Summary
En metode til bestemmelse af acetat kinase aktivitet er beskrevet. Denne analyse anvender en direkte reaktion til bestemmelse af enzymaktivitet og kinetik af acetat kinase i acetat-dannende retning med forskellige phosphoryl receptorer. Desuden kan metoden anvendes til analysering andre acetyl fosfat eller acetyl-CoA udnytte enzymer.
Abstract
Acetat kinase, et medlem af acetat og sukker kinase-HSP70-actin (ASKHA) enzym superfamily 1-5, er ansvarlig for reversibel phosphorylering af acetat til acetyl fosfat udnytte ATP som substrat. Acetat kinaser er allestedsnærværende i de bakterier, der findes i en slægt af Archaea, og er også til stede i mikrober af Eukarya 6. Den mest velkarakteriserede acetat kinase er, at fra den metan-producerende archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. En acetat kinase, der kun kan udnytte PP I, men ikke ATP i acetyl fosfat-dannende retning har været isoleret fra Entamoeba histolytica, det agens af dysenteri, og har hidtil kun fundet i denne slægt 15,16.
I retning af acetyl fosfat dannelse, er acetat kinase aktivitet typisk måles efter den hydroxamate assay, første gang beskrevet af Lipmann17-20, en koblet assay, hvor omdannelsen af ATP til ADP, er koblet til oxidation af NADH til NAD + ved de enzymer pyruvat kinase og laktat dehydrogenase 21,22, eller en assay måler frigivelse af uorganisk fosfat efter reaktion af acetyl fosfat produktet med hydroxylamin 23. Aktiviteten i det modsatte, er acetat-dannende retning, målt ved at koble ATP dannelsen fra ADP til en reduktion af NADP + til NADPH af enzymer hexokinase og glucose 6-phosphat dehydrogenase-24.
Her beskriver vi en metode til påvisning af acetat kinase aktivitet i retning af acetat formation, der ikke kræver kobling enzymer, men er i stedet baseret på direkte bestemmelse af acetyl fosfat forbrug. Efter den enzymatiske reaktion, der er tilbage acetyl fosfat omdannes til en ferri hydroxamate kompleks, der kan måles spektrofotometrisk, som for hydroxamate analysen. Således, i modsætning til standard koblet assay for denne retning, er afhængig af produktionen af ATP fra ADP, kan denne direkte analyse skal bruges til acetat kinaser, der producerer ATP eller PP i.
Protocol
Den overordnede opbygning af denne protokol er skitseret i figur 1.
1. Løsning Forberedelse til Standard Kurver og Analyser
- Forbered 100 ml af en 2 mol / L opløsning af hydroxylamin-HCl. Der afvejes 13,9 g hydroxylamin hydrochlorid (MW 69,49 g / mol) og opløses i 50 ml destilleret, demineraliseret vand (Hedeselskabet 2 O). Justér pH til 7,0 ved hjælp af kaliumhydroxid piller eller en koncentreret opløsning. Bring den endelige volumen til 100 ml. Løsningen kan opbevares ved stuetemperatur i op til 30 dage eller ved 4 ° C i op til 90 dage.
- Forbered 100 ml af en ferrichlorid / saltsyre. Der afvejes 13,5 g ferrichlorid (MW 270,32 g / mol) og opløses i ca 50 mL Hedeselskabet 2 O. Tilføj 41,3 mL koncentreret saltsyre (12,1 mol / L) og bringe til et endeligt volumen på 100 ml. Den endelige koncentration af ferrichlorid vil være 0,5 mol / L og den endelige koncentration af saltsyre vil være 5 mol/ L. Løsningen er opbevaret ved stuetemperatur.
- Forbered 100 ml af en 1,84 mol / L opløsning af trichoroacetic syre. Der afvejes 30,0 g trichloreddikesyre (MW 163,39 g / mol), opløses i Hedeselskabet 2 O og bringe det endelige volumen til 100 ml. Løsningen er opbevaret ved stuetemperatur.
