Summary
Wir haben eine Technik, um Protein-Protein-Interaktionen in Anlage-Test entwickelt. Ein gelb fluoreszierendes Protein (YFP) ist in zwei nicht überlappende Fragmente aufgeteilt. Jedes Fragment wird in-frame, ein Gen von Interesse via Gateway-System geklont, wodurch Expression von Fusionsproteinen. Rekonstitution der YFP-Signal erfolgt nur, wenn der gerichtlichen Untersuchung Proteinen interagieren.
Abstract
Wir haben eine BIFC Technik, um die Interaktion zwischen zwei Proteinen in vivo-Test entwickelt. Dies wird durch Aufteilung eines gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) in zwei nicht-überlappenden Fragmenten durchgeführt. Jedes Fragment wird in-frame, ein Gen von Interesse geklont. Diese Konstrukte können dann in Nicotiana benthamiana werden via Agrobacterium vermittelte Transformation co-transformiert, die den Transit Expression von Fusionsproteinen. Die Rekonstitution von YFP-Signal erfolgt nur, wenn der gerichtlichen Untersuchung Proteine 1-7 interagieren. Um zu testen und zu validieren das Protein-Protein-Interaktionen können BIFC zusammen mit Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H)-Assay verwendet werden. Dies kann erkennen indirekten Wechselwirkungen, die in der Y2H übersehen werden kann. Gateway-Technologie ist eine universelle Plattform, die Forschern die Shuttle-Gens von Interesse (GOI) in so viele Expression und funktionelle Analyse-Systeme wie möglich zu 8,9. Sowohl die Orientierung und Leserahmen können ohne Verwendung von Restriktionsenzymen oder Ligation zum Ausdruck bereit-Klone machen aufrechterhalten werden. Als Ergebnis kann man beseitigen alle Re-Sequenzierung Schritte, um konsistente Ergebnisse in den Experimenten zu gewährleisten. Wir haben eine Reihe von Gateway kompatibel BIFC und Y2H Vektoren, die Forscher stellen mit einfach zu bedienenden Tools zu führen sowohl BIFC und Y2H Assays 10 erstellt. Hier zeigen wir die einfache Nutzung unserer BIFC System zum Protein-Protein-Interaktionen in N. Test benthamiana Pflanzen.
Protocol
1. Vorbereitung von Agrobacterium Kultur
- Agrobacterium-Stamm GV3101 zuvor mit Gateway kompatibel BIFC Vektor pEarleyGate201-YC und pEarleyGate202-YN, die jeweils eine Verschmelzung von GOI Konstrukt transformiert.
- Impfen einer 5-ml YEB (5g L -1 Beef-Extrakt, 1g L -1 Hefeextrakt, 5 g L -1 Pepton, 5 g L -1 Saccharose, 2 mM MgSO 4, pH 7,2) Kultur BIFC Fusionsprotein-Konstrukten transformiert Agrobacterium mit dem einer angemessenen Antibiotika-Auswahl. Wachsen Kultur über Nacht bei 28 ° C unter Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute.
- Nehmen Sie 1 ml der Kultur in ein steriles 1,5 ml Zentrifugenröhrchen.
- Pellet-Zellen bei 1.000 g für 10 min bei Raumtemperatur, Überstand verwerfen.
- Waschen des Pellets durch Zugabe von 1 ml der Infiltration Medien (5 g L -1 D-Glucose, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na 3 PO 4, 0,1 mM Acetosyringon) 11. Pellet durch Pipettieren, Pellet-Zellen wieder bei 1.000 g für 10 min.
- Wiederholen Sie den Waschvorgang zwei weitere Male.
- Das Pellet in 0,5 ml Infiltration Medien.
- Die Absorption bei 600 nm und passen endgültigen OD 600 bis 1,0 bis 1,2.
- Aliquot einer gleichen Menge von Agrobacterium Suspension von jedem Konstrukt in ein neues 1,5-ml-Tube, Wirbel für 10 sek. Für eine einzelne Infiltration, ist 100 ul von jedem Konstrukt mehr als genug.
