Summary
इस प्रोटोकॉल में हम एक साथ आरएनएआई की मध्यस्थता जीन मुंह गठबंधन
Abstract
यह वीडियो प्रोटोकॉल के लिए एक कीट में एक विशेष जीन को पछाड़ना और उत्सर्जन की दर को मापने के लिए एक उपन्यास bioassay आचरण के लिए एक प्रभावी तकनीक को दर्शाता है. इस विधि के लिए कीड़ों में एक मूत्राधिक्य की प्रक्रिया की एक बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और रक्त खिला आर्थ्रोपोडा है कि एक एक रक्त भोजन में तरल पदार्थ की भारी मात्रा में लेने में सक्षम हैं में मूत्राधिक्य के अध्ययन में विशेष रूप से उपयोगी है.
यह आरएनएआई की मध्यस्थता जीन पछाड़ना vivo मूत्राधिक्य परख में एक के साथ संयुक्त Hansen के प्रयोगशाला द्वारा विकसित किया गया था एडीज aegypti मच्छर 1 मूत्राधिक्य पर aquaporin जीन पछाड़ना आरएनएआई की मध्यस्थता के प्रभाव का अध्ययन.
प्रोटोकॉल दो भागों में सेटअप है: पहला प्रदर्शन दिखाता है कि कैसे एक साधारण मच्छर इंजेक्शन युक्ति का निर्माण करने के लिए और कैसे तैयार करने और आरएनएआई की मध्यस्थता जीन पछाड़ना के लिए dsRNA इंजेक्षन मच्छरों की छाती में है. दूसरी प्रदर्शन दिखाता है कि कैसे निर्धारित करने के लिएvivo bioassay में एक का उपयोग मच्छरों में उत्सर्जन की दर.
Protocol
वयस्क एडीज aegypti मच्छरों में आरएनएआई की मध्यस्थता जीन पछाड़ना - भाग मैं. प्रयोग सिंहावलोकन के लिए चित्रा 1 देखें.
1. dsRNA संश्लेषण
- के ब्याज और नियंत्रण dsRNAs के जीन के खिलाफ विशिष्ट dsRNAs synthesize. नोट: हम 300-500 आधार 3 'विशिष्ट सीडीएनए 2 के अंत और T7 प्राइमर 5 में संलग्न अनुक्रम के साथ अंत में (5'-TAA टीएसी GAC TCA CTA स्थित जोड़े की रेंज में पीसीआर टुकड़े के लिए विकासशील प्राइमरों की सिफारिश 'जी जी 3) टैग. टुकड़े की विशिष्टता BLASTN 3 विश्लेषण के द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए.
- Ambion Megascript T7 उच्च मार्ग दें ट्रांसक्रिप्शन (Ambion, अभिकर्मकों की तालिका) किट है कि T7 शाही सेना पोलीमरेज़ प्रतिलेखन प्रतिक्रिया dsRNA synthesize करने के लिए इस्तेमाल का उपयोग करें. नोट: समान अभिकर्मकों और किट कहीं उपलब्ध हैं.
- DsRNA शुद्ध, लिथियम क्लोराइड Megascript किट के साथ दिए गए निर्देशों का पालन के साथ वेग.
- Purificat के बादआयन, बाँझ पानी में dsRNA गोली भंग. Microinjection के लिए पर्याप्त चिपचिपापन सुनिश्चित करने के लिए, dsRNA एकाग्रता के 2 μg / μl अधिक नहीं होनी चाहिए.
2. इंजेक्शन तैयार
- एक सरल सूक्ष्म सुई लगानेवाला टयूबिंग, कैंची, धातु सुई, 1 मिलीलीटर सिरिंज, और एक 1 मिलीग्राम प्लास्टिक विंदुक टिप (चित्र 2 देखें) का उपयोग करके निर्माण किया जा सकता है. टयूबिंग ~ लंबाई में 40 सेमी करने के लिए कटौती की जानी चाहिए. वैकल्पिक रूप से, एक स्वचालित सूक्ष्म सुई लगानेवाला Drummond Nanojet द्वितीय 4 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- 2 मिलीलीटर पैमाने पर निशान पर सिरिंज (सुई हब) की नोक कटौती और सवार से रबर सवार सिर हटा.
- पंच रबर सवार सिर और जगह रबर सवार सुई हब में वापस सिर में एक धातु सुई का उपयोग छेद.
