Summary
이 프로토콜에서 우리는 함께 RNAi - 중재 유전자 입을를 결합
Abstract
이 비디오 프로토콜은 곤충에서 특정 유전자를 분해하고 배설 률을 측정하는 소설 bioassay를 수행하기위한 효과적인 기법을 보여줍니다. 이 방법은 곤충의 이뇨 과정의 이해를 얻는 데 사용하며 단일 혈액 식사에서 액체의 엄청난 양의 걸릴 수있는 혈액 먹이를 arthropods의 이뇨의 연구에 특히 유용합니다.
생체내의 이뇨 분석에서와 결합된 이러한 RNAi - 중재 유전자 최저는 Aedes aegypti 모기 이뇨 1 aquaporin 유전자의 RNAi-매개 최저의 효과를 연구하기 위해 한센병 연구소에 의해 개발되었다.
프로토콜은 두 부분의 설정은 다음과 같습니다 첫 번째 데모는 간단한 모기 분사 장치를 구성하는 방법과 RNAi - 중재 유전자 최저에 대한 모기의 흉부에 dsRNA를 준비하고 주입하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 데모를 결정하는 방법을 보여줍니다생체내의 bioassay에를 사용하여 모기의 배설 속도.
Protocol
부 전 - 성인 Aedes aegypti 모기에 RNAi - 중재 유전자 최저. 실험 개요는 그림 1을 참조하십시오.
1. dsRNA 합성
- 관심과 제어 dsRNAs의 유전자에 대한 구체적인 dsRNAs을 합성. 주 : 우리는 3 '특정 cDNA 2 월말과 5 부착된 T7 뇌관 시퀀스로'에서 끝 (5'-TAA 전술 GAC TCA CTA 위치한 300-500 기본 쌍의 범위에서 PCR 단편을 위해 개발 primers를 추천 TAG GG-3 '). 파편의 특이 사항은 BLASTN 분석 3 확인하여야한다.
- dsRNA를 합성하기위한 전사 반응을 T7 RNA 중합 효소를 활용 Ambion Megascript T7 높은 항복 전사 키트 (Ambion, 시약 표)를 사용합니다. 참고 : 유사한 시약 및 키트 다른 곳에서 사용할 수 있습니다.
- dsRNA를 정화하려면 Megascript 키트와 지침에 따라 염화 리튬으로 침전.
- purificat 후이온, 멸균 물 속에서 dsRNA 펠릿를 해산. microinjection에 대한 적절한 점도를 보장하기 위해 dsRNA 농도 2 μg / μl를 초과해서는 안됩니다.
2. 사출 준비
- 간단한 마이크로 주입기는 튜브, 가위, 금속 바늘, 1 ML의 주사기, 그리고 한 ML 플라스틱 피펫 팁을 (그림 2 참조)을 사용하여 건설 수 있습니다. 튜브는 길이 ~ 40cm로 절단한다. 또한, 자동화된 마이크로 주입기는 그러한 Drummond Nanojet II 4로 사용될 수 있습니다.
- 이 ML 눈금 표시에서 주사기의 팁 (바늘 허브)를 잘라 플런저에서 고무 플런저 헤드를 제거합니다.
- 고무 플런저 머리와 장소 다시 바늘 허브의 고무 플런저 머리에 금속 바늘을 사용하여 펀치 구멍.
- 튜브의 한쪽 끝을에 바늘 허브를 놓고 마우스 피스 (또는 10 ML 싸이로 사용됩니다 다른 쪽 끝을에서 1 ML 플라스틱 피펫 팁을 배치ringe)는 주사에 필요한 공기 압력을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
- 고무 플런저 머리에있는 구멍에 유리 모세관 바늘을 놓고 너비는 액체를 통해 흐를만큼 큰 수 있도록 바늘의 팁을 끊다. 참고 : 바늘 끝의 최적 크기는 경험적으로 결정되어야한다 - 바늘 너비가 너무 작은 경우 바늘의 너비 이것이 외상과 높은 모기 사망률집니다 너무 큰 경우, 그것은 침투하기가 불가능합니다 모기 외골격.
- 준비된 dsRNA 샘플에서 잠수함 주입 바늘과 마우스 피스 (또는 주사기)로 액체를 빨아하여 주사 바늘로 액체 샘플을 그립니다. 참고 :이 단계는 (아래) 생체내의 이뇨 분석 프로토콜에서 사용되는 PBS 버퍼를 비롯하여 모기에 주입되는 모든 액체 시약에 대해 동일합니다.
3. 모기를 수집하고 마취
- Collec수거 유리병에 배터리 구동 흡인기로 하지마 모기. 수거 유리병 이상의 모자를 놓고 모기를 마취하기 위해 깨끗한 CO 2 패드에 병을 놓습니다. 참고 : 또한 모기가 얼음위에 anesthetized 될 수 있습니다.
