Summary
Vi har utvecklat en teknik för att testa protein-protein interaktioner i anläggningen. En gul fluorescerande protein (YFP) delas upp i två icke-överlappande fragment. Varje fragment är klonade i-ram till en gen av intresse via gateway, vilket gör att uttryck av fusionsproteiner. Ombildning av YFP signalen bara uppstår när förhöret proteiner interagerar.
Abstract
Vi har utvecklat en BiFC teknik för att testa samspelet mellan två proteiner in vivo. Detta sker genom att dela en gul fluorescerande protein (YFP) i två icke överlappande fragment. Varje fragment är klonade i-ram till en gen av intresse. Dessa konstruktioner kan sedan samarbeta omvandlas till Nicotiana benthamiana via Agrobacterium medierad omvandling, tillåter transitering uttryck för fusionsproteiner. Blandningen av YFP signalen bara uppstår när förhöret proteiner interagerar 1-7. Att testa och validera den protein-protein interaktioner kan BiFC användas tillsammans med jäst två hybrid (Y2H) analys. Detta kan detektera indirekt interaktion som kan förbises i Y2H. Gateway-tekniken är en universell plattform som gör det möjligt för forskare att skytteltrafik genen av intresse (GOI) i lika många uttryck och funktionella system analys som möjligt 8,9. Både orienteringen och läsram kan upprätthållas utan att använda restriktionsenzymer eller ligatur för att göra uttryck redo kloner. Som ett resultat kan man eliminera alla re-sekvensering åtgärder för att säkerställa enhetliga resultat i hela experimenten. Vi har skapat en serie gateway-kompatibel BiFC och Y2H vektorer som ger forskare med enkel att använda verktyg för att utföra både BiFC och Y2H analyser 10. Här visar vi hur lätt använda vår BiFC system för att testa protein-protein interaktioner i N. benthamiana växter.
Protocol
1. Beredning av Agrobacterium kultur
- Agrobacterium stam GV3101 förvandlas tidigare med Gateway kompatibel BiFC vektor pEarleyGate201-YC och pEarleyGate202-yn, var och en innehåller en blandning konstruktion av Indiens myndigheter.
- Inokulera en 5-ml Yeb (5g L -1 Nötkött extrakt, 1g L -1 jästextrakt, 5g L -1 Peptone, 5g L -1 Sackaros, 2mm MgSO 4, pH 7,2) kultur BiFC fusionsprotein konstruerar förvandlas Agrobacterium med lämplig antibiotika val. Odla kulturen över natten vid 28 ° C skaka vid 200 rpm.
- Ta 1 ml av kulturen i en steril 1,5 ml centrifugrör.
- Pellets celler vid 1000 g under 10 minuter vid rumstemperatur, kassera supernatanten.
- Tvätta pelleten genom att tillsätta 1 ml infiltration media (5 g L -1 D-glukos, 50 mm MES (Sigma), 2 mM Na 3 PO 4, 0,1 mM acetosyringone) 11. Resuspendera pellet genom att pipettera, pellets cellerna igen vid 1000 gi 10 min.
- Upprepa tvättningen två gånger till.
- Återsuspendera pelleten i 0,5 media ml infiltration.
- Mät absorbansen vid 600 nm och justera sista OD 600 till 1,0 to 1.2.
- Fördela en lika stor mängd Agrobacterium upphängning för varje bygga in i ett nytt 1,5 ml rör, vortex i 10 sek. För en enda infiltration är 100 mikroliter av varje bygga mer än tillräckligt.
- Den Agrobacterium blandningen är nu redo för infiltration.
2. Infiltration
- N. benthamiana växter som odlas vid 21 ° C, med 16-timmar ljus och 8-timmars mörker cykler. Fem till sex veckor gamla växter bör användas för infiltration.
- Ta bort växter från tillväxt rum och plats under vitt ljus i 1 tim innan infiltratring låta klyvöppningarna till helt öppen.
- Upprätta återsuspenderade Agrobacterium blandningen i en 1-ml-slip-spets tuberkulin spruta utan nål.
- Placera toppen av injektionssprutan mot undersidan av bladen och försiktigt pressa kolven samtidigt som direkt stöder den övre sidan av bladet med ett finger. Vätskan kommer att spridas genom bladet så det fyller mesophyllar luftrum.
- Märk infiltrerade området med en tuschpenna för framtida identifiering.
- När infiltrera med olika konstruktioner, se till att antingen byta handskar eller rengöra dem med 70% etanol mellan infiltreringar. Om möjligt, lämna en HUVUDNERV utrymme mellan olika prover för att förhindra korskontaminering.
- Placera växterna i en tillväxt skåp under normala odlingsbetingelser.
3. Observation av den rekonstituerade YFP signalen
- Punktskatter en 5 mm x 5 mm segment av bladvävnad inom infiltrerat zonen
- Montera prov, i vatten, på ett glas objektglas, täck över provet med ett täckglas och undersöka samspelet med hjälp av en konfokala eller fluorescensmikroskop.