- प्लेस टयूबिंग की एक अंत में सुई हब और अन्य अंत में एक 1 मिलीग्राम प्लास्टिक पिपेट टिप, जो मुँह टुकड़ा (वैकल्पिक रूप से, एक 10 मिलीलीटर sy के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा जगहringe हवा इंजेक्शन के लिए आवश्यक दबाव उत्पादन) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- रबर सवार सिर में छेद में एक गिलास केशिका सुई प्लेस और सुई की नोक को तोड़ने से इतना चौड़ाई के लिए तरल के माध्यम से प्रवाह के लिए काफी बड़ा है. नोट: सुई टिप के इष्टतम आकार empirically का निर्धारित किया गया है - अगर सुई की चौड़ाई भी बड़ा आघात और एक उच्च मच्छर मृत्यु दर में परिणाम देगा है, अगर सुई चौड़ाई बहुत छोटा है, यह घुसना करने के लिए असंभव हो जाएगा मच्छर बहिःकंकाल.
- इंजेक्शन सुई तैयार dsRNA नमूना में डूब और इंजेक्शन सुई में तरल मुँह टुकड़ा (या एक सिरिंज) के साथ चूसने से तरल नमूना आकर्षित. नोट: यह कदम सभी तरल अभिकर्मकों कि मच्छरों में इंजेक्शन सहित पीबीएस बफर, जो में vivo मूत्राधिक्य परख प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है (देखें नीचे), के लिए समान है.
3. मच्छरों लीजिए और चतनाशून्य करना
- संग्रहएक संग्रह की शीशी में बैटरी संचालित चूषित्र के साथ मच्छरों. संग्रह शीशी पर एक टोपी रखें शीशी और एक साफ सीओ 2 के लिए मच्छरों को चतनाशून्य करना पैड पर जगह. नोट: वैकल्पिक रूप से मच्छरों बर्फ पर संवेदनाहृत हो सकता है.
4. मच्छर इंजेक्शन
- संग्रह शीशी खोलें और सीधे सीओ 2 के पैड पर मच्छरों जगह और प्रतीक्षा तक मच्छरों संवेदनाहृत हैं.
- सभी पुरुषों को त्यागें.
- पक्ष पर मच्छरों रेखा के इंजेक्शन के लिए आसान पहुँच के लिए अनुमति देते हैं.
- चोट से बचने के पैर या पंखों के द्वारा मच्छरों को पकड़ो. तुम भी एक ठीक तूलिका या मच्छरों हेरफेर पंख का उपयोग कर सकते हैं.
- तैयार जब पहली बार मच्छर इंजेक्षन करने के लिए, धीरे संदंश के साथ छाती के एक पक्ष समर्थन और छाती के दूसरी ओर (चित्रा 2) में सुई की नोक डालें. यह बेहतर है छल्ली की एक पतली भाग में सुई और सुई धक्का से बचनेछाती में गहरी ओ.
- एक बार सुई जगह में है, मच्छर में तरल उड़ा. वांछित राशि सुई में तरल नवचंद्रक के निगरानी द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. एक विशिष्ट मात्रा के लिए आवश्यक मिलीमीटर की संख्या गिलास केशिका सुई (πr 2 घंटे) के सिलेंडर मात्रा की गणना के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. dsRNA की प्रभावी राशि है कि आम तौर पर इंजेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता है 1 μg है.
- एक बार तरल मच्छर में इंजेक्ट किया जाता है, ध्यान से सुई वापस लेना. यदि छाती के बाहर एक बड़े तरल छोटी बूंद रूपों, मच्छर त्याग किया जाना चाहिए. फिर अगले मच्छर के साथ इस प्रक्रिया को दोहराने.
5. मच्छर रिकवरी और संग्रहण
- इंजेक्शन के बाद, भंडारण के लिए एक कंटेनर में मच्छरों जगह. उदाहरण के लिए, एक पिंट मोम जाल कार्डबोर्ड ढक्कन के साथ सुरक्षित कवर के साथ गत्ता कप (सूप कप) खड़े हैं. ढक्कन के एक भाग को उजागर किया कवर जाल के लिए बाहर कटौती है. एक बार जब सभी मोsquitoes कंटेनर में रखा जाता है, ऊष्मायन के लिए एक पर्यावरण नियंत्रित कक्ष में कंटेनर जगह है और 20% sucrose के लथपथ कपास जाली कवर के शीर्ष पर रखा गेंदों के रूप में एक खाद्य स्रोत के साथ मच्छरों को प्रदान करते हैं. Vivo मूत्राधिक्य परख में प्रदर्शन से पहले, 12 से प्रत्येक मच्छर की जलयोजन राज्य मानकीकरण बजे के लिए एक पानी के स्रोत के dsRNA इंजेक्शन मच्छरों से वंचित हैं.
