Summary
قمنا بتطوير تقنية لاختبار البروتين البروتين التفاعلات في المصنع. يتم تقسيم البروتين أصفر فلوري (YFP) إلى قسمين شظايا غير متداخلة. هو استنساخ كل جزء في الإطار لجينة من الفائدة عن طريق نظام البوابة ، وتمكين التعبير عن البروتينات الانصهار. إعادة تشكيل إشارة YFP يحدث فقط عندما تتفاعل البروتينات التحقيق.
Abstract
قمنا بتطوير تقنية BiFC لاختبار التفاعل بين اثنين من البروتينات في الجسم الحي. ويتم تحقيق هذا عن طريق تقسيم البروتين أصفر فلوري (YFP) إلى قسمين شظايا غير متداخلة. هو استنساخ كل جزء في الإطار لجينة من الفائدة. ويمكن بعد هذه التركيبات يشترك في تحويلها إلى benthamiana نيكوتيانا عبر التحول بوساطة الأجرعية ، والسماح للتعبير العبور من البروتينات الانصهار. إعادة تشكيل إشارة YFP يحدث فقط عندما تتفاعل البروتينات التحقيق 1-7. لاختبار والتحقق من تفاعلات البروتين البروتين ، يمكن استخدام BiFC مع اثنين من الخميرة مقايسة (Y2H) المختلطة. وهذا قد كشف عن التفاعلات غير المباشرة التي يمكن التغاضي عنها في Y2H. بوابة التكنولوجيا منصة عالمية تتيح للباحثين المكوك الجينات في المصالح (الحكومة الإسرائيلية) في كتعبير كثيرة وتحليل النظم الفنية و8،9 ممكن. لا يمكن الحفاظ على حد سواء اتجاه القراءة والإطار دون قيد أو باستخدام أنزيمات الربط لجعل التعبير عن استعداد الحيوانات المستنسخة. نتيجة لذلك ، يمكن للمرء أن القضاء على جميع الخطوات إعادة التسلسل لضمان تحقيق نتائج متسقة في جميع أنحاء التجارب. قمنا بإنشاء سلسلة من نواقل عبارة BiFC وY2H التي توفر للباحثين متوافق مع سهلة الاستخدام الأدوات اللازمة لأداء كل من المقايسات وBiFC Y2H 10. هنا ، علينا أن نظهر للتخفيف من استخدام نظامنا BiFC لاختبار البروتين البروتين التفاعلات في N. benthamiana النباتات.
Protocol
1. التحضير للثقافة الأجرعية
- الأجرعية سلالة GV3101 حولت سابقا مع متوافق عبارة BiFC ناقلات pEarleyGate201 - YC وpEarleyGate202 YN ، كل منها يحتوي على مزيج من الحكومة الإسرائيلية بناء.
- تلقيح لمدة 5 مل YEB (5G لحم -1 L استخراج ، 1G الخميرة -1 استخراج L ، L -1 5G ببتون ، 5G السكروز -1 L ، 2mm وMgSO 4 ، ودرجة الحموضة 7.2) ثقافة انصهار بروتين يبني BiFC تحولت مع الأجرعية اختيار المضاد الحيوي المناسب. ثقافة تنمو بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية تهتز في 200 دورة في الدقيقة.
- إزالة 1 مل من ثقافة إلى 1.5 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي.
- خلايا بيليه في 1000 ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وتجاهل طاف.
- غسل بيليه بإضافة 1 مل من وسائل الاعلام التسلل (5 ز L -1 مد الجلوكوز ، 50 ملي زارة التربية والعلم (سيغما) ، 2 مم نا 3 ص 4 ، 0.1 ملم acetosyringone) 11. Resuspend بيليه بواسطة pipetting ، وخلايا بيليه مرة أخرى في 1000 لمدة 10 دقيقة ز.
- كرر الخطوة غسل مرتين أخريين.
- Resuspend الكرية في وسائل الاعلام تسلل 0.5 مل.
- قياس الامتصاصية في 600 نانومتر ، وضبط النهائي OD 600-1،0 to 1.2.
