ook worden gebruikt om stabiele transgene planten genereren om meer dynamische eiwit interacties in verschillende weefsels en op verschillende ontwikkelingsstadia, die niet kan worden waargenomen in transiënte expressie systeem te visualiseren. We hebben opgenomen een HA-tag en een FLAG-tag in onze BiFC vectoren (pEarleyGate201-YC en pEarleyGate202-YN), respectievelijk. Deze wijziging maakt het mogelijk voor verschillende stroomafwaartse toepassingen zoals western blotting, co-immunoprecipitatie en affiniteit zuivering, etc., na de visualisatie van de interacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Vi Nguyen voor het lezen van het manuscript en de algemene lab hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD Biosciences | 309602 |
References
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
- Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
- Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
- Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
- Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
- Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
- Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
- Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).