- dsRNA की मध्यस्थता जीन पछाड़ना की दक्षता चर हो सकता है. जीन मुंह बंद इंजेक्शन के बाद 1 दिन शुरू और यह 4 इंजेक्शन के बाद 6 दिनों के लिए पिछले सकता सकता है. इष्टतम प्राप्त करने के समय को अधिकतम जीन पछाड़ना empirically हर जीन के लिए इस्तेमाल किया निर्धारित किया है. आम तौर पर, हम dsRNA इंजेक्शन के बाद 3 दिन इंतजार इससे पहले कि हम आगे बढ़ना.
Vivo मूत्राधिक्य परख वयस्क एडीज aegypti मच्छरों में - भाग द्वितीय
नोट: यह प्रोटोकॉल लेखकों द्वारा विकसित किया गया है औरaquaporin पीले बुखार मच्छर में प्रोटीन की पछाड़ना आरएनएआई मध्यस्थता के लिए इस्तेमाल किया 1 aegypti एडीज. व्यक्ति मच्छरों के बीच परिवर्तनशीलता से बचने के लिए, मच्छरों समूहों में विश्लेषण किया जाना चाहिए. तकनीकी कारणों के लिए, हम उपचार प्रति 5 मच्छरों के समूह की सिफारिश - वहाँ समय का एक सीमित राशि के लिए पहली वजन माप प्रदर्शन से पहले मच्छरों को इंजेक्शन के बाद मूत्र उगलना शुरू है.
6. मच्छरों लीजिए और चतनाशून्य करना
- मच्छरों के संग्रह से पहले, एक विश्लेषणात्मक परिशुद्धता संतुलन का उपयोग टोपी के साथ एक खाली संग्रह शीशी का वजन रिकॉर्ड. इस शीशी बाद के सभी मापन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- वजन संग्रह शीशी में एक चूषित्र साथ 5 मादा मच्छर लीजिए. संग्रह शीशी पर टोपी जगह और यह कई सेकंड के लिए सीओ 2 के पैड पर बैठ मच्छरों असंवेदनता उत्पन्न करना.
7. प्रारंभिक वजन मापन
- टी लेवह संग्रह सटीक संतुलन पर टोपी के साथ मच्छरों से युक्त शीशी रखकर 5 मच्छरों के प्रारंभिक वजन माप.
- मच्छरों के वजन और टोपी के साथ संग्रह शीशी ले और टोपी के साथ खाली संग्रह शीशी के वजन को घटाकर 5 मच्छरों के समूह के वजन की गणना.
- संग्रह शीशी खोलें और सीधे सीओ 2 के पैड पर मच्छरों के वजन रिकॉर्डिंग के बाद मच्छरों जगह. यदि मच्छरों वजन माप के दौरान जाग करने के लिए शुरुआत कर रहे हैं, कई सेकंड के लिए इसे खोलने और पैड पर मच्छरों को रखने से पहले सीओ 2 के पैड पर शीशी सेट.
8. इंजेक्शन तैयार
- आरएनएआई की मध्यस्थता जीन पछाड़ना प्रोटोकॉल में दिए गए निर्देशों का पालन सूक्ष्म सुई लगानेवाला सेट करें.
- सूक्ष्म सुई लगानेवाला में एक गिलास केशिका सुई रखें और सुई की नोक तोड़ बंद इतना चौड़ाई liq के लिए काफी बड़ा हैयू आई डी के माध्यम से प्रवाह.
- डूब पीबीएस बफर में सुई और इंजेक्शन सुई में बफर आकर्षित, इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल वांछित राशि प्रत्येक मच्छर के लिए पीबीएस की 1.25 μl है. नोट: यह राशि रक्त प्लाज्मा के औसत राशि है कि एक महिला 5 मच्छर के द्वारा लिया जाता है mimics.
9. मच्छर इंजेक्शन
- मच्छरों रेखा सूक्ष्म सुई लगानेवाला के साथ आसान पहुँच के लिए अनुमति देने के लिए.
- एक बार सुई जगह में है, मच्छर में पीबीएस बफर उड़ा.
