Summary
Nous avons développé une technique pour tester les interactions entre protéines dans les plantes. Une protéine fluorescente jaune (YFP) est divisée en deux fragments non-cumul. Chaque fragment est clone dans leur cadre d'un gène d'intérêt par l'intermédiaire du système de passerelle, permettant l'expression de protéines de fusion. Reconstitution du signal YFP ne survient que lorsque les protéines interagissent l'enquête.
Abstract
Nous avons développé une technique BiFC pour tester l'interaction entre deux protéines in vivo. Ceci est accompli par fractionnement d'une protéine fluorescente jaune (YFP) en deux fragments non-cumul. Chaque fragment est clone dans leur cadre d'un gène d'intérêt. Ces constructions peuvent alors être co-transformé en Nicotiana benthamiana par transformation Agrobacterium, permettant l'expression de protéines de fusion de transit. La reconstitution du signal YFP ne survient que lorsque les protéines interagissent l'enquête 1-7. Pour tester et valider les interactions protéine-protéine, BiFC peut être utilisé avec deux hybrides de levure (Y2H) dosage. Ceci peut détecter les interactions indirectes qui peuvent être négligés dans le Y2H. La technologie Gateway est une plate-forme universelle qui permet aux chercheurs de faire la navette le gène d'intérêt (GOI) en tant qu'expression de nombreux systèmes et l'analyse fonctionnelle que 8,9 possible. Tant l'orientation et de cadre de lecture peut être maintenue sans l'aide d'enzymes de restriction ou la ligature de rendre l'expression prêts clones. En conséquence, on peut éliminer toutes les étapes de re-séquençage à assurer des résultats constants au cours des expériences. Nous avons créé une série de vecteurs et de la passerelle BiFC Y2H compatibles qui permettent aux chercheurs facile à utiliser des outils pour effectuer des essais et des deux BiFC Y2H 10. Ici, nous démontrons la facilité d'utilisation de notre système BiFC de tester les interactions entre protéines dans N. benthamiana.
Protocol
1. Préparation de la culture d'Agrobacterium
- Souche d'Agrobacterium GV3101 préalablement transformées avec Gateway compatibles BiFC vecteur pEarleyGate201-YC et pEarleyGate202-YN, contenant chacune une construction de fusion de l'IGE.
- Inoculer un 5-ml YEB (5g L Extrait de bœuf -1, 1g L extrait de levure -1, 5g L -1 peptonée, 5g L -1 de saccharose, 2 mM MgSO 4, pH 7,2) culture de la protéine de fusion BiFC construit transformée par Agrobacterium avec la sélection appropriée des antibiotiques. Cultivez la culture nuit à 28 ° C en agitant à 200 rpm.
- Retirer 1 ml de culture dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 ml.
- Cellules Pellet à 1000 g pendant 10 min à température ambiante, éliminer le surnageant.
- Laver le culot en ajoutant 1 ml de milieu d'infiltration (5 g L -1 D-glucose, 50 mM de MES (Sigma), 2 mM de Na 3 PO 4, 0,1 mM acétosyringone) 11. Resuspendre le culot par pipetage, les cellules granulés de nouveau à 1000 g pendant 10 min.
- Répéter l'étape de lavage deux fois plus.
- Reprendre le culot dans 0,5 ml de l'infiltration des médias.
- Mesurer l'absorbance à 600 nm et ajuster finale DO 600 de 1,0 à 1,2.
- Aliquoter une quantité égale de suspension d'Agrobacterium de chaque construction dans un nouveau tube de 1,5 ml, vortex pendant 10 sec. Pour une infiltration simple, 100 ul de chaque construction est plus que suffisant.
- Le mélange d'Agrobacterium est maintenant prêt pour l'infiltration.
2. L'infiltration
- N. benthamiana sont cultivés à 21 ° C, avec 16 h de lumière &-8-H cycles sombre. Cinq à six semaines des plantes, âgé doit être utilisé pour l'infiltration.
- Retirez les plantes de la salle de la croissance et la placer sous la lumière blanche pour 1 h avant infiltratring permettant les stomates pour ouvrir complètement.
- Dresser le mélange en suspension d'Agrobacterium dans un 1 ml glissement bout de la seringue tuberculine sans aiguille.
- Placez l'extrémité de la seringue contre le dessous de la feuille et doucement appuyer sur le piston tout en soutenant directement la face supérieure de la feuille avec un seul doigt. Le liquide se diffuse à travers la feuille car elle remplit les espaces aériens mesophyllar.
- Étiquette de la zone infiltrée avec un marqueur pour l'identification future.
- Lorsque l'infiltration avec des constructions différentes, assurez-vous soit à modifier vos gants ou les nettoyer avec de l'éthanol 70% entre les infiltrations. Si possible, laisser un espace nervure médiane entre différents échantillons afin de prévenir la contamination croisée.
- Placez les plantes dans une armoire de la croissance dans des conditions normales de croissance.
3. Observation du signal reconstitué YFP
- Un segment d'accise 5mm x 5mm de tissus foliaires au sein de la zone infiltrée
- Mont de l'échantillon, dans l'eau, sur une lame de microscope en verre, couvrir l'échantillon avec une lamelle et examiner les interactions à l'aide d'un microscope confocal ou fluorescence.