- Die Agrobacterium-Gemisch ist nun bereit für die Infiltration.
2. Infiltration
- N. benthamiana Pflanzen werden bei 21 ° C gewachsen, mit 16-h Licht und 8-h Dunkel-Zyklen. Fünf bis sechs Wochen alten Pflanzen sollten für die Infiltration verwendet werden.
- Entfernen Sie Pflanzen aus dem Wachstum Raum und unter weißem Licht für 1 h vor infiltratring so dass die Spaltöffnungen vollständig zu öffnen.
- Erstellen Sie resuspendiert Agrobakterium Mischung in eine 1-ml Slip-Spitze Tuberkulinspritze ohne Nadel auf.
- Setzen Sie die Spitze der Spritze an die Unterseite des Blattes und sanft drücken Sie den Kolben, während die direkte Unterstützung der Oberseite des Blattes mit einem Finger. Die Flüssigkeit wird durch das Blatt diffuse, wie es die mesophyllar Lufträume füllt.
- Beschriften Sie die infiltrierten Bereich mit einem Filzstift für die künftige Identifikation.
- Wenn Infiltration mit unterschiedlichen Konstrukten, vergewissern Sie sich, um entweder Ihre Handschuhe oder reinigen Sie sie mit 70% Ethanol zwischen Infiltrationen. Wenn möglich, lassen Sie eine Mittelrippe zwischen verschiedenen Proben, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
- Legen Sie Pflanzen in Wachstum Kabinett unter normalen Wachstumsbedingungen.
3. Die Beobachtung des rekonstituierten YFP-Signal
- Excise einem 5mm x 5mm Segment Blattgewebe innerhalb der infiltrierten Zone
- Montieren Sie die Probe im Wasser, auf einem Glasobjektträger, decken Sie die Probe mit einem Deckglas und untersuchen die Wechselwirkungen mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop oder.
- Expression sollte alle 24 Stunden ab dem Zeitpunkt der Infiltration bis zu 5 Tage später beobachtet werden, wie Überexpression / Handel mit fluoreszierenden Fusionsproteinen Anzeige verschiedenen Orten über einen zeitlichen Verlauf führen kann.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Ein Beispiel für Protein-Protein-Interaktion durch BIFC Assay getestet wird in Abbildung 1 dargestellt. AtTHP1 und AtSAC3A werden geglaubt, um Komponenten der Arabidopsis-Homolog der Hefe TREX-2-Komplex. Sie können mit einem nuclearporin AtNUP1 interagieren und zu erleichtern mRNA Export 10. AtTHP1 und AtSAC3A wurden in pEarlyGate201-YC geklont während AtNUP1 in pEarlyGate202-YN geklont wurde. Die Konstrukte wurden anschließend in GV3101 transformiert. (; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 + AtSAC3A AtTHP1 + AtNUP1) für die Infiltration der drei Konstrukte wurden mit 3 möglichen Kombinationen gepaart. Die rekonstituierte YFP-Signal wurde unter einem LCSM 48 Stunden nach der Infiltration beobachtet. Die Signale wurden in den epidermalen Zellen beobachtet und lokalisiert in der nuklearen Peripherie oder nuklearen Plasma, das im Einklang mit dem sub-zelluläre Lokalisation dieser Proteine ist. Die negativen Kontrollen zeigten keine YFP-Signal.
