Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Blød Litografiske funktionalisering og mønster oxydfri silicium og germanium

doi: 10.3791/3478 Published: December 16, 2011

Summary

Her beskriver vi en simpel metode til at mønstret oxydfri silicium og germanium med reaktive organiske monolag og demonstrere funktionalisering af mønstrede substrater med små molekyler og proteiner. Den fremgangsmåde er helt beskytter overflader mod kemisk oxidation, giver præcis kontrol over funktionen morfologi, og giver let adgang til kemisk diskrimineret mønstre.

Abstract

Udviklingen af ​​hybride elektroniske apparater beror i høj grad om integration af (bio) organiske materialer og uorganiske halvledere gennem en stabil interface, der tillader en effektiv elektron transport og beskytter underliggende underlag mod oxidativ nedbrydning. Gruppe IV halvledere effektivt kan beskyttes med yderst bestilles selv-samlet monolag (SAM), der består af enkle alkylkæder, der fungerer som uigennemtrængelige barrierer for både organiske og vandige opløsninger. Simple alkyl Sams, dog er inaktive og ikke gøres til genstand for traditionelle mønster teknikker. Motivationen for at immobilisere organiske molekylære systemer på halvledere er at bibringe ny funktionalitet til overfladen, som kan levere optiske, elektroniske og mekaniske funktion, samt kemiske og biologiske aktivitet.

Microcontact udskrivning CP) er en blød-litografisk teknik til mønstret SAM på utallige overflader. 1-9 trods af sin forenkletlige foranstaltninger og alsidighed, har den tilgang, været stort set begrænset til ædle metal overflader og har ikke været godt udviklet til mønster overførsel til teknologisk vigtige substrater, såsom oxydfri silicium og germanium. Hertil kommer, fordi denne teknik er afhængig af blæk diffusion at overføre mønsteret fra elastomer til underlaget, er løsningen af sådanne traditionelle print det væsentlige er begrænset til i nærheden af 1 μ m. 10-16

I modsætning til traditionelle print, afhængig inkless μ CP mønster på en specifik reaktion mellem en overflade-immobiliseret substrat og et stempel-bundet katalysator. Fordi teknikken ikke er afhængig af diffusiv SAM dannelse, det i høj grad udvider mangfoldigheden af ​​patternable overflader. Desuden undgår man inkless teknikken funktionen størrelse begrænsninger, som molekylær diffusion, lette replikering af meget små (<200 nm) funktioner. 17-23 Men indtil nu, inkless μ CP har hovedsagelig været anvendt til mønstret relativt uorganiseret molekylære systemer, som ikke beskytter de underliggende overflader mod nedbrydning.

Her rapporterer vi en enkel og pålidelig high-throughput metode til mønstret passiviseret silicium og germanium med reaktive organiske monolag og demonstrere selektiv funktionalisering af mønstrede substrater med både små molekyler og proteiner. Teknikken udnytter en præfabrikeret NHS-reaktivt bilayered system på oxydfri silicium og germanium. NHS-delen hydrolyseres i et mønster-specifik måde med en sulfonsyre-modificeret acrylat stempel til at producere kemisk forskellige mønstre af NHS-aktiverede og gratis carboxylsyrer. En væsentlig begrænsning til løsningen af mange μ CP teknikker er brugen af PDMS materiale, som mangler den mekaniske stivhed er nødvendige for high fidelity overførsel. For at afhjælpe denne begrænsning vi udnyttet en polyurethan acrylat polymer, et relativt stift materiale, der kanlet funktionaliserede med forskellige organiske fragmenter. Vores mønster tilgang fuldstændigt beskytter både silicium og germanium fra kemisk oxidation, giver præcis kontrol over form og størrelse af de mønstrede funktioner, og giver let adgang til kemisk diskrimineret mønstre, der kan blive yderligere funktionaliserede med både organiske og biologiske molekyler. Den tilgang er generel og gælder for andre teknologisk relevante overflader.