4. 모기 분사
- 수거 유리병을 열고 직접 CO 2 패드에 모기를 넣고 모기가 anesthetized 때까지 기다립니다.
- 모든 남성 폐기하십시오.
- 주사를 더욱 쉽게 액세스할 수 있도록 측면에 모기를 줄입니다.
- 부상을 피하기 위해 다리 또는 날개에 의한 모기를 잡아. 당신은 또한 훌륭한 화필이나 모기를 조작하기 위해 깃털을 사용할 수 있습니다.
- 첫 모기를 주입하기 위해 준비가되면 부드럽게 포셉와 흉부의 한쪽을 지원하며 흉부 반대편 (그림 2)로 바늘의 끝부분을 삽입합니다. 그것은 표피의 얇은 부분에 주입하고 바늘을 밀어 피하는 것이 좋습니다흉부에 깊이를 O.
- 바늘이 곳에되면 모기에 액체를 폭파. 원하는 금액은 바늘의 액체 초승달 모양을 모니터에 따라 결정됩니다. 특정 볼륨에 필요한 mm의 갯수는 유리 모세관 바늘 (πr 2 시인데)의 실린더 부피를 계산하여 결정하실 수 있습니다. 일반적으로 주사에 사용되는 dsRNA의 효과적인 금액은 1 μg이다.
- 액체는 모기에 주입되면 바늘을 조심스럽게를 철회. 흉부의 외부에 대형 액체 비말 형태 않으면 모기는 폐기되어야합니다. 그리곤, 다음날 모기와 함께이 과정을 반복합니다.
5. 모기 복구 및 저장
- 주입 후 저장 용기에 모기를 놓습니다. 예를 들어, 한 파인트 왁스는 메쉬가 마분지 뚜껑으로 안전 커버와 골판지 컵 (수프 컵) 정렬했습니다. 뚜껑이 노출되는 덮고 메쉬에 맞을 부분이 있습니다. 일단 모든 MOsquitoes가 컨테이너에 배치되며, 인큐베이션위한 환경 제어 챔버에 컨테이너를 놓고 같은 메쉬 커버의 상단에 배치 20 % 자당 젖었 면화 공 같은 음식 소스와 모기를 제공하고 있습니다. 생체내의 이뇨 분석에를 수행하기 전에, 각 모기의 수화 상태를 표준화하기 위해 12 시간 동안 물 소스의 dsRNA-주입 모기를 빼앗다.
- dsRNA - 중재 유전자 최저의 효율이 변수가 될 수 있습니다. 유전자 입을은 주입 후 1 하루를 시작할 수 있으며 주사 후 4 육일까지 지속될 수 있습니다. 최대 유전자 최저를 달성하기위한 최적의 시간은 사용하는 모든 유전자에 대해 경험적으로 결정되어야한다. 우리가 진행하기 전에 일반적으로, 우리는 dsRNA 주입 후 삼일 정도 기다리십시오.
파트 II - 생체내의 이뇨 분석에서는 Aedes aegypti 모기 성인에서
참고 :이 프로토콜은 작성자에 의해 개발되었으며황열병의 모기의 aquaporin 단백질의 RNAi - 중재 최저 사용은 aegypti 1 Aedes. 개별 모기 사이의 다양성을 방지하려면 모기는 그룹에서 분석되어야한다. 기술적인 이유로 치료를 당 5 모기 그룹을 권장합니다 - 모기가 주사 후에 소변 나물을 시작하기 전에 첫 번째 체중 측정을 수행하는 시간을 제한 금액이 있습니다.
6. 모기를 수집하고 마취
- 모기를 수집하기 전에 분석 정밀 밸런스를 사용하는 모자와 빈 컬렉션 유리병의 무게를 기록합니다. 이 유리병은 모든 후속 측정에 사용됩니다.
- 흡인기로 무게 수집 유리병에 5 암컷 모기를 수집합니다. 수거 유리병 위에 뚜껑을 놓고하고 모기를 마취하는 데 몇 초 동안 CO 2 패드에 앉자.
7. 초기 무게 측정
- T를 타고정밀 밸런스에 모자와 모기를 포함하는 컬렉션 유리병을 배치하여 5 모기 그는 초기 체중 측정.
- 모기의 무게와 뚜껑으로 수집 병을 복용하고 뚜껑이있는 빈 컬렉션 유리병의 무게를 빼는 방법으로 다섯 모기 그룹의 무게를 계산합니다.
- 수거 유리병을 열고 모기의 무게를 기록 후 직접 CO 2 패드에 모기를 놓습니다. 모기가 무게를 측정하는 동안 깨어하기 시작한다면, 그것을 열고 패드에 모기를 삽입하기 전에 몇 초 동안 CO 2 패드에 유리병을 설정합니다.
