Summary
Метод определения активности киназы ацетат описывается. Этот тест использует прямой реакции для определения активности ферментов и кинетики ацетат киназа в ацетат формирования направления с различными фосфорильной акцепторов. Кроме того, этот метод может быть использован для опробования других ацетил фосфата или ацетил-КоА использованием ферментов.
Abstract
Ацетат киназа, член ацетат киназа и сахар-Hsp70-актина (ASKHA) ферментов суперсемейства 1-5, несет ответственность за обратимое фосфорилирование ацетата в ацетил фосфат использования АТФ в качестве подложки. Ацетат киназа повсеместно распространены в бактерии, найденные в один род археи, а также присутствуют в микробы Eukarya 6. Наиболее хорошо охарактеризованы ацетат киназа является то, что от метанобразующих archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. Ацетат киназа, которые могут только использовать PP я, но не СПС в направлении ацетил-фосфат формирования был изолирован от Entamoeba histolytica, возбудитель амебной дизентерии, и до сих пор только были найдены в этом роде 15,16.
В направлении ацетил формирование фосфат, ацетат киназа деятельности, как правило, измеряется с помощью гидроксамата анализа, впервые описанный Липмана17-20, связанной тест, в котором превращение АТФ в АДФ связан с окислением NADH в NAD + киназой ферментов пируват и лактат дегидрогеназы 21,22, или анализ измерений релиз неорганического фосфата после реакции ацетил продукта фосфат гидроксиламином 23. Деятельность в противоположном, ацетат формирования направлении измеряется связь образования АТФ из АДФ с сокращением НАДФ + до NADPH ферментами гексокиназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 24.
Здесь мы опишем метод обнаружения ацетат киназа деятельность в направлении ацетат образование, которое не требует связи ферментов, но вместо этого на основе прямого определения ацетил потребление фосфата. После ферментативной реакции, оставаясь ацетил фосфат превращается в комплекс железа гидроксамата который может быть измерен спектрофотометрически, как и для гидроксамата анализа. Таким образом, в отличие от улandard связан анализ на этом направлении, который зависит от производства АТФ из АДФ, это прямой анализ может быть использован для ацетат киназа, которые производят АТФ или PP я.
Protocol
Общая схема этого протокола описана на рисунке 1.
1. Приготовления раствора для стандартных кривых и анализы
- Подготовка 100 мл 2 моль / л раствора гидроксиламина-HCl. Взвесьте из 13,9 г гидрохлорида гидроксиламина (МВт 69,49 г / моль) и растворяют приблизительно в 50 мл дистиллированной деионизированной воды (DDH 2 O). Отрегулируйте рН до 7,0 применении калия гидроксид гранулы или концентрированный раствор. Принесите конечный объем до 100 мл. Раствор можно хранить при комнатной температуре в течение 30 дней или при температуре 4 ° С в течение 90 дней.
- Подготовка 100 мл хлорного железа / раствор соляной кислоты. Взвесьте из 13,5 г хлорида железа (МВт 270,32 г / моль) и растворить в 50 мл примерно DDH 2 O. Добавить 41,3 мл концентрированной соляной кислоты (12,1 моль / л) и доводят до конечного объема 100 мл. Конечная концентрация хлорида железа будет 0,5 моль / л и конечной концентрации соляной кислоты будет 5 моль/ Л Решение хранится при комнатной температуре.
- Подготовка 100 мл 1,84 моль / л решение trichoroacetic кислоты. Взвесьте из 30,0 г трихлоруксусной кислоты (МВт 163,39 г / моль), растворяются в DDH 2 O и принести окончательный объем до 100 мл. Решение хранится при комнатной температуре.