Protocol

1A. Primær éncellelag Dannelse på Silicon

  1. Skær silicium wafer i 1cm 2 substrater, støv og skyl med vand og filtreret ethanol.
  2. Fjern organisk forurening med nedsænke silicium substrater i et glas skål indeholdende Nano stribe ved 75 º C. Efter 15 minutter skylles hvert substrat med deioniseret, filtreret vand.
  3. Sted hvert substrat i en 5% HF-opløsning (Advarsel: HF er et ekstremt farligt materiale) til at fjerne den indfødte oxid lag. Efter 5 minutter tørre oxydfri silicium med kvælstof
  4. At producere en chloreret substrat, straks oversvømme hver oxydfri silicium brik i et scintillationsglas indeholdende 2 ml mættet PCL 5 i chlorbenzen. Denne løsning skal filtreres til 0,2 μm.
  5. Saml et hætteglas kondensator på toppen af ​​hvert hætteglas og placere dem i en heatblock sat til 112 ° C i en time.
  6. Når reaktionen er færdig, så lad hætteglas cool og skylles hver surface med chlorbenzen og tør under filtreret nitrogen.
  7. At danne en propenyl-ophæver substrat, placere hver klorerede silicium overflade i et tryk hætteglas indeholdende 4 ml propenyl magnesiumchlorid. Sted hvert tryk hætteglas i en heatblock ved 130 ° C i 24 timer.
  8. Tag hvert tryk hætteglas ud af heatblock og lad afkøle.
  9. Skyl hver overfladen hurtigt med DCM og ethanol og tør under filtreret nitrogen.

1B. Primær éncellelag Dannelse på Germanium

  1. Skær germanium wafer ind 1cm2 substrater, støv og skyl med vand og filtreret ethanol.
  2. Fjern organisk forurening med nedsænke overflader i et glas skål, der indeholder acetone i 20 minutter
  3. Placer hver overflade i en 10% HCl-opløsning i 15 minutter. Denne proces samtidig fjerner de indfødte oxid lag og chlorinates overfladen. Efter 5 minutter tørres substrater med kvælstof.
  4. At danne en octyl-terminated substrat, PLAce hver chlorerede germanium overflade i et tryk hætteglas indeholdende 4 ml octyl magnesiumchlorid (2 mm). Sted hvert tryk hætteglas i en heatblock ved 130 ° C i 48 timer.
  5. Tag hvert tryk hætteglas ud af heatblock og lad afkøle til stuetemperatur.
  6. Skyl hver overfladen hurtigt med DCM og ethanol og tør under filtreret nitrogen.

2. NHS Substrat funktionalisering på silicium og germanium

  1. Forbered en filtreret 0,1 M NHS-diazirine løsning i tetrachlormethan. Advarsel: Hold lyseksponering til et minimum.
  2. Pipette et par dråber af løsningen på methyl opsiges overflader. Tillad løsning spredt ud over hele overfladen.
  3. Placer overflader under en UV-lampe (☐ = 254 nm, 4400/cm2 på 0,74 inches). Lad overflader til at reagere under UV-lys i 30 minutter, hvorefter der tilsættes mere NHS-diazirine til overfladen og lad reaktionen fortsætte i yderligere 30 minutter.
  4. Skyl NHS ændrede surfaces med DCM og ethanol og tør under filtreret nitrogen.

3. Småmolekyle funktionalisering

  1. Reagerer NHS-modificerede substrater i en 20 mM tert-butyl carbamoyl (Boc-) ethylendiamin løsning i dichlormethan (DCM) i to timer ved stuetemperatur.
  2. Efter reaktionen, skylles Boc-modificeret substrat med DCM og ethanol.
  3. Deprotect BOC ændrede underlaget med 25% trifluoreddikesyre (TFA) i DCM i en time ved stuetemperatur.
  4. Skyl den resulterende overflade med DCM, ethanol og 10% (w / v) kaliumbicarbonat i vand og tør under filtreret nitrogen.
  5. Analysere alle overflader med XPS til at bestemme grundstofsammensætningen.