- एक बार तरल मच्छर में इंजेक्ट किया जाता है, छाती के बाहर पर एक छोटी बूंद फार्म हो सकता है. इस छोटी बूंद के लिए ध्यान से अगले कदम से पहले हटा दिया जाना चाहिए.
- अगले मच्छर साथ इस इंजेक्शन प्रक्रिया को दोहराएँ. अनुभव के साथ, मच्छर जीवित रहने की दर लगभग 100% इंजेक्शन के बाद हो जाएगा.
10. वजनी मच्छरों
- इंजेक्शन के बाद, धीरे संग्रह शीशी में मच्छरों जगहटोपी और. संग्रह सटीक संतुलन पर टोपी के साथ मच्छरों से युक्त शीशी रखकर 5 मच्छरों के पहले वजन माप ले लो.
- टोपी के साथ मच्छरों और संग्रह शीशी का वजन लेने से 5 मच्छरों के समूह के वजन की गणना और टोपी के साथ खाली संग्रह शीशी का वजन घटाना. नोट: मच्छरों लिए सीओ 2 संज्ञाहरण पैड से हटाने के बाद 2 मिनट के भीतर मूत्र उगलना शुरू करते हैं, तो यह महत्वपूर्ण है वजन माप लेने से पहले वे उगलना शुरू करते हैं.
- एक छोटे कंटेनर में मच्छरों जहां वे मूत्र उगलना शुरू हो जाएगा रखें.
11. दूसरे और बाद के वजन माप
नोट: मच्छरों का वजन माप 30 मिनट के अंतराल में रखा जाना चाहिए, लेकिन यह कम या लंबी उत्सर्जन दर के आधार पर अंतराल को समायोजित किया जा सकता है.
- 30 मिनट के बाद, चल मैदान इकट्ठाटोपी के साथ एक ही संग्रह शीशी में चूषित्र के साथ 5 मच्छरों के पी. संग्रह सटीक संतुलन पर टोपी के साथ मच्छरों से युक्त शीशी रखकर मच्छरों की अगली वजन माप ले लो.
- माप के बाद, अगले 30 मिनट के लिए एक ही पकड़े कंटेनर में मच्छरों की जगह है.
- समय की एक वांछित राशि के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
12. मच्छर उत्सर्जन दर निर्धारण
- तरल की कुल राशि कि 5 मच्छरों के समूह में इंजेक्ट किया गया था वजन से इंजेक्शन के तुरंत बाद मच्छरों की प्रारंभिक वजन subtracting द्वारा गणना की जा सकती है.
- मूत्र की राशि है कि मच्छरों के समूह द्वारा एक विशिष्ट बिंदु पर उत्सर्जित किया गया था विशिष्ट समय बिंदु पर मच्छरों के वजन से मच्छरों की प्रारंभिक वजन subtracting द्वारा गणना की जा सकती है.
- एक विशिष्ट समय के बिंदु पर उत्सर्जन की दर डिवीडेंड द्वारा गणना की जा सकती हैडिंग तरल इंजेक्शन (तालिका 1) की कुल राशि द्वारा इस समय बिंदु पर उत्सर्जित मूत्र की राशि.
13. प्रतिनिधि परिणाम
जीन पछाड़ना आरएनएआई की मध्यस्थता और vivo मूत्राधिक्य परख में प्रयोगशाला Hansen के द्वारा प्रयोग किया गया Aquaporins की एडीज aegypti मच्छर मूत्राधिक्य में प्रभाव का अध्ययन. तीन Aquaporins है कि एडीज aegypti Malpighian नलिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं मच्छरों को नियंत्रित करने के लिए 1 की तुलना में उत्सर्जन दर पर महत्वपूर्ण प्रभाव के साथ नीचे गिर गए चित्रा 4 जहां मूत्राधिक्य परख एडीज aegypti और क्युलेक्स quinquefasciatus के बीच उत्सर्जन दर में तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है एक प्रयोग की प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है. अलग तापमान पर.
आकृति 1. आरएनएआई / मूत्राधिक्य परख के फ़्लोचार्ट 10 मच्छरों ea 5 समूहोंचर्चा dsRNA साथ एक विशेष जीन के लिए अंतःक्षिप्त रहे हैं और दस मच्छरों की एक और पांच समूहों नियंत्रण dsRNA इंजेक्शन के साथ कर रहे हैं. पीबीएस में 200 माइक्रोन HgCl 2 इंजेक्शन के साथ मच्छरों का एक अन्य समूह एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है. इन मच्छरों इंजेक्शन से पहले और इंजेक्शन के बाद 3 घंटे के लिए तीस मिनट के अंतराल में तौल रहे हैं.