- Подготовка 5 мл 0,1 моль / л ацетил решение фосфата. Взвесьте из 0,092 г ацетил фосфат (МВт 184,06 г / моль), растворяются в DDH 2 O и принести окончательный объем до 5 мл. Алиготе решение микроцентрифужных труб (0,25 мл на трубе) и заморозить при температуре -20 ° C до использования. Талая решения должны быть помещены на лед и может быть использован в течение примерно 1 часа. Ацетил раствора фосфата, которая была талой не следует замораживать и использовать повторно.
- Подготовка 5 мл 0,1 моль / л раствор АДФ. Взвесьте из 0,24 г ADP (МВт 472,5 г / моль), растворяются в DDH 2 O, и принести окончательный объем до 5 мл. Алиготе решение в микроцентрифужных пробирок (0,5 мл на пробирку) и заморозить при температуре -20 ° С доиспользования. Держите талой решение по льду до использования.
- Подготовка 50 мл 1 моль / л раствора Трис. Взвесьте из 6,06 г трис (МВт 121,14 г / моль) и растворить в 40 мл DDH 2 O. Отрегулируйте рН раствора до 7,0 соляной кислоты и довести до конечного объема 50 мл. Магазин раствора при комнатной температуре.
- Подготовка 10 мл 1 моль / л раствора хлорида магния. Взвесьте из 2,03 г хлористого магния (МВт 203,31 г / моль), растворяются в DDH 2 O, и принести окончательный объем до 10 мл. Храните раствор при комнатной температуре.
- Подготовка 25 мл разработки решений путем смешивания равных объемов хлорного железа / раствор соляной кислоты и трихлоруксусной кислоты. Развитие решения должны быть подготовлены свежие каждый день, и хранить при комнатной температуре.
2. Подготовка ацетил Кривая Стандартный фосфат
- Ацетил кривой стандартного фосфат генерируется с использованием известные количества ацетил фосфата. Калибровочной кривой от шести до восемнадцатит точках подходит. Стандарты должны диапазоне от 0,03 до 0,9 мкмоля мкмоля на 300 мкл, которая коррелирует с конечной концентрации от 0,1 до 3 ммоль / л Развести ацетил маточного раствора фосфата в соответствующей концентрации в 100 мМ Трис решение в конечном объеме 300 мкл. Контрольный образец без ацетил фосфат также должны быть готовы.
- Инкубируйте каждого стандарта и контроля при температуре 37 ° С в тепло блока в течение 1 минуты.
- Добавить 50 мкл раствора гидроксиламина гидрохлорида для каждого стандарта и контроля и перемешать путем встряхивания в три раза. Место стандарта в 60 ° C тепла блока и инкубировать в течение пяти минут.
- Добавить 100 мкл решение для разработки стандартов и контроля, перемешать путем встряхивания в три раза, и позволяют цвет развиваться, по крайней мере одной минуты при комнатной температуре.
- Центрифуга всех стандартов и контроля в микроцентрифужных при 18000 мкг на 1 минуту.
- Мера образцы спектрофотометрическит 540 нм, используя 1 мл пластиковых кювет с помощью контроля, как пустым для спектрофотометрии.
- Создание калибровочной кривой с использованием соответствующих анализа данных и графическое программное обеспечение (например, Kaleidagraph, Synergy Software). R 2 значения 0,99 и более желательны. Данные на графике как поглощение при 540 нм по сравнению с мкмоля ацетил настоящее фосфата.
3. Анализ для ацетат активность киназы
- Использование решений, описанных, готовят реакционную смесь содержащую до конечной концентрации 0,1 моль / л трис-буфер, 10 ммоль / л хлорида магния, 5 ммоль / л АДФ, и 2 ммоль / л ацетил фосфата. 10 мл реакционной смеси потребуется 8,2 мл DDH 2 O, 1,0 мл трис решение, 0,1 мл раствора хлорида магния, 0,5 мл ADP решение, и 0,2 мл раствора фосфата ацетил. Распределите реакционную смесь в 300 мкл аликвоты в микроцентрифужных труб. Для определения кинетических параметров и оптимизации концентрациях субстрата, одной подложке может бытьразнообразны и других состоялось в постоянной концентрации в реакциях.