4. Sure Polyurethan Acrylat Stempel (PUA) Forberedelse

  1. Fortynd acrylat A med 30% med trimethylolpropane ethoxylat triacrylate B for at reducere viskositeten. Tilføj fotoinitiatorer C og D til reaktionsblandingen (FigURE 6).
  2. Tilføj natrium-2-mercaptoethanesulfonate (0,2 g, 1,22 mmol) til en 4N HCl-opløsning i dioxan (10 ml) og røre ved stuetemperatur i 2 minutter.
  3. Filter fra natriumchlorid først gennem et godt glas filter og derefter gennem et 0,2 μ m PTFE-membran sprøjte filter råd til en klar opløsning af 2-mercaptoethanesulfonic syre i dioxan.
  4. Fordampe dioxan under reduceret tryk
  5. Reagerer den resulterende sulfonsyre med 2 ml af polyurethan-acrylat prepolymeric blandingen ved stuetemperatur og derefter under vakuum ved 50 ° C. Vær sikker på at helt fri blandingen af ​​luftbobler.
  6. Cool denne opløsning til stuetemperatur og polymerisere mellem to glas objektglas eller en glasplade og en master ved udsættelse for UV-lys i 2 timer ved stuetemperatur.
  7. Efter polymerisering, skræl forsigtigt stemplet ud skibsføreren og vaske frimærket med ethanol og vand og tør med filtreret nitrogeN.

5. Katalytiske Trykning og SEM / AFM Analyse

  1. Det tilsvarende polyurethan-acrylat stempel på toppen af ​​NHS-modificerede underlaget ved stuetemperatur i et minut uden ekstern belastning til at holde dem sammen.
  2. Efter reaktionen, separat stempel og substrat.
  3. Skyl underlaget med ethanol, vand og ethanol tør med filtreret nitrogen.
  4. Skyl frimærket med ethanol, vand og ethanol tør med filtreret nitrogen.
  5. Hold frimærker ved stuetemperatur, inden det næste program.
  6. Analyser den producerede mønster ved hjælp af kontakt-tilstand lateral atomic force microsopy (AFM) og scanning elektron mikroskopi (SEM)

6. Protein mønster og Fluorescent Microscopy

  1. Nedsænkes NHS-mønstrede bifunktionelt substrat i Lysin-N, N-diacetic syre (20 mm) og ET 3 N (100 mm) i DMF: H20 (1:1) ved stuetemperatur i 1 time og derefter skylles medvand og ethanol.
  2. Inkubér substrater i en 50 mM NiSO4 løsning for 5 min ved stuetemperatur.
  3. Skyl chelaterede substrater omhyggeligt med vand og bindende buffer (20 mM NAP, 250 mM NaCl, 10mM imidazol, pH 7,5) og nedsænke det i en filtreret GFP løsning (~ 40 μ M) for 1 time ved 0 ° C.
  4. Skyl straks det substrater med bindende buffer efterfulgt af PBS (pH 7,4).
  5. Hold substrater hydreret i PBS ved 0 ° C, indtil de var klar til fluorescens mikroskopi analyse.

7. Protein mønster og Fluorescent Microscopy

  1. Nedsænkes NHS-mønstrede bifunktionelt substrat i Lysin-N, N-diacetic syre (20 mm) og ET 3 N (100 mm) i DMF: H 2 0 (1:1) ved stuetemperatur i 1 time og derefter skylles med vand og ethanol.
  2. Inkubér substrater i en 50 mM NISO 4 løsning for 5 min ved stuetemperatur.
  3. Skyl chelaterede substrater overdrevent wed vand og bindende buffer (20 mM NAP, 250 mM NaCl, 10mM imidazol, pH 7,5) og nedsænke det i en filtreret GFP løsning (~ 40 μM) for 1 time ved 0 ° C.
  4. Skyl straks det substrater med bindende buffer efterfulgt af PBS (pH 7,4).
  5. Hold substrater hydreret i PBS ved 0 ° C, indtil de var klar til fluorescens mikroskopi analyse.