- Uttrycket bör kontrolleras var 24 timmar från det att infiltrationen upp till 5 dagar senare som över uttryck / människohandel kan resultera i fluorescerande fusionsproteiner visa flera olika platser under en tidsperiod.
4. Representativa resultat:
Ett exempel på protein-protein växelverkan testade av BiFC-analysen visas i figur 1. AtTHP1 och AtSAC3A tros vara delar av Arabidopsis homolog av jäst TREX-2 komplex. De kan interagera med en nuclearporin AtNUP1 och underlätta mRNA exporteras 10. AtTHP1 och AtSAC3A var klonade in pEarlyGate201-YC medan AtNUP1 var klonade in pEarlyGate202-yn. De konstruerar därefter förvandlades till GV3101. De tre konstruktioner var paras ihop med 3 möjliga kombinationer (AtTHP1 + AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 + AtSAC3A) för infiltration. Den rekonstituerade YFP signalen observerades under ett LCSM 48 timmar efter infiltration. De signaler som observerades i epidermala celler och lokaliserade i de nukleära periferin eller kärnvapen plasma, vilket överensstämmer med sub-cellulära lokalisering av dessa proteiner. De negativa kontrollerna visade ingen YFP signal.
Figur 1. Arabidopsis TREX-2 mRNA export komplexa komponenter interagerar med varandra. N. benthamiana löv, tillsammans förvandlas med konstruktioner av Indiens smält till pEarleyGate201-YC och pEarleyGate202-YN (som anges), var avbildas 48-72 h efter infiltration, med hjälp av en Leica TCS SP2 confocol mikroskop. Bilderna visas som slås samman konfokala YFP och ljus-fält bilder av epidermala N. benthamiana blad celler
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC-analysen är ett kraftfullt verktyg för att studera protein interaktioner. Till skillnad från den traditionella Y2H analysen BiFC inte bara tillåter visualisering av protein-protein växelverkan, men ger också mer information om proteinkomplex som sub-cellulära lokalisering. Dessutom är det möjligt att upptäcka indirekt interaktion så länge som de två kandidaten proteiner kan föras tillräckligt nära med en tredje partner. Precis som alla teknik, har BiFC sina begränsningar. På grund av kravet på molekylärt syre för fluoroforen bildning, kan BiFC inte användas i obligat anaeroba bakterier, som inte kan överleva i närvaro av syre. Detta begränsar användningen av BiFC att aeroba organismer 6. Bildandet av fluoroforen komplex är oåterkallelig. Detta förhindrar att proteiner från samspela med andra och kan störa föreningen och avståndstagande av protein komplex i dynamisk jämvikt 6. Men gör detta irreversibilitet oss också att visualisera svaga eller transitering interaktioner. Fluorescerande proteinet fragment har en begränsad förmåga att associera oberoende av de proteiner som de är smält. Man måste tillhandahålla nödvändiga och många kontroller att skilja mellan sant och falskt positiva proteininteraktioner 6. Också, som fluoroforen beredning kan uppstå på ett avstånd av 7nm eller mer, kan fluorescens komplettering tyda på antingen direkt eller indirekt interaktion. Man måste använda andra metoder såsom Y2H eller Co-Immunoprecipitation att testa exakt interaktionsvillkor 7.
För att generera tillförlitliga uppgifter, bör korrekta kontroller användas för tolkning av resultaten. Den tomma vektorer bör inte direkt användas som kontroller som de innehåller den typiska gateway fragment mellan attR1 och attR2 kassetter. Således är dessa tomma vektorer egentligen inte är "tomma". För att lösa detta problem använder vi vanligtvis ett par oberoende proteiner smält till vektorer som en kontroll. Ett annat potentiellt problem är auto-fluorescerar från växtceller, speciellt från gamla eller stressade växter. Oerfarna utredare ska först titta på ett prov från uninfiltrated zonen att bekanta sig med bakgrunden fluorescerar.
Nyligen har mer BiFC-baserade metoder utvecklats för att ytterligare utöka tillämpningar av BiFC analys för olika aspekter av proteiner, RNA-protein växelverkan 12, och DNA-hybridisering 13. Till exempel, flerfärgad BiFC och BiFC-baserade FRET (BiFC-FRET assay) har utvecklats för att identifiera och visualisera ternära komplex i levande celler 14.
Kombinationen av Gateway och BiFC är ett kraftfullt verktyg för forskare som vill förstå protein interaktioner i intakta celler. De konstruktioner som används i våra BiFC Systemet kan också användas för att generera stabila transgena växter att visualisera mer dynamisk protein interaktioner i olika vävnader och vid olika utvecklingsstadier som kanske inte observeras övergående uttryck system. Vi har bildat en HA-tagg och en flagga tagg i vår BiFC vektorer (pEarleyGate201-YC och pEarleyGate202-YN), respektive. Denna ändring gör det möjligt för olika nedströms applikationer såsom Western blotting, Co-Immunoprecipitation och samhörighet rening, osv, efter visualisering av interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Vi Nguyen för att läsa manuskriptet och allmän lab hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD Biosciences | 309602 |
References
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
- Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
- Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
- Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
- Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
- Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
- Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
- Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).