- Forbered 5 ml af en 0,1 mol / L acetyl fosfat løsning. Der afvejes 0,092 g acetyl fosfat (MW 184,06 g / mol), opløses i Hedeselskabet 2 O og bringe det endelige volumen til 5 ml. Alikvot løsningen på mikrocentrifugerør (0,25 mL pr rør) og fryses ved -20 ° C indtil brug. Optøede opløsning bør placeres på is og kan bruges i ca 1 time. Acetyl fosfat løsning, der er blevet optøet, bør ikke genfryses og genbruges.
- Forbered 5 ml af en 0,1 mol / L opløsning af ADP. Afvejes 0,24 g af ADP (MW 472,5 g / mol), opløses i Hedeselskabet 2 O, og bringe det endelige volumen til 5 ml. Alikvot løsningen i mikrocentrifugerør (0,5 mL pr rør) og fryses ved -20 ° C, indtilbrug. Hold optøede løsning på is indtil brug.
- Forbered 50 ml 1 mol / L opløsning af Tris. Afvejes 6,06 g Tris (MW 121,14 g / mol), og de opløses i 40 ml Hedeselskabet 2 O. Juster pH i opløsningen til 7,0 ved hjælp af saltsyre og bringe endelige rumfang på 50 ml. Butiksløsning ved stuetemperatur.
- Forbered 10 ml af en 1 mol / L magnesiumchlorid løsning. Afvejes 2,03 g magnesiumchlorid (MW 203,31 g / mol), opløses i Hedeselskabet 2 O, og bringe den endelige volumen til 10 ml. Oploesningen opbevares ved stuetemperatur.
- Forbered 25 ml udvikling løsning ved at blande lige store mængder af ferrichlorid / saltsyreopløsning og trichloreddikesyreopløsning. Udvikling opløsning bør forberedes frisk hver dag og opbevares ved stuetemperatur.
2. Udarbejdelse af en Acetyl Fosfat standardkurve
- En acetyl fosfat standardkurve genereres ved hjælp af kendte mængder af acetyl fosfat. En standard kurve af seks til eight punkter er passende. De standarder, der bør ligge fra 0,03 μmoles til 0,9 μmoles pr 300 μL, som korrelerer til den endelige koncentrationer på 0,1 til 3 mmol / L. Fortynd acetyl fosfat stamopløsning til de relevante koncentrationer i 100 mM Tris løsning i en endelige volumen på 300 μL. En kontrolprøve uden acetyl fosfat bør også være forberedt.
- Inkuber hver standard og kontrol ved 37 ° C i en varmeblok i 1 minut.
- Tilsæt 50 μL af hydroxylamin hydrochlorid løsning til hver standard og kontrol og bland ved at ryste tre gange. Placer standard ind i en 60 ° C varmeblok og inkuber i fem minutter.
- Tilsæt 100 μL af udviklingen løsning til de standarder og kontrol, bland ved at ryste tre gange, og lad farven udvikle sig i mindst ét minut ved stuetemperatur.
- Centrifuge alle standarder og kontrol i en mikrocentrifuge ved 18.000 xg i 1 minut.
- Mål prøver spektrofotometrisk ent 540 nm ved hjælp af 1ml plast kuvetter ved hjælp af kontrol som den tomme for spektrofotometri.
- Generer en standardkurve ved hjælp af relevante data analyse og graftegning software (f.eks Kaleidagraph, Synergy Software). R 2-værdier på 0,99 eller større er ønskelige. De data, der afsættes som absorbans ved 540 nm versus μmoles af acetyl fosfat til stede.
3. Assay for acetat kinase aktivitet
- Ved hjælp af de beskrevne løsninger, en reaktionsblanding indeholdende en endelig koncentration på 0,1 mol / L Tris-buffer, 10 mmol / L magnesiumchlorid, 5 mmol / L ADP, og 2 mmol / L acetyl fosfat forberede sig. En 10 ml reaktionsblandingen vil kræve 8,2 mL Hedeselskabet 2 O, 1,0 mL Tris løsning, 0,1 mL magnesiumkloridopløsning, 0,5 mL ADP-løsning, og 0,2 mL acetyl fosfat løsning. Fordel reaktionsblandingen i 300 μl portioner til mikrocentrifugerør. Til bestemmelse af kinetiske parametre og optimering af substrat koncentrationer, kan man substratvarieret og den anden holdes på et konstant koncentration i reaktionerne.