8. Repræsentative resultater:

Et eksempel på soft-litografiske katalytisk nano-mønster er vist i figur 7. Den tilgang skaber chemoselective mønstre på oxydfri silicium og germanium, som kan være vinkelret funktionaliserede med forskellig kemiske og biologiske fragmenter. Reaktionen mellem NHS-functioanlized substrat og katalytiske mønstrede stempel fører til hydrolyse af NHS fragmenter i områder med konform kontakt, hvilket giver en mønstret bifunktionelt substrat bærer regioner i NHS aktiveret og frie carboxylsyrer. På grund af Diffusion fri natur af vores metode, vi opnår løsning tæt på fotolitografi. For eksempel viser figur 7 125 nm funktioner, som var ensartet gengivet på tværs af hele silicium substrat overflade. Bemærkelsesværdigt, kan den katalytiske stemplet genbruges flere gange uden at miste effektivitet.

Chemoselective funktionalisering af mønstrede halvledere med biomolekyler åbner op for udsigten til at integrere traditionelle elektroniske materialer med stærkt selektive biologiske substrater for ansøgninger i sensing, diagnostiske og analytiske forskningsområder. Et eksempel på en sådan funktionalisering er vist i figur 8, hvor NHS-mønstrede silicium blev selektivt funktionaliserede med protein molekyler. Ved at udnytte forskellen reactivities af aktiverede og frie carboxylsyrer, vi først anbringes nitrilotrieddikesyre-terminated (NTA) heterobifunctional linkere til NHS-funktionaliserede regioner, og derefter bruges den resulterendeNTA-mønstret overflade som en skabelon for den selektive fastgørelse af hexa-histidin-mærket GFP. Figur 8b viser tydeligt forskellen fluorescensintensitet mellem GFP-modificeret og hydrolyseres fri carboxylsyre regioner. Størrelsen og formen af replikerede funktioner er i overensstemmelse mellem begge NHS mønstret overflade (figur 8a) og GFP-modificerede overflade (figur 8b), hvilket bekræfter den bemærkelsesværdige stabilitet af kulstof-passiverede overflader og selektivitet stempling tilgang. Protokollen er ikke begrænset til Hans-taggede protein, og kan bruges til at mønsteret andre biomolekyler herunder DNA og antistoffer.

Figur 1
Figur 1. Generel ordning, der repræsenterer katalytisk microcontact udskrivning

Figur 2
Figur 2. Strukturen af bi-lag molecular system på Ge og Si. Primære alkyl éncellelag danner stabile Ge-C eller Si-C obligationer med underlaget og giver en kemisk inaktiv og tæt pakket system, der beskytter den underliggende overflade mod nedbrydning. (B) Sekundær overlayer danner stabile CC obligationer med primær beskyttende lag og giver terminalen funktionelle grupper

Figur 3
Figur 3. Reaktionsskema repræsenterer dannelsen af primær beskyttende monolag på Si (A) og Ge (B)

Figur 4
Figur 4. Kemisk funktionalisering af de primære beskyttende monolag med en heterobifunctional carbene donor

Figur 5
Figur 5. Reaction ordningen viser småmolekyle ændringer af NHS-funktionaliserede substrates og de tilsvarende XPS spektre

Figur 6
Figur 6. Sammensætningen af den katalytiske pre-polymer blanding, polymerisation betingelser, og SEM billeder af mønstrede sulfonsyre-modificerede stempel og de ​​tilsvarende PMMA-Si mester

Figur 7
Figur 7. SEM og AFM friktion billeder af mønstrede SAM om Si og Ge med en sur stempel

Figur 8
Figur 8 Soft-litografiske mønster og funktionalisering af passiveret silicium med organiske og biologiske molekyler a:.. SEM billede af mønstrede NHS-modificeret substrat b:. Fluorescerende mikrograf af GFP modificeret substrat.