- Предварительно инкубировать реакций в течение 1 минуты при температуре 37 ° С в тепло блоку.
- Добавить необходимое количество фермента в реакции и немедленно вернуть трубку к 37 ° C тепла блока. Кроме того, включать контроль реакции на которых не фермент добавляется. Если несколько реакций выполняются, добавляют фермент трубы через определенные промежутки времени. Будьте уверены, чтобы следить за временем. (ПРИМЕЧАНИЕ: количество фермента, который будет использоваться должны быть оптимизированы, чтобы убедиться, что все ацетил фосфата или АДФ субстрат не будет исчерпан - см. раздел Обсуждение)
- Через 5 минут, добавить 50 мкл раствора гидрохлорида гидроксиламина к каждой реакции и контроля, перемешать и поместить пробирки в блок 60 ° C тепла. Если несколько реакций, которые выполняются, то это должно быть сделано в тот же промежуток времени, как был добавлен фермент.
- Инкубируйте реакции и контроль в течение 5 минут при 60 ° C.
- Добавить 100 &му, L развития раствора в каждую реакцию и контроля, перемешать и поместить в пробирку стойку на лабораторном столе. Разрешить цвет развиваться, по крайней мере 1 минуту.
- Центрифуга всех труб в микроцентрифужных при 18000 мкг на 1 минуту.
- Мера образцы спектрофотометрически при 540 нм, используя 1 мл пластиковых кювет и определить количество ацетил настоящее фосфатов в сравнении с ацетил кривой стандартного фосфата.
- Количество ацетил подложки фосфат обедненного может быть определена путем вычитания количества ацетил фосфат оставшиеся после ферментативной реакции от количества ацетил фосфата присутствует в управление не хватает фермента. Выполнить анализ данных с использованием соответствующих данных и графическое программное обеспечение (например, Kaleidagraph, Synergy Software). R 2 значения большего, чем 0,97 желательны.
4. Представитель Результаты:
Цель этого анализа состоит в измерении деятельности ацетат киназа в прямомиона ацетата образования. Это делается путем измерения потребления ацетил подложки фосфат, как не существует простого, прямого измерения для ацетата производства. Ацетил фосфат оставшееся после данного времени, в течение ферментативных реакций превращается в ацетил гидроксамата а затем железа комплекс гидроксамата, которая имеет красноватый цвет (рис. 2), что может быть измерено при 540 нм. Стандартная кривая заговоре против поглощения мкмоля ацетил настоящее фосфатов в стандартах используется для определения количества ацетил фосфат, оставшихся в каждой реакции. Стандартная кривая должна быть линейной через нулевую точку. Представитель стандартной кривой, изображенной на рисунке 3 имеет наклон 1,2332 поглощения единиц в мкмоль ацетил настоящее фосфата и R 2 значение 0,99, что указывает на данные соответствуют линейные уравнения хорошо. Уравнение для линейного подходят к стандартным данным кривая используется для расчета количества ацетил фосфат, оставшихся в реакции. Мкмоляацетил-фосфат потребляется определяется как разница между мкмоля ацетил фосфата присутствует в контрольной реакции не хватает ферментов и мкмоля ацетил-фосфат оставшиеся после ферментативной реакции.
Очищенная, рекомбинантный М. thermophila ацетат киназа была проверена использованием описанного протокола. Для эксперимента показано на рисунке 4, концентрация АДФ была проведена постоянными на 5 ммоль / л и концентрация ацетил фосфата в реакции разнообразны, чтобы определить м К ацетил фосфата. Как и ожидалось, этот эксперимент показывает, что фермент следующим стандартным Михаэлиса-Ментен типа кинетики для каждого субстрата и производится гиперболической кривой насыщения при построении деятельности по сравнению с ацетил концентрации фосфатов. К очевидным м значение ацетил фосфата 0,27 ± 0,01 ммоль / л, которые выгодно отличаются от опубликованных К м значение 0,47 ± 0,01 ммоль / л использованием связаны какговорят 13.