- Pre-inkubér reaktionerne i 1 minut ved 37 ° C i en varmeblok.
- Tilføj en ønskede mængde enzym til reaktionen og straks returnere røret til 37 ° C varme blok. Også omfatte en kontrol reaktion, som ingen enzym er tilføjet. Hvis flere reaktioner er udført, skal du tilføje enzym til rørene til bestemte tidsintervaller. Vær sikker på at holde styr på tiden. (BEMÆRK: Den mængde enzym, der skal anvendes, skal optimeres for at sikre, at alle de acetyl fosfat eller ADP substrat ikke vil være udtømt - se diskussionen afsnit)
- Efter 5 minutter tilsættes 50μl af hydroxylamin hydrochlorid løsning til hver enkelt reaktion og kontrol, bland, og placer rørene i en 60 ° C varme blok. Hvis flere reaktioner udføres på, skal det gøres på samme tidsinterval som enzymet blev tilføjet.
- Inkubér de reaktioner og kontrol i 5 minutter ved 60 ° C.
- Tilsæt 100 &MU, L af udviklingen løsning til hver enkelt reaktion og kontrol, mikse og sted i et rør rack på laboratoriearbejdet. Man lader farven udvikle sig i mindst 1 minut.
- Centrifuge alle rør i en mikrocentrifuge ved 18.000 xg i 1 minut.
- Mål prøver spektrofotometrisk ved 540 nm med 1ml plast kuvetter og bestemme mængden af acetyl fosfat til stede i forhold til acetyl fosfat standardkurven.
- Mængden af acetyl fosfat udtømte substrat kan bestemmes ved at fratrække mængden af acetyl fosfat tilbage efter den enzymatiske reaktion fra mængden af acetyl fosfat til stede i kontrolgruppen mangler enzymet. Udføre analyse af data ved hjælp af passende data og grafer software (f.eks Kaleidagraph, Synergy Software). R 2-værdier på mere end 0,97 er ønskelige.
4. Repræsentative resultater:
Formålet med denne analyse er at måle acetat kinase aktivitet i den direkteion af acetat dannelse. Dette gøres ved at måle forbruget af acetyl fosfat substrat, da der ikke er let, direkte måling for acetat produktion. Acetyl fosfat tilbage efter en given tid under den enzymatiske reaktion omdannes til acetyl hydroxamate og senere til jern hydroxamate kompleks, der har en rødlig farve (figur 2), som kan måles ved 540 nm. Standardkurven plotte absorbansen versus μmoles acetyl fosfat findes i de standarder, der anvendes til at bestemme mængden af acetyl fosfat tilbage i hver reaktion. Standardkurven skal være lineær gennem nulpunktet. En repræsentant standardkurve er vist i figur 3 har en hældning på 1,2332 absorbans enheder pr μmole acetyl fosfat til stede, og en R 2-værdi på 0,99, hvilket indikerer de data passer den lineære ligning godt. Ligningen for den lineære passer til den standard kurve data bliver brugt til at beregne den mængde af acetyl fosfat tilbage i reaktionen. Den μmolesaf acetyl forbruges phosphat bestemmes som forskellen mellem den μmoles af acetyl fosfat til stede i kontrolgruppen reaktionen mangler enzymet og μmoles af acetyl fosfat tilbage efter den enzymatiske reaktion.
Renset, rekombinant M. thermophila acetat kinase blev analyseret ved hjælp af den beskrevne protokol. For forsøget vist i figur 4, var koncentrationen af ADP holdes konstant på 5 mmol / L og koncentrationen af acetyl fosfat i reaktionen blev varieret til at bestemme K m for acetyl fosfat. Som forventet, dette eksperiment viser, at enzymet følger standarden Michaelis-Menten-lignende kinetik for hvert substrat og produceret en hyperbolsk mætningskurve Når du indsætter aktivitet versus acetyl fosfat koncentration. Den tilsyneladende K m værdi for acetyl fosfat på 0,27 ± 0,01 mmol / L, der tåler sammenligning med de offentliggjorte K m værdi på 0,47 ± 0,01 mmol / L ved hjælp af tilkobles såsiger 13.