Discussion

Den fremlagte protokol er en form eller inkless microcontact udskrivning, der kan universelt anvendes på alle underlag stand til at understøtte simple velordnet monolag. I denne metode, overfører et frimærke-immobiliseret katalysator et mønster til en pladens tilsvarende funktionelle grupper. Fordi processen ikke er afhængig af blæk overførsel fra stempel til overfladen diffusive opløsning begrænsning af traditionelle og reaktive μCP undgås, således at rutinemæssig fremstilling af nanoskala objekter. Indarbejdelsen af ​​en primær yderst ordnede molekylære system giver fuldstændig beskyttelse af de underliggende halvleder fra oxidation skader. Samtidig understøtter den metode immobilisering af storskrald reaktive grupper ved at bruge en sekundær reaktiv overlayer; sammen systemet opnår både beskyttelse og funktionalisering.

Teknikken begynder med dannelsen af ​​stabile kulstof-overflade obligationer giver mulighed for kemisk inaktivt priy éncellelag der fungerer som en effektiv barriere mod oxid dannelse. Dannelse af en sekundær reaktiv overlayer giver terminalen NHS funktionelle grupper, der tjener som vedhæftet fil point for en række kemiske og biologiske fragmenter. Denne stabile bilayered molekylære system er efterfølgende mønstret ved hjælp af vores katalytisk μCP tilgang. Den tilgang, der præsenteres i denne undersøgelse giver en generel metode til mønstret halvleder substrater med en bred vifte af økologiske og biologiske materialer. Evnen til at skabe mønstret organisk-halvleder grænseflader uden dyre og komplekse instrumentering giver mange muligheder inden for områder som elektronik, nanoteknologi, biokemi og biofysik.