8. 사출 준비
- RNAi - 중재 유전자 최저 프로토콜에 주어진 지시에 따라 마이크로 주입기를 설정합니다.
- 마이크로 분사기의 유리 모세관 바늘을 놓고 바늘의 팁을 끊다 때문에 너비가 liq 충분히 크다을 통해 흐를하는 UID.
- 잠수함 PBS 버퍼에 바늘과 주사 바늘로 버퍼를 그려,이 프로토콜에 사용할 원하는 금액은 각 모기에 대한 PBS의 1.25 μl입니다. 참고 :이 금액은 여성 모기 오에 의해 함락되는 혈장의 평균 금액을 모방한 것이었 지요.
9. 모기 분사
- 마이크로 주입기로 쉽게 접근할 수 있도록 모기를 줄입니다.
- 바늘이 곳에되면 모기에 PBS 버퍼를 날려요.
- 액체는 모기에 주입되면, 비말은 흉부의 외부에 형성하고 있습니다. 이러한 비말은 신중하게 다음 단계 전에 제거되어야한다.
- 다음은 모기와 함께 사출 과정을 반복합니다. 경험을 바탕으로 모기 생존율은 주사 후 거의 100 %가 될 것입니다.
10. 무게 모기
- 주사 후에는 부드럽게 수집 유리병에 모기 배치그리고 모자. 정밀 밸런스에 모자와 모기를 포함하는 컬렉션 유리병을 배치하여 5 모기의 첫 번째 체중 측정을 가져가라.
- 뚜껑과 모기와 수집 유리병의 무게를 복용하여 5 모기 그룹의 무게를 계산하고 뚜껑이있는 빈 컬렉션 유리병의 무게를 뺍니다. 참고 : 모기가 CO 2 마취 패드에서 제거 후 2 분 이내에 소변을 만들어내는 시작할 것이다, 그래서 그들이 나물을 시작하기 전에 체중 측정을하는 것이 중요합니다.
- 그들은 소변을 만들어내는 시작됩니다 작은 용기에 모기를 놓습니다.
11. 두 번째 이후 무게 측정
참고 : 모기의 무게 측정이 30 분 간격으로 복용해야하지만, 이것은 배설 속도에 따라 짧은 이상 간격을 조정할 수 있습니다.
- 30 분 후에, grou를 수집뚜껑과 같은 컬렉션 유리병에 흡인기 5 모기 P. 정밀 밸런스에 모자와 모기를 포함하는 컬렉션 유리병을 배치하여 모기의 다음 체중 측정을 가져가라.
- 측정 후, 다음 30 분 동안 동일한 지주 용기에 모기를 놓습니다.
- 시간을 원하는 금액에 대해이 과정을 반복합니다.
12. 결정 모기 배설 속도
- 5 모기의 그룹으로 주입되었다 액체의 총 금액이 즉시 주사 후 체중에서 모기의 초기 무게를 빼는 방법으로 계산 할 수 있습니다.
- 특정 시점에서 모기의 그룹에 의해 배설되었다 소변의 양은 특정 시점에서 모기의 무게에서 모기의 초기 무게를 빼는 방법으로 계산 할 수 있습니다.
- 특정 시점에서 배설 율은 divi하여 계산할 수액체 주입 (표 1)의 총 금액하여이 시점에서 배설 소변 딩 금액입니다.
13. 대표 결과
유전자 최저 RNAi - 중재 및 생체내의 이뇨 분석에서이 Aedes aegypti 모기 이뇨의 aquaporins의 효과를 연구하기 위해 한센 실험실에서 사용되었습니다. Aedes aegypti Malpighian tubules로 표현되는 세 aquaporins는 모기 1 제어할 비해 배설 속도에 상당한 효과를 무너 뜨 렸어되었다. 그림 4는 이뇨 분석은 Aedes aegypti 및 Culex quinquefasciatus 사이에 배설 률을 비교하는 데 사용되었습니다 실험의 대표적인 결과를 보여줍니다 서로 다른 온도에서.
1 그림. 10 모기 EA의 RNAi / 이뇨 분석의 흐름도 5. 그룹채널은 특정 유전자에 대한 dsRNA을 주사하고 십 모기 오천 그룹은 통제 dsRNA로 주입된다. PBS 200 μm의 HgCl 2 주입 모기의 또 다른 그룹은 긍정적인 컨트롤로 사용됩니다. 이 모기는 주입하기 전에, 3 시간 삼십분 간격의 주입 후에 무게가있다.