Прямой анализ также может быть использован для измерения активности ацетат киназа, которые используют субстраты, кроме АТФ, которое не возможно при использовании стандартных связаны анализа. Очищенный рекомбинантный Е. histolytica ацетат киназа 16, которые производит PP я, а не АТФ в ацетат формирования направлении, был подвергнут этой методом с использованием фосфат натрия вместо ADP. Концентрации фосфата натрия в реакции был проведен постоянными на 0,2 моль / л и ацетил концентрации фосфатов была различной. Что касается М. thermophila ацетат киназа, Е. histolytica ацетат киназа следуют Михаэлиса-Ментен типа кинетики для ацетил фосфата и гиперболической кривой насыщения не наблюдалось (рис. 5). К очевидным м значение ацетил фосфата 0,50 ± 0,006 ммоль / л Ривз и Гатри 15 определяется значение К м на 0,06 ммоль / л для ацетил фосфатов для нативного фермента, как Однако их фермент был лишь частично очищенный и их анализе принимали участие четыре связи ферменты, которые были лишь частично очищают. Таким образом, трудно напрямую сравнивать эти значения.
Протокол Схема
- Создание ацетил кривой стандартного фосфат
- Развести фермента желаемой концентрации
- Подготовка реакционной смеси и аликвоту 300 мкл до микроцентрифужных труб
- Preincubate реакции при 37 ° С в течение 1 минуты
- Начало реакции путем добавления фермента через определенные промежутки времени
- Добавить гидроксиламин с той же периодичностью, чтобы остановить реакцию и инкубировать при температуре 60 ° С в течение 5 минут
- Добавить хлорид железа / трихлоруксусной кислотой для проявления цвета
- Пробирки центрифужные на 18 000 мкг в течение 1 минуты
- Мера абсорбции при 540 нм
- Определить количество ацетил фосфатов потребляется в сравнении с калибровочной кривой
tp_upload/3474/3474fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Протоколом схема
Рисунок 2. Ацетил стандартов фосфата. Повышение концентрации ацетил фосфатов реагирует с гидроксиламином и цвет был разработан, как описано. Контроль отсутствует ацетил фосфат ярко-желтый, и реакции содержащие большее количество ацетил фосфат последовательно более темный цвет. Это изменение цвета измеряется при 540 нм.
Рисунок 3. Пример ацетил кривой стандартного фосфата. Варьируя количество ацетил фосфатов реагирует с гидроксиламином и цветовое решение развития и поглощения измеряли при 540 нм. Оптическую плотность при 540 нм по сравнению с мкмоля ацетил фосфатов была построена и линейные нужным данных был применен. </ P>
Рисунок 4. Использование ацетил фосфата АТФ-производители М. thermophila ацетат киназа. Активность фермента определяли в направлении ацетат образования в присутствии 5 ммоль / л АДФ с различными концентрациями ацетил фосфата. Количество потребляемой ацетил фосфата определяется как разница между начальной количество ацетил фосфата в реакции и количество ацетил фосфат оставшиеся после ферментативной реакции. Анализы проводились в трех экземплярах с ошибками показано на рисунке.