- قسامة مبلغ مساو من تعليق الأجرعية كل بناء جديد في أنبوب مل 1.5 ، دوامة لمدة 10 ثانية. لتسلل واحد ، و 100 ميكرولتر من كل بناء أكثر من كافية.
- الخليط الأجرعية جاهز الآن للتسلل.
2. تسلل
- وتزرع نباتات N. benthamiana عند درجة 21 ، مع 16 ساعة ضوء و 8 دورات ح الظلام. وينبغي أن تستخدم لخمس محطات لمدة ستة أسابيع من العمر للتسلل.
- إزالة النباتات من النمو في غرفة ومكان تحت الضوء الأبيض لمدة 1 ساعة قبل السماح infiltratring الثغور لفتح بالكامل.
- وضع خليط الأجرعية معلق في حقنة 1 مل توبركولين زلة طرف دون الإبرة.
- مكان غيض من حقنة ضد الجانب السفلي من الأوراق وخفض بلطف المكبس مع دعم مباشر على الجانب العلوي من ورقة مع إصبع واحد. فإن السائل المنتشر من خلال ورقة لأنها تملأ الفراغات الهوائية mesophyllar.
- تسمية المنطقة تسلل بالقلم علامة لتحديد المستقبل.
- عندما تسلل مع بنيات مختلفة ، للتأكد من إما تغيير القفازات أو تنظيفها مع الايثانول 70 ٪ بين عمليات التسلل. إذا كان ذلك ممكنا ، وترك مسافة واحدة بين الضلع الأوسط عينات مختلفة لمنع النشطاء من التلوث.
- مكان النباتات في خزانة النمو في ظل ظروف النمو الطبيعي.
3. رصد إشارة YFP المعاد
- استئصال جزء س 5mm 5mm من نسيج نبات داخل المنطقة تسلل
- تركيب العينة ، في الماء ، وعلى شريحة ميكروسكوب زجاجية تغطي عينة مع ساترة ودراسة التفاعلات باستخدام المجهر مبائر أو مضان.
- وينبغي رصد التعبير كل 24 ساعة من وقت تسلل تصل إلى 5 أيام في وقت لاحق فضلا عن أكثر من التعبير / الاتجار يمكن أن ينتج البروتينات الفلورية الانصهار عرض عدة مواقع مختلفة على مسار الزمن.
4. ممثل النتائج :
ويرد مثال من البروتين البروتين التفاعل اختباره من قبل مقايسة BiFC في الشكل 1. ويعتقد AtTHP1 وAtSAC3A أن تكون مكونات homolog Arabidopsis مجمع الخميرة TREX - 2. يمكن أن تتفاعل مع AtNUP1 nuclearporin وتسهيل تصدير مرنا 10. وكانت مستنسخة AtTHP1 AtSAC3A في pEarlyGate201 - YC حين تم استنساخ AtNUP1 في YN - pEarlyGate202. تحولت لاحقا الى ثوابت GV3101. وإقران يبني الثلاث للمع 3 التوليفات الممكنة (AtTHP1 + AtNUP1 ؛ AtTHP1 + AtSAC3A ؛ AtNUP1 AtSAC3A +) لعمليات التسلل. ولوحظ في إشارة YFP المعاد تحت 48 ساعة بعد LCSM التسلل. وقد لوحظت اشارات في خلايا البشرة ومحلية في محيط النووية أو البلازما النووية ، وهو ما يتسق مع التعريب شبه الخلوية لهذه البروتينات. لم الضوابط السلبية لا تظهر أي إشارة YFP.