Abbildung 1. Arabidopsis TREX-2-mRNA export komplexen Komponenten miteinander interagieren. N. benthamiana Blätter, mit Konstrukten des GOI cotransformiert fusioniert pEarleyGate201-YC und pEarleyGate202-YN (wie angegeben), wurden abgebildet 48-72 h nach der Infiltration mit einem Leica TCS SP2 confocol Mikroskop. Die Bilder werden als fusionierte konfokalen YFP und Hellfeld-Bilder von epidermalen N. gezeigt benthamiana Blattzellen
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Discussion
BIFC Assay ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium Protein-Interaktionen. Im Gegensatz zu den traditionellen Y2H Assay BIFC ermöglicht nicht nur die Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen, sondern bietet auch weitere Informationen des Protein-Komplexes, wie sub-zelluläre Lokalisation. Auch ist es möglich, indirekten Wechselwirkungen so lange zu erkennen, wie die beiden Kandidaten Proteine nahe genug von einem dritten Partner gebracht werden. Wie jede Technologie hat BIFC seine Grenzen. Aufgrund der Anforderung von molekularem Sauerstoff für Fluorophor Bildung kann BIFC nicht in obligate Anaerobier, die nicht in der Gegenwart von Sauerstoff überleben können verwendet werden. Dies schränkt die Verwendung von BIFC zu aeroben Organismen 6. Die Bildung von Fluorophor-Komplex ist unumkehrbar. Dies verhindert, dass Proteine aus der Interaktion mit anderen und kann den Verein und Dissoziation von Proteinkomplexen in einem dynamischen Gleichgewicht 6 zu stören. Doch dieser Unumkehrbarkeit ermöglicht uns auch, schwach oder Transit-Interaktionen zu visualisieren. Fluorescent Protein-Fragmente haben eine begrenzte Fähigkeit, Mitarbeiter unabhängig von der Proteine, zu denen sie verschmolzen sind. Man muss die notwendigen und zahlreiche Kontrollen zwischen wahr und falsch-positive Protein-Interaktionen 6 unterscheiden. Auch als Fluorophor Rekonstitution kann in einem Abstand von 7 nm oder mehr auftreten, kann Fluoreszenz Komplementation zeigen entweder eine direkte oder indirekte Interaktion. Man muss andere Methoden wie Y2H oder Co-Immunpräzipitation verwenden, um das exakte Zusammenspiel Beziehung 7 zu testen.
Um zuverlässige Daten zu erzeugen, sollten angemessene Kontrollen für die Interpretation der Ergebnisse verwendet werden. Die leeren Vektoren sollte nicht direkt als Kontrollen verwendet werden, da sie die typischen Gateway-Fragment zwischen attr1 und attr2 Kassetten enthalten. Somit sind diese leeren Vektoren nicht wirklich "leer". Um dieses Problem zu umgehen, verwenden wir grundsätzlich ein Paar verwandte Proteine fusioniert an die Vektoren als Kontrolle. Ein weiteres mögliches Problem ist die Auto-Fluoreszenz aus den Pflanzenzellen, besonders von alten oder gestressten Pflanzen. Unerfahrene Untersucher sollte zuerst bei einer Stichprobe Blick aus dem uninfiltrated Zone, um sich mit dem Hintergrund fluoreszieren.
In jüngster Zeit haben mehrere BIFC-basierte Methoden entwickelt worden, um weiter ausbauen Anwendungen des BIFC Assay zu verschiedenen Aspekten der Proteine, RNA-Protein-Interaktionen 12, und die DNA-Hybridisierung 13. Zum Beispiel, FRET multicolor BIFC und BIFC-basierte (BIFC-FRET)-Assay wurde entwickelt, um zu identifizieren und zu visualisieren ternären Komplexe in lebenden Zellen 14.
Die Kombination aus Gateway und BIFC ist ein leistungsfähiges Werkzeug für Forscher, die Protein-Wechselwirkungen in intakten Zellen zu verstehen. Die Konstrukte in unseren BIFC System können ebenfalls verwendet werden, um stabile transgene Pflanzen zu erzeugen, um mehr Dynamik Protein-Interaktionen in verschiedenen Geweben und in verschiedenen Entwicklungsstadien, die nicht in transienten Expression System beobachtet werden können, zu visualisieren. Wir haben eine HA-Tag und ein FLAG-Tag in unserem BIFC Vektoren (pEarleyGate201-YC und pEarleyGate202-YN) eingebaut, bzw.. Diese Modifikation macht es möglich, für verschiedene Downstream-Anwendungen wie Western-Blot, Co-Immunopräzipitation und Affinitätsreinigung, etc., nach der Darstellung der Interaktionen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Vi Nguyen für die Durchsicht des Manuskripts und allgemeine Labor Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD Biosciences | 309602 |
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