चित्रा 2. एक साधारण आरएनएआई की मध्यस्थता जीन पछाड़ना के लिए और vivo मूत्राधिक्य परख में सूक्ष्म इंजेक्शन युक्ति ए. गिलास केशिका सुई इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया. ग्रे त्रिकोण मिलीमीटर सुई पर तैयार मच्छर में तरल इंजेक्शन की राशि से संकेत मिलता है वेतन वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है. बी 1 मिलीलीटर सिरिंज सूक्ष्म सुई लगानेवाला निर्माण किया. सफेद त्रिकोण सुई हब का प्रतिनिधित्व करता है और काला त्रिकोण रबर सवार सिरिंज में सवार संलग्न करने के लिए सिर का प्रतिनिधित्व करता है. सी. टयूबिंग मुखपत्र देते थेसुई लगानेवाला. डी. 1 मिलीग्राम डिस्पोजेबल विंदुक (नीले टिप) टिप है कि microinjection डिवाइस के मुखपत्र के रूप में प्रयोग किया जाता है. ई. microinjection युक्ति है कि ई. भागों शामिल हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
चित्रा 3. इष्टतम मच्छर इंजेक्शन साइट ए. मादा एडीज aegypti मच्छर छाती पर बड़े पैमाने के बीच एक गिलास केशिका सुई इंजेक्शन के साथ है. काली पट्टी आकार तुलना के लिए 1 मिमी इंगित करता है. महिला मच्छर छाती के एक ड्राइंग बी और सफेद धब्बे मच्छर बहिःकंकाल में सफेद तराजू का प्रतिनिधित्व करते हैं. पियर्स स्पॉट के बीच मच्छर इंजेक्शन सुई इंजेक्शन के दौरान मृत्यु दर कम से कम.
चित्रा 4. तापमान का प्रभावसे क्युलेक्स quinquefasciatus और एडीज aegypti मूत्राधिक्य पर ऊपरी diuresis परख मच्छर, एडीज aegypti और क्युलेक्स quinquefasciatus की दो प्रजातियों के साथ अलग तापमान पर किया गया था. इंजेक्शन के बाद पहले घंटे के दौरान उत्सर्जन की दर प्रतिशत में दिया जाता है.
| समूह | तारा (छ) | नहीं इंजेक्शन (छ) | इंजेक्शन के बाद (छ) | 1 के बाद इंजेक्शन (छ) | औसत वजन (एमजी) | इंजेक्शन राशि (Μl) | राशि उत्सर्जित (Μl) | % उत्सर्जित |
| 1 | 7.5938 | 7.6057 | 7.6104 | 7.6096 | 2.38 | 0.94 | 0.16 | 17.0 |
| 2 | 7.8252 | 7.8349 | 7.8415 | 7.8403 | 1.94 | 1.32 | 0.24 | 18.2 |
| 3 | 7.8896 | 7.9026 | 7.9077 | 7.906 | 2.6 | 1.02 | 0.34 | 33.3 |
टेबल vivo मूत्राधिक्य परख परिणामों में 1. एडीज aegypti vivo मूत्राधिक्य परख में 4 में एडीज aegypti मादा मच्छर के साथ प्रदर्शन डिग्री सेल्सियस से कच्चे डेटा.
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Discussion
आरएनएआई इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के कैलिफोर्निया रिवरसाइड 6,7 विश्वविद्यालय में सिकंदर Raikhel की प्रयोगशाला में विकसित किया गया है और गार्वर और 4 Dimopoulos के द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल के समान है. प्रयोगात्मक इस वीडियो प्रोटोकॉल में दिखाया दृष्टिकोण के vivo सेटिंग में एक में कीट मूत्राधिक्य के में शामिल जीनों का अध्ययन किया जा सकता है. कीड़े, Malpighian नलिकाओं, निकालनेवाला अंगों को एक 'सरल' मूत्राधिक्य के लिए मॉडल प्रणाली के रूप में शोधकर्ताओं की पीढ़ियों के हित को आकर्षित किया है. इस अंग से xenobiotics ड्रोसोफिला में 8 और निकासी का काम कई Malpighian छोटी नली 9,10 फिजियोलॉजी जो अब आरएनएआई तरह रिवर्स आनुवंशिक तरीकों के साथ अन्य कीड़ों की प्रजाति में अध्ययन किया जा सकता है में शामिल जीनों की पहचान की है में शामिल है. कई मुताबिक़ जीन प्रकाशित विभिन्न कीट 11 प्रजातियों के जीनोम अनुक्रम में आसानी से पहचाना जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में तीन दिन पुराने मच्छरों इस समय poi पर कारण इस्तेमाल किया गयावे NT के लिए एक रक्त भोजन लेने के लिए सक्षम हो जाते हैं.