Den direkte analyse kan også bruges til at måle aktiviteten af acetat kinaser, der udnytter substrater andre end ATP, hvilket ikke er muligt ved hjælp af standard koblet analysen. Renset rekombinant E. histolytica acetat kinase 16, som producerer PP jeg hellere end ATP i acetat-dannende retning, blev udsat for denne analyse ved hjælp af natrium fosfat i stedet for ADP. Koncentrationen af natrium fosfat i reaktionen blev holdt konstant på 0,2 mol / L og acetyl fosfat koncentrationen blev varieret. Med hensyn til M. thermophila acetat kinase, E. histolytica acetat kinase fulgte Michaelis-Menten-lignende kinetik for acetyl fosfat og en hyperbolsk mætningskurve blev observeret (figur 5). Den tilsyneladende K m værdi for acetyl fosfat var 0,50 ± 0,006 mmol / L. Reeves og Guthrie 15 fastlagt en K m værdi på 0,06 mmol / L for acetyl fosfat for de indfødte enzym, hvordan nogensinde, var deres enzym kun delvist renset og deres analyse omfattede fire kobling enzymer, som også blev kun delvist renset. Det er således vanskeligt direkte at sammenligne disse værdier.
Protokol Scheme
- Generer en acetyl fosfat standardkurve
- Fortynd enzym til den ønskede koncentration
- Forbered reaktionsblandingen og alikvot 300 mikroliter med mikrocentrifugerør
- Preincubate reaktioner ved 37 ° C i 1 minut
- Start reaktioner ved at tilsætte enzymer til bestemte tidsintervaller
- Tilføj hydroxylamin med samme intervaller for at stoppe reaktioner og inkuberes ved 60 ° C i 5 minutter
- Tilføj ferrichlorid / trichloreddikesyreopløsning for farveudvikling
- Centrifugerør ved 18.000 xg i 1 minut
- Mål absorbans ved 540 nm
- Bestem mængden af acetyl forbruges fosfat i forhold til standardkurve
tp_upload/3474/3474fig1.jpg "/>
Figur 1. Protokol Scheme
Figur 2. Acetyl fosfat standarder. Stigende koncentrationer af acetyl fosfat blev reageret med hydroxylamin og farver blev udviklet som beskrevet. Styringen mangler acetyl fosfat er lys gul og reaktioner, som indeholder stigende mængder af acetyl fosfat er successivt mørkere i farven. Denne farve ændring måles ved 540 nm.
Figur 3. Sample acetyl fosfat standardkurve. Varierende mængder af acetyl fosfat blev reageret med hydroxylamin samt farveudviklingen løsning, og absorbansen blev målt ved 540 nm. Absorbansen ved 540 nm versus μmoles acetyl fosfat var plottet og en lineær fit til data blev anvendt. </ P>
Figur 4. Udnyttelse af acetyl fosfat fra ATP-producerende M. thermophila acetat kinase. Enzymatiske aktivitet blev bestemt i retning af acetat dannelse i overværelse af 5 mmol / L ADP med varierende koncentrationer af acetyl fosfat. Mængden af acetyl fosfat forbruges blev bestemt som forskellen mellem grundbeløbet for acetyl fosfat i reaktion og størrelsen af acetyl fosfat tilbage efter den enzymatiske reaktion. Analyser blev udført i tre eksemplarer med fejl, der vises.