الشكل 1. Arabidopsis TREX - 2 مكونات الصادرات مرنا معقدة تتفاعل مع بعضها البعض. ن. تنصهر benthamiana الأوراق ، وشارك في تحويلها مع يبني من الحكومة الإسرائيلية إلى YC - pEarleyGate201 وpEarleyGate202 - YN (كما هو مبين) ، تم تصوير 48-72 ساعة بعد تسلل ، وذلك باستخدام مجهر لايكا TCS confocol SP2. وتظهر الصور كما YFP مبائر المدمجة ومشرق الميدان صور N. البشرة benthamiana خلايا نبات
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC مقايسة هو أداة قوية لدراسة التفاعلات بين البروتينات. خلافا للمقايسة Y2H التقليدية ، ليس فقط BiFC يسمح التصور من البروتين البروتين التفاعلات ، ولكنها توفر أيضا مزيدا من المعلومات من بروتين معقد مثل شبه الخلوية التوطين. أيضا ، فمن الممكن الكشف عن التفاعلات غير مباشرة ما دام يمكن جلبها البروتينات مرشح two قريبة بما فيه الكفاية من قبل شريك ثالث. مثل أي تكنولوجيا ، BiFC لها حدودها. نظرا لمتطلبات الأكسجين الجزيئي لتشكيل fluorophore ، لا يمكن أن تستخدم في BiFC اللاهوائيات تلزم ، والتي لا تستطيع البقاء في وجود الأكسجين. وهذا يحد من استخدام BiFC على الكائنات الهوائية 6. تشكيل مجمع fluorophore لا رجعة فيه. هذا يمنع البروتينات من التفاعل مع الآخرين ويكون مخلا الجمعيات والمجمعات disassociation البروتين في التوازن الديناميكي 6. ومع ذلك ، وهذا يتيح لنا أيضا الرجوع إلى تصور التفاعلات الضعيفة أو العبور. شظايا بروتين فلوري لديها قدرة محدودة على المنتسبين مستقلة من البروتينات التي لا تنصهر فيها. لا بد من توفير الضوابط اللازمة والعديد من التمييز بين التفاعلات البروتين الحقيقي وإيجابية كاذبة - 6. أيضا ، يمكن أن تحدث إعادة fluorophore على مسافة 7nm أو أكثر ، قد تشير إلى تكامل مضان إما التفاعل المباشر أو غير المباشر. واحد يحتاج إلى استخدام أساليب أخرى مثل Y2H أو شركة مناعي لاختبار العلاقة التفاعل الدقيقة 7.
من أجل توليد بيانات موثوق بها ، يجب استخدام الضوابط المناسبة لتفسير النتائج. لا ينبغي أن تستخدم ناقلات فارغة مباشرة والضوابط لأنها تحتوي على جزء العبارة المعتادة بين attR1 attR2 والأشرطة. وبالتالي ، فإن هذه الناقلة الفارغة ليست حقا "فارغة". للتغلب على هذه المشكلة ، ونحن عموما استخدام زوج من البروتينات لا علاقة لها تنصهر لناقلات كمجموعة تحكم. مشكلة محتملة أخرى هي السيارات يتألق من الخلايا النباتية ، وخاصة من النباتات القديمة أو شدد. وينبغي للمحققين الخبرة أول اطلالة له على عينة من منطقة uninfiltrated للتعرف على خلفية يتألق.
مؤخرا ، تم وضع أساليب أكثر BiFC مقرها لتوسيع نطاق تطبيقات مقايسة BiFC لمختلف جوانب والبروتينات ، والجيش الملكي النيبالي البروتين التفاعلات 12 و 13 تهجين الحمض النووي. على سبيل المثال ، متعدد الألوان وBiFC BiFC القائم على الحنق (BiFC - الحنق) مقايسة وضعت لتحديد وتصور ثلاثي المجمعات في الخلايا الحية 14.
مزيج من بوابة وBiFC هو أداة قوية للباحثين تسعى إلى فهم التفاعلات البروتين في خلايا سليمة. يمكن أيضا أن يبني المستخدمة في نظامنا BiFC يمكن استخدامها لتوليد النباتات المعدلة وراثيا لتصور التفاعلات مستقرة بروتين أكثر دينامية في الأنسجة المختلفة ، ومراحل النمو المختلفة التي قد لا يكون لوحظ في نظام التعبير عابر. أدخلنا HA بصمة وعلامة العلم في ناقلات لدينا BiFC (pEarleyGate201 - YC وpEarleyGate202 YN) ، على التوالي. هذا التعديل يجعل من الممكن لتطبيقات مختلفة مثل المصب الغربي النشاف ، مناعي التعاون وتنقية تقارب ، وما إلى ذلك ، بعد أن تصور من التفاعلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر السادس نغوين لقراءة المخطوطات والمساعدة العامة المختبر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD Biosciences | 309602 |
References
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
- Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
- Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
- Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
- Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
- Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
- Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
- Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).