कई अन्य उत्सर्जन assays सूचना दी गई है. क्लासिक रामसे परख के लिए इन विट्रो में 12 अलग Malpighian tubules में मूत्राधिक्य अध्ययन किया गया है. इस परख में एक tubules अलग कर रहे हैं और बाहर का हिस्सा खारा समाधान की एक बूंद में रखा गया है जबकि समीपस्थ हिस्सा खुला है. मूत्रवर्धक गतिविधि के मूत्र छोटी बूंद के आकार कि समीपस्थ भाग के अंत में रूपों को मापने के द्वारा परिकलित किया जाता है. रामसे परख का प्रयोग, एक व्यक्तिगत Malpighian tubules द्वारा मूत्र उत्पादन की मात्रा उपाय कर सकते हैं. हमारे मूत्राधिक्य परख पूरी मच्छर उत्सर्जन दर की माप के लिए अनुमति देता है और है, इसलिए रामसे परख के लिए एक विकल्प नहीं है. इसके बजाय, दोनों assays के पूरक जानकारी प्रदान कर सकते हैं अगर एक साथ इस्तेमाल किया.
Vivo में उत्सर्जन assays में अन्य Musca domestica और एडीज aegypti के लिए विकसित किया गया है एम.. domestica अध्ययन शामिलप्रवाह के माध्यम से एक नमी 13 मीटर पानी के नुकसान की माप. एक इसी तरह की तकनीक के लिए उत्सर्जन एक सटीक आर्द्रता 14 कक्ष का उपयोग कर दर को मापने के द्वारा एडीज aegypti मूत्राधिक्य अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. vivo मूत्राधिक्य परख में यहाँ प्रस्तुत के रूप में तकनीकी रूप से उपर्युक्त तकनीक के रूप में मांग और फिर भी उत्सर्जन दर पर एक पूरा जीव के संदर्भ में बहुत ही सटीक डेटा का उत्पादन नहीं है.
Vivo में मूत्राधिक्य यहाँ प्रस्तुत परख के लिए भविष्य अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है. आरएनएआई तरह आनुवंशिकी तरीकों रिवर्स अलावा यह दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, उदाहरण के संकेत पारगमन आदि inhibitors के लिए कीट मूत्राधिक्य पर इस्तेमाल किया जा सकता है. यह भी एक शक्तिशाली परख लक्ष्य कीड़े में xenobiotics निकासी की प्रक्रिया का अध्ययन है.
समस्या है कि हम जबकि आगे इस परख के विकास को संबोधित करेंगे रहे हैं: एक) एकाग्रता और इंजेक्शन बफर की रचना. हमप्रयोगों हम शारीरिक एडीज की तरह इतनी दूर है, लेकिन अन्य बफ़र्स 15 खारा बाहर बारी के लिए मच्छर तथा अन्य कीड़ों के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है प्रदर्शन के लिए पीबीएस इस्तेमाल किया. बी) के अन्य प्रजातियों, विशेष रूप से गैर खून चूसने कीड़े के लिए इस पद्धति लागू. बफर की मात्रा में है कि ऐसी प्रजाति में इंजेक्ट किया जा सकता है empirically प्रत्येक प्रजातियों के लिए निर्धारित किया गया है. सी) प्रयोगात्मक त्रुटि न्यूनतम. हम हमारे इंजेक्शन और तकनीक को मापने का अनुकूलन होगा.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखक इस प्रोटोकॉल के उसके महत्वपूर्ण टिप्पणियों के लिए विक्टोरिया बढ़ई धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion | AM1334 | |
| PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Plastic tubing | Local Supplier | PVC | |
| 1 ml plastic pipette tip | VWR international | 83007-376 | Blue tip |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Scissors | Local Supplier | ||
| Metal needle | Carolina Biological | 654307 | Size 5 |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | |
| Glass capillary needles | World Precision Instruments, Inc. | 1B200-6 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| One pint waxed lined cardboard cups | Local Supplier | Manufactured soup cups | |
| Mesh net | Local Supplier | plastic fly gauze |
References
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