Figur 5. Udnyttelse af acetyl fosfat af PP i-producerende E. histolytica acetat kinase. Enzymatiske aktivitet i retning af acetat dannelse blev bestemt ved tilstedeværelse af 0.2 mol / L natriumfosfat med varierende koncentrationer af acetyl fosfat. Mængden af acetyl fosfat forbruges blev bestemt som forskellen mellem grundbeløbet for acetyl fosfat i reaktion og størrelsen af acetyl fosfat tilbage efter den enzymatiske reaktion. Analyser blev udført i tre eksemplarer med fejl, der vises.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Påvisning af acetyl fosfat i denne test er afhængig af en tilstrækkelig koncentration af hydroxylamin hydrochlorid og koncentrationen og surhedsgrad ferrichloridopløsning. Ændring af analysen volumen vil kræve en revurdering af begge disse komponenter. Den enzymatiske reaktioner beskrevet her blev udført ved 37 ° C med hydroxylamin opsigelse udføres ved 60 ° C i 5 minutter. Denne højere temperatur er afgørende for at muliggøre en hurtig konvertering af de resterende acetyl fosfat til acetyl hydroxamate. Timingen af farveudviklingen skridt og måling af absorbans er mindre kritisk, og kan ske på så lidt som 5 minutter og op til 15 minutter efter tilsætning af hydroxylamin løsning. Prøverne skal centrifugeres, før du læser den absorbans, som surhedsgrad af prøven kan føre til udfældning af enzymet og kan producere en falsk høj værdi på grund af uklarhed i stedet for faktiske farveskift.Fordeling af de udviklede reaktioner vil begynde at opstå efter 10-15 minutter.
De primære komplikationer af denne analyse for behandlingen af enzymkinetik er fastsættelsen af den mængde enzym til at bruge og længden af tid til at køre det første trin i reaktionen. Disse skal bestemmes empirisk for hvert enzym, således at aktivitetsniveauet ikke er så høj, at alle de acetyl fosfat substrat forbruges. Omhyggelig opmærksomhed bør gives til den procent acetyl fosfat forbruget for hver reaktion punkt i en kinetisk kurve. Generelt bør lavere koncentrationer af de forskellige komponent på en kinetisk kurve resultere i acetyl fosfat forbrug op til 90 procent eller lidt over, mens forbruget af acetyl fosfat på mætte underlaget koncentrationer bør nærme sig 10 procent eller lidt mindre. Når enzymet koncentrationen er optimeret, kan underlaget interval for bestemmelse af kinetiske konstanter Derefter bestemmes.
Porrige metoder til måling af acetat kinase aktivitet i acetat-dannende retning indebar brug af koblede analyser. Disse metoder er problematiske i forhold til kinetiske beregninger på grund af afhængighed af aktiviteten af koblingen enzym (r), hvis assay forhold (pH, ionisk styrke, temperatur, osv.) kan være uforenelig med de optimale analyse betingelser for enzymet af interesse . Desuden kan brugen af en direkte analyse af undersøgelser med hæmmere undgå spørgsmål, der kunne opstå ved hæmning af koblingen enzymer. Alt i alt bør denne analyse være nyttigt, ikke kun for acetat kinase, men for noget enzym, der bruger acetyl fosfat eller andet aktiveret kortkædede acyl substrater, såsom acetyl-eller propionyl-CoA, propionyl fosfat, og acetyl-AMP, som alle er reaktive med hydroxylamin. I disse tilfælde vil standardkurve blive genereret med de relevante acyl substrat i stedet for med acetyl fosfat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NSF pris # 0920274 og South Carolina Experiment Station Project (SC-1700340) til KSS. Dette papir er teknisk bidrag nr. 5929 af Clemson University Experiment Station.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma-Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | M33 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | I88 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Thermo Fisher Scientific, Inc. | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
References
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases. Protein Sci. 2, 31-40 (1993).
- Buss, K. A. Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases. J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).
- Hurley, J. H. The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).
- Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70. Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Aceti, D. J., Ferry, J. G. Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis. J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).
- Latimer, M. T., Ferry, J. G. Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).
- Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).
- Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).
- Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).
- Ingram-Smith, C. Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase. J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).
- Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).
- Gorrell, A., Ferry, J. G. Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching. Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).
- Reeves, R. E., Guthrie, J. D. Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica. Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).
- Fowler, M. L. Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica. , Forthcoming (2011).
- Lipmann, F. Enzymatic synthesis of acetyl phosphate. J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).
- Lipmann, F., Tuttle, L. C. A specific micromethod for determination of acyl phosphates. J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).
- Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction. J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).
- Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. Enzymatic phosphorylation of acetate. J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).
- Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation. Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).
- Clarke, P. M., Payton, M. A. An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants. Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).
- Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate. Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).
- Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus. J. Biochem. 84, 193-203 (1978).