- Expression doit être surveillée toutes les 24 heures à partir du moment de l'infiltration jusqu'à 5 jours plus tard que sur l'expression / la traite peuvent conduire à des protéines de fusion fluorescentes affichant plusieurs endroits différents sur un parcours de temps.
4. Les résultats représentatifs:
Un exemple de l'interaction protéine-protéine testée par un test BiFC est montré dans la figure 1. AtTHP1 et AtSAC3A sont censés être des composants de l'homologue d'Arabidopsis de levure TREX-2 complexes. Ils peuvent interagir avec un AtNUP1 nuclearporin et de faciliter l'exportation 10 ARNm. AtTHP1 et AtSAC3A ont été clonées dans pEarlyGate201-YC tandis AtNUP1 a été cloné dans pEarlyGate202-YN. Les constructions ont été ensuite transformée en GV3101. Les trois constructions ont été jumelés avec 3 combinaisons possibles (+ AtTHP1 AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 + AtSAC3A) pour l'infiltration. Le signal reconstitué YFP a été observée sous une LCSM 48 heures après l'infiltration. Les signaux ont été observés dans les cellules épidermiques et localisé dans la périphérie nucléaire ou du plasma nucléaire, ce qui est cohérent avec la localisation sub-cellulaire de ces protéines. Les contrôles négatifs n'ont montré aucun signal de la YFP.
Figure 1. Arabidopsis TREX-2 composants complexes exportations ARNm interagissent les uns avec les autres. N. benthamiana feuilles, co-transformé avec des constructions des IGE fusionnée à pEarleyGate201-YC et pEarleyGate202-YN (comme indiqué), ont été imagées 48-72 h après l'infiltration, en utilisant un Leica TCS SP2 confocol microscope. Les images sont montré que YFP confocale fusionné et champ lumineux des images de l'épiderme N. benthamiana cellules de la feuille
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Test BiFC est un outil puissant pour étudier les interactions entre protéines. Contrairement à l'analyse traditionnelle Y2H, BiFC non seulement permet la visualisation des interactions protéine-protéine, mais fournit également plus d'informations sur le complexe protéique, comme localisation sub-cellulaire. En outre, il est possible de détecter des interactions indirectes tant que les deux protéines candidat peut être amené suffisamment près par un troisième partenaire. Comme toute technologie, BiFC a ses limites. En raison de l'exigence de l'oxygène moléculaire pour la formation de fluorophore, BiFC ne peut pas être utilisé dans anaérobies obligatoires, qui ne peuvent pas survivre en présence d'oxygène. Ceci limite l'utilisation de BiFC aux organismes aérobies 6. La formation de complexes fluorophore est irréversible. Cela empêche les protéines d'interagir avec les autres et peuvent perturber l'association et la dissociation des complexes de protéines en équilibre dynamique 6. Toutefois, cette irréversibilité nous permet également de visualiser les interactions faibles ou de transit. Fragments de protéines fluorescentes ont une capacité limitée à associé indépendant des protéines auxquelles ils sont fusionnés. On doit fournir les contrôles nécessaires et de nombreux faire la distinction entre les interactions entre protéines vrai et le faux-positifs 6. En outre, comme la reconstitution fluorophore peut se produire à une distance de 7 nm ou plus, la complémentation de fluorescence peut indiquer soit une interaction directe ou indirecte. On a besoin d'utiliser d'autres méthodes telles que Y2H ou de co-immunoprécipitation de tester la relation d'interaction exacte 7.
Afin de générer des données fiables, des contrôles appropriés doivent être utilisés pour l'interprétation des résultats. Les vecteurs vides ne devraient pas être directement utilisés comme témoins car ils contiennent le fragment passerelle typique entre attr1 et attR2 cassettes. Ainsi, ces vecteurs vides ne sont pas vraiment "vide". Pour surmonter ce problème, nous utilisons généralement une paire de protéines non apparentées fusionnés à des vecteurs comme un contrôle. Un autre problème potentiel est l'auto-fluorescence des cellules végétales, surtout à partir de plantes anciennes ou stressé. Les enquêteurs inexpérimentés devraient d'abord regarder un échantillon de la zone uninfiltrated de se familiariser avec le fond fluorescent.
Récemment, des méthodes plus BiFC basé ont été développés pour étendre les applications du test BiFC à divers aspects de protéines, ARN-protéine 12 et 13 hybridation de l'ADN. Par exemple, multicolore et BiFC BiFC basée sur le FRET (BiFC-FRET) de dosage ont été développées afin d'identifier et de visualiser des complexes ternaires dans les cellules vivantes 14.
La combinaison de la passerelle et BiFC est un outil puissant pour les chercheurs qui cherchent à comprendre les interactions entre protéines dans des cellules intactes. Les constructions utilisées dans notre système BiFC peut également être utilisé pour générer des plantes transgéniques stables à visualiser les interactions entre protéines plus dynamique dans les différents tissus et à différents stades de développement qui ne peut être observée dans le système d'expression transitoire. Nous avons intégré un tag HA et une étiquette FLAG dans nos vecteurs BiFC (pEarleyGate201-YC et pEarleyGate202-YN), respectivement. Cette modification permet à diverses applications en aval tels que Western blot, co-immunoprécipitation et de purification par affinité, etc, après la visualisation des interactions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions Vi Nguyen pour la lecture du manuscrit et de l'assistance du laboratoire général.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD Biosciences | 309602 |
References
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
- Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
- Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
- Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
- Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
- Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
- Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
- Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).