Рисунок 5. Использование ацетил фосфатов PP я производящих E. histolytica ацетат киназа. Ферментативная активность в направлении ацетат образованию был определен в присутствии 0.2 моль / л фосфата натрия с различными концентрациями ацетил фосфата. Количество потребляемой ацетил фосфата определяется как разница между начальной количество ацетил фосфата в реакции и количество ацетил фосфат оставшиеся после ферментативной реакции. Анализы проводились в трех экземплярах с ошибками показано на рисунке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Обнаружение ацетил фосфатов в этом анализе, зависит от концентрации, достаточной гидрохлорида гидроксиламина и концентрацию и кислотность раствора хлорного железа. Внесение изменений в анализе объема потребует пересмотра этих двух компонентов. Ферментативные реакции, описанные здесь проводились при температуре 37 ° C с прекращением гидроксиламин осуществляется при температуре 60 ° С в течение 5 минут. Это более высокая температура имеет решающее значение для обеспечения быстрого превращения оставшегося ацетил фосфата до ацетил гидроксамата. Сроки шаг цвета развития и измерения оптической плотности менее критична, и может быть выполнена всего за 5 минут и до 15 минут после добавления раствора гидроксиламина. Образцы должны быть центрифугировали перед чтением поглощения, так как кислотность образца может привести к выпадению фермент и может давать ложно высокие значения из-за мутности, а не фактическое изменение цвета.Распределение разработаны реакции начнет происходить после 10-15 минут.
Первичные осложнения этого анализа для изучения кинетики фермента определения количества фермента в использовании и времени для запуска первой стадии реакции. Они должны быть определены эмпирически для каждого фермента, что уровень активности не столь высок, что все ацетил подложки фосфатов потребляется. Пристальное внимание должно быть уделено процентов ацетил потребление фосфатов для каждой реакции точке кинетической кривой. Как правило, более низкие концентрации разнообразных компонент кинетической кривой должно привести к ацетил потребление фосфата до 90 процентов или чуть выше, а потребление ацетил-фосфата в концентрации насыщения при нанесении должна подходить на 10 процентов или чуть меньше. Как только концентрация фермента оптимизирована, подложки диапазон для определения кинетических констант может быть определено.
Previous методы измерения активности ацетат киназа в ацетат формирования направление связано с использованием связанных анализов. Эти методы являются проблематичными в отношении кинетических расчетов в связи с зависимостью от активности фермента связи (ы), чей анализ условий (рН, ионной силы, температуры и т.д.) могут быть несовместимы с оптимальными условиями для анализа фермент интерес . Кроме того, использование прямого анализа для исследований с ингибиторами может избежать проблем, которые могут возникнуть в результате ингибирования ферментов связи. В целом, результаты анализа должны быть полезны не только для ацетат киназа, но и для любой фермент, который использует ацетил фосфата или других активированных короткой цепи ацил основания, такие как ацетил-или пропионил-КоА, пропионил фосфат, и ацетил-AMP, все из которых являются реактивными с гидроксиламином. В этих случаях стандартная кривая будет сгенерирован с соответствующим субстратом ацил, а не с ацетил фосфата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NSF награду # 0920274 и Южной Каролине опытная станция проекта (SC-1700340) до KSS. Эта статья технический вклад номер 5929 от опытная станция Университет Клемсона.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma-Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | M33 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | I88 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Thermo Fisher Scientific, Inc. | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
References
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases. Protein Sci. 2, 31-40 (1993).
- Buss, K. A. Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases. J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).
- Hurley, J. H. The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).
- Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70. Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Aceti, D. J., Ferry, J. G. Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis. J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).
- Latimer, M. T., Ferry, J. G. Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).
- Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).
- Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).
- Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).
- Ingram-Smith, C. Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase. J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).
- Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).
- Gorrell, A., Ferry, J. G. Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching. Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).
- Reeves, R. E., Guthrie, J. D. Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica. Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).
- Fowler, M. L. Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica. , Forthcoming (2011).
- Lipmann, F. Enzymatic synthesis of acetyl phosphate. J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).
- Lipmann, F., Tuttle, L. C. A specific micromethod for determination of acyl phosphates. J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).
- Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction. J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).
- Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. Enzymatic phosphorylation of acetate. J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).
- Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation. Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).
- Clarke, P. M., Payton, M. A. An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants. Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).
- Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate. Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).
- Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus. J. Biochem. 84, 193-203 (1978).