Disclosures

Vi har intet at videregive

Acknowledgments

Vi anerkender den finansielle støtte fra NSF prisen CMMI-1000724.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
XPS spectrometer Kratos Analytical
Atomic force microscope Veeco Instruments, Inc.
SEM-FEG microscope FEI
Fluorescent microscope Carl Zeiss, Inc.
Heatblock VWR international
Vacuum pump BOC Edwards
Water purification system EMD Millipore
TESP silicon probes Veeco Instruments, Inc.
Silicon
Pressure Vials Chemglass
Vacuum manifold Chemglass
UV Lamp UVP Inc.
Stamp Material See references 20 and 18
PFTE syringe filters VWR international
Nano Strip Cyantek Corporation
HCl Sigma-Aldrich
Ethanol Sigma-Aldrich
Acetone Sigma-Aldrich
HF Sigma-Aldrich
Chlorobenzene Sigma-Aldrich
PCl5 Sigma-Aldrich
Propenyl Magnesium Chloride Sigma-Aldrich
Octyl Magnesium Chloride Sigma-Aldrich
Carbon TetraChloride Sigma-Aldrich
Boc protected ethylenediamine Sigma-Aldrich
TFA Sigma-Aldrich
Sodium 2-mercapt–thanesulfonate Sigma-Aldrich
4N HCl solution in dioxane Sigma-Aldrich
Lysine-N,N-diacetic acid Sigma-Aldrich
Et3N Sigma-Aldrich
DMF Sigma-Aldrich
NiSO4 Sigma-Aldrich
NaP Sigma-Aldrich
NaCl Sigma-Aldrich
imidazole Sigma-Aldrich
PBS Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kumar, A., Abbott, N. L., Kim, E., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterned Self-Assembled Monolayers and Mesoscale Phenomena. Accounts. Chem. Res. 28, (5), 219-226 (1995).
  2. Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10, (5), 1498-1511 (1994).
  3. Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching. Applied Physics Letters. 63, (14), 2002-2004 (1993).
  4. Wilbur, J. L., Kumar, A., Biebuyck, H. A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microcontact printing of self-assembled monolayers: applications in microfabrication. Nanotechnology. 7, (4), 452-457 (1996).
  5. Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials (Weinheim, Germany). 6, (7/8), 600-604 (1994).
  6. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: a tool to pattern. Soft Matter. 3, (2), 168-177 (2007).
  7. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials (Weinheim, Germany). 21, (22), 2257-2268 (2009).
  8. Kumar, A., Biebuyck, H. A., Abbott, N. L., Whitesides, G. M. The use of self-assembled monolayers and a selective etch to generate patterned gold features. J. Am. Chem. Soc. 114, (23), 9188-9191 (1992).
  9. Ravoo, B. J. Microcontact chemistry: surface reactions in nanoscale confinement. Journal of Materials Chemistry. 19, (47), 8902-8906 (2009).
  10. Biebuyck, H. A., Larsen, N. B., Delamarche, E., Michel, B. Lithography beyond light: Microcontact printing with monolayer resists. Ibm. J. Res. Dev. 41, (1-2), 159-170 (1997).
  11. Delamarche, E., Schmid, H., Bietsch, A., Larsen, N. B., Rothuizen, H., Michel, B., Biebuyck, H. Transport Mechanisms of Alkanethiols during Microcontact Printing on Gold. J. Phys. Chem. B. 102, (18), 3324-3334 (1998).
  12. Larsen, N. B., Biebuyck, H., Delamarche, E., Michel, B. Order in microcontact printed self-assembled monolayers. J Am Chem Soc. 119, (13), 3017-3026 (1997).
  13. Michel, B., Bernard, A., Bietsch, A., Delamarche, E., Geissler, M., Juncker, D., Kind, H., Renault, J. P., Rothuizen, H., Schmid, H., Schmidt-Winkel, P., Stutz, R., Wolf, H. Printing meets lithography: Soft approaches to high-resolution printing. IBM Journal of Research and Development. 45, (5), 697-719 (2001).
  14. Libioulle, L., Bietsch, A., Schmid, H., Michel, B., Delamarche, E. Contact-Inking Stamps for Microcontact Printing of Alkanethiols on Gold. Langmuir. 15, (2), 300-304 (1999).
  15. Sharpe, R. B. A., Burdinski, D., Huskens, J., Zandvliet, H. J. W., Reinhoudt, D. N., Poelsema, B. Spreading of 16-Mercaptohexadecanoic Acid in Microcontact Printing. Langmuir. 20, (20), 8646-8651 (2004).
  16. Workman, R. K., Manne, S. Molecular Transfer and Transport in Noncovalent Microcontact Printing. Langmuir. 20, (3), 805-815 (2004).
  17. Li, X. -M., Peter, M., Huskens, J., Reinhoudt, D. N. Catalytic Microcontact Printing without Ink. Nano Lett. 3, (10), 1449-1453 (2003).
  18. Shestopalov, A. A., Clark, R. L., Toone, E. J. Inkless Microcontact Printing on Self-Assembled Monolayers of Fmoc-Protected Aminothiols. J. Am. Chem. Soc. 129, (145), 13818-13819 (2007).
  19. Shestopalov, A. A., Clark, R. L., Toone, E. J. Catalytic Microcontact Printing on Chemically Functionalized H-Terminated Silicon. Langmuir. 26, (3), 1449-1451 (2010).
  20. Shestopalov, A. A., Clark, R. L., Toone, E. J. Inkless Microcontact Printing on SAMs of Boc- and TBS-Protected Thiols. Nano Lett. 10, (1), 43-46 (2010).
  21. Snyder, P. W., Johannes, M. S., Vogen, B. N., Clark, R. L., Toone, E. J. Biocatalytic Microcontact Printing. J. Org. Chem. 72, (19), 7459-7461 (2007).
  22. Morris, C. J., Shestopalov, A. A., Gold, B. H., Clark, R. L., Toone, E. J. Patterning NHS-Terminated SAMs on Germanium. Langmuir. 27, (10), 6486-6489 (2011).
  23. Shestopalov, A. A., Morris, C. J., Vogen, B. N., Hoertz, A., Clark, R. L., Toone, E. J. Soft-Lithographic Approach to Functionalization and Nanopatterning Oxide-Free Silicon. Langmuir. 27, (10), 6478-6485 (2011).
Blød Litografiske funktionalisering og mønster oxydfri silicium og germanium
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bowers, C. M., Toone, E. J., Clark, R. L., Shestopalov, A. A. Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium. J. Vis. Exp. (58), e3478, doi:10.3791/3478 (2011).More

Bowers, C. M., Toone, E. J., Clark, R. L., Shestopalov, A. A. Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium. J. Vis. Exp. (58), e3478, doi:10.3791/3478 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter