使用网关兼容双分子荧光互补（附设）系统在植物蛋白相互作用检测

Summary

我们已经开发出一种技术，以测试植物蛋白质相互作用。一个黄色荧光蛋白（YFP）被分成两个非重叠的片段。每个帧通过网关系统的兴趣基因片段克隆，使融合蛋白的表达。重组YFP的信号只发生在研讯的蛋白质相互作用。

Abstract

我们已经开发出一种附设的技术测试体内的蛋白质之间的相互作用。这是通过一个黄色荧光蛋白（YFP）分裂成两个非重叠的片段。每帧到一个感兴趣的基因片段克隆。然后，这些结构可以合作转化为烟草通过农杆菌介导的转化，使过境融合蛋白表达。重组YFP的信号只发生时，研讯的蛋白质相互作用^1-7。测试和验证的蛋白质 - 蛋白质相互作用，附设可以一起使用的酵母双杂交（Y2H）检测。这可能会侦测到间接的相互作用，可在Y2H忽视。 Gateway技术是一个通用平台，使研究人员感兴趣的基因（GOI）穿梭成尽可能多的表达和功能分析系统， ^可能 8,9 。可维持的方向和阅读框，而无需使用限制性内切酶或结扎表达准备克隆。因此，可以消除所有的重测序步骤，以确保在整个实验一致的结果。我们已经建立了一系列网关兼容附设和Y2H载体，提供易于使用的工具执行附设的Y2H检测的^研究人员10。在这里，我们展示了易于使用我们的附设系统测试N中的蛋白质-蛋白质相互作用benthamiana植物。

Protocol

1。 农杆菌文化的制备

1. 农杆菌菌株GV3101中转换网关兼容附设载体pEarleyGate201 YC和pEarleyGate202 - YN，每个包含一个融合构建印尼政府。
2. 接种5毫升YEB（5G ^L - 1牛肉膏，1G ^L - 1酵母提取物，5G ^L - 1的蛋白胨，5G ^L - 1蔗糖，硫酸镁2MM _4，pH值7.2）附设的融合蛋白文化建设与农杆菌转化选择适当的抗生素。成长培养过夜，在28 ° C晃动在200转。
3. 进入无菌1.5 mL离心管中取出1毫升文化。
4. 在1000克颗粒细胞在室温为10分钟，弃上清。
5. 通过加入1毫升的渗透媒体（5克^L - 1 D -葡萄糖，50毫米MES（Sigma公司），2毫米的Na ₃ PO _4，0.1毫米乙酰丁香酮^）11的洗涤沉淀。吹打悬浮颗粒，颗粒细胞，在1000克10分钟。
6. 重复洗涤步骤两次。
7. 重悬在0.5毫升渗透媒体的沉淀。
8. 在600 nm测量吸光度和调整的最后₆₀₀外径为1.0至1.2。
9. 到一个新的1.5 ml管分装一个等量的农杆菌悬浮每个构造，持续10秒的旋涡。对于一个单一的渗透，100μL每个构造是绰绰有余。
10. 农杆菌混合物渗透。

2。浸润

11. 本生烟的植物生长在21 ° C，16 h光照8小时黑暗周期。 5至6周老厂，应使用渗透。
12. infiltratring让气孔完全开放之前，应删除的增长空间和1小时的白光下的植物。
13. 绘制在1毫升滑尖结核菌素注射器无针悬浮农杆菌介导的混合物。
14. 将注射器对叶底面的提示，同时直接支持的上部叶用一个手指轻轻压下柱塞。液体会漫过的叶子，因为它填补了mesophyllar的空气空间。
15. 为将来识别标签记号笔渗透的领域。
16. 与不同的结构渗透时，一定要改变你的手套或清洁与70％之间的渗透乙醇。如果可能的话，不同样品之间留下一脉的空间，以防止交叉污染。
17. 增长柜放置在正常生长条件下的植物。

3。观察重组YFP的信号

18. 海关采用5mm x 5mm的部分叶组织内的渗透区
19. 装入样品，水，玻璃显微镜玻片上，盖上盖玻片样品，并用共聚焦荧光显微镜检查的相互作用。
20. 表达应渗透时间长达5天后每24小时监测，可能会导致过度表达/贩卖超过一个时间过程的几个不同的位置显示在荧光融合蛋白质。

4。代表性的成果：

附设实验测试的蛋白质相互作用的一个例子是如图1所示。 AtTHP1和AtSAC3A被认为是拟南芥同源酵母TREX - 2复杂的组成部分。他们可以与一个nuclearporin AtNUP1和促进mRNA的出口^10。 AtTHP1和AtSAC3A分别克隆到pEarlyGate201 - YC而AtNUP1 pEarlyGate202 - YN克隆。随后被转化为GV3101中的构造。三个结构有3种可能的组合渗透（AtTHP1 + AtNUP1; AtNUP1 AtSAC3A; AtTHP1 + AtSAC3A）配对。下一个LCSM浸润后48小时观察重组YFP的信号。在表皮细胞中观察到的信号，并在核周边或核浆，这是符合这些蛋白质的亚细胞定位的本地化。阴性对照组没有表现出任何YFP的信号。

图1。 拟南芥了TREX - 2 mRNA的出口复杂的组件彼此互动。N。 benthamiana叶，与印度政府结构合作转化融合pEarleyGate201 YC和pEarleyGate202 - YN（表示），成像渗透后48-72 h，采用了Leica TCS SP2共聚焦显微镜。图片显示为合并后的焦YFP的表皮 N.亮场图像benthamiana叶细胞

Discussion

附设实验是研究蛋白质相互作用的有力工具。附设不同于传统的Y2H检测，不仅可以使蛋白质 - 蛋白质相互作用的可视化，而且还提供了更多的蛋白质复合体的亚细胞定位等信息。此外，它是可能的，只要检测到间接的相互作用的两个候选蛋白可以由第三方的合作伙伴带来足够接近。任何技术一样，附设有其局限性。由于附设的荧光基团形成的氧分子的要求，不能用于专性厌氧菌，在氧气存在的无法生存。这就限制了使用附设⁶需氧生物。荧光团的复杂的形成是不可逆转的。这可以防止蛋白质与人交往，并可能破坏该协会在动态平衡⁶的蛋白质复合物的解离。然而，这种不可逆转性，也使我们能够微弱或过境的交互可视化。荧光蛋白片段副独立的，它们融合蛋白的能力有限。必须提供必要和众多的控制，以区分真假阳性的^蛋白质相互作用6。此外，由于荧光团重组可以发生在距离7nm或以上，荧光互补可能表明无论是直接或间接的互动。人们需要使用如Y2H或免疫共沉淀等方法来测试确切的互动关系^7。

为了产生可靠的数据，适当的控制，应当用于对结果的解释。空载体，不应该直接作为对照，因为它们包含典型的网关之间attR1和attR2录音带片段。因此，这些空载体是不是真的“空”。为了克服这个问题，我们一般使用一对不相关的蛋白质融合作为控制向量。另一个潜在的问题是从植物细胞，尤其是从旧的或强调植物，自动发出荧光。没有经验的调查人员应首先看一个示例，从uninfiltrated区熟悉的背景荧光。

最近，更附设为基础的方法已被开发，以进一步扩大附设实验应用的各个方面，蛋白质，RNA - ^蛋白质相互作用^12，DNA杂交13。例如，多色附设附设- FRET（附设- FRET）检测已开发识别和可视化三元复合物在活细胞^14。

网关和附设的结合是一个强大的工具为寻求理解在完整的细胞蛋白质相互作用的研究人员。在我们的BiFC系统所使用的结构也可以被用来产生稳定的转基因植株的可视化更具活力的蛋白质相互作用，在不同的组织可能不会在瞬时表达系统观察在不同发育阶段。我们已纳入医管局附设向量标记和标志，标签（pEarleyGate201 YC和pEarleyGate202 - YN）。这使人们有可能修改，如免疫印迹，联合免疫亲和纯化等各种下游应用，可视化后的相互作用。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M2933
1 mL slip-tip tuberculin syringe	BD Biosciences	309602