그림 2. RNAi - 중재 유전자 최저 및 생체내의 이뇨 분석의 간단한 미세 주입 장치. A. 유리 모세관 바늘은 주사에 사용. 회색 삼각형은 모기에 액체 주입의 양을 표시하는 바늘에 그려진 mm 단위로 나타냅니다. B. 한 ML의 주사기는 마이크로 주입기을 만드는 데 사용. 흰색 삼각형 바늘 허브를 대표하고 검정색 삼각형은 주사기의 플런저에 연결된 고무 플런저 머리를 나타냅니다. C. 관은에 마우스 피스를 장착하는 데 사용주입기. microinjection 장치의 마우스 피스로 사용됩니다 D. 한 ML 일회용 피펫 팁 (파란색 팁). E. AD 부품을 통합 microinjection 장치. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .
그림 3. 최적 모기 주입 사이트. A. 여성 Aedes aegypti 모기는 흉부에 큰 비늘 사이에 유리 모세관 바늘로 주입. 검은 막대는 크기 비교를위한 1mm를 나타냅니다. 암컷 모기 흉부의 그림 B.와 흰 반점은 모기 외골격의 하얀 비늘을 나타냅니다. 주사 바늘은 피어스 반점 사이에 모기가 주사하는 동안 사망률을 최소화해야합니다.
4 그림. 온도의 영향Culex quinquefasciatus 및 Aedes aegypti의 이뇨에 진짜야가. 이뇨 분석은 서로 다른 온도에서, 모기, Aedes aegypti 및 Culex quinquefasciatus의 두 종족으로 수행되었다. 주사 후 첫 시간 동안 배설 율은 퍼센트에 있습니다.
| 그룹 | 타라 (G) | 주입하지 (G) | 주입 후 (G) | 1 시간 게시물 주입 (G) | 평균 중량 (MG) | 양을 주입 (μl) | 금액 배설 (μl) | % 배설 |
| 일 | 7.5938 | 7.6057 | 7.6104 | 7.6096 | 2.38 | 0.94 | 0.16 | 17.0 |
| 2 | 7.8252 | 7.8349 | 7.8415 | 7.8403 | 1.94 | 1.32 | 0.24 | 18.2 |
| 3 | 7.8896 | 7.9026 | 7.9077 | 7.906 | 2.6 | 1.02 | 0.34 | 33.3 |
생체내의 이뇨 분석 결과 표 1. Aedes aegypti 4.에서 Aedes aegypti 모기 암컷으로 수행한 생체내의 이뇨 분석에서 ° C.의 원시 데이터
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Discussion
사용되는 RNAi 프로토콜은 캘리 포니 아주 리버 사이드 6,7 대학에서 알렉산더 Raikhel의 연구실에서 개발 Garver 및 Dimopoulos 사에 의해 출판 프로토콜과 비슷했습니다. 이 비디오 프로토콜에 표시된 실험적 접근 방법은 생체내 환경에의 곤충 이뇨에 관련된 유전자를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 곤충, Malpighian의 tubules의 배설 기관은 이뇨를위한 '단순'모델 시스템으로 연구자 세대의 관심을 받고있다. 이 오르간은 Drosophila의 통관 8 일 현재 RNAi와 같은 역방향 유전 방식과 다른 곤충 종의에서 공부하실 수 있습니다 Malpighian 가느다란 관 생리학 9,10에 관련된 많은 유전자를 발견했다 xenobiotics에 관한 일을하고있다. 많은 동종 유전자는 쉽게 다양한 곤충 종 11 게시된 게놈 시퀀스에서 확인할 수 있습니다. 세 일 이전 모기 때문에이 시간 POI에서이 프로토콜에 사용되었다NT들은 혈액 식사를 취할 능력이된다.
여러 다른 배설의 assays가보고되었습니다. 고전 램지 분석은 시험 관내 12 격리된 Malpighian tubules에 이뇨를 공부하는 데 사용되었습니다. 본 분석에서는 단일 tubules은 고립되고 근위 부분이 열려있는 동안 말초 부분은 생리 식염수 한 방울로 배치됩니다. 이뇨제 활동 근위 부분의 끝에 형성 소변 비말의 크기를 측정하여 계산됩니다. 램지 분석 사용하면, 하나는 개인 Malpighian tubules에 의해 소변 생산의 금액을 측정할 수 있습니다. 우리 이뇨 분석은 전체 - 모기 배설 속도 측정 가능하며, 따라서 램지 분석의 대안이 아닙니다. 대신, 두 assays 함께 사용하면 상호 보완적인 정보를 제공할 수 있습니다.
생체내 배설의 assays의 기타는 Musca domestica 및 Aedes aegypti를 위해 개발되었습니다. 엠이 domestica 연구 참여D 흐름을 통해 습도 측정기 13에 의한 물의 손실 측정. 유사한 기술은 정밀 습도에게 챔버 14를 사용하여 배설 률을 측정하여 Aedes aegypti의 이뇨를 공부하는 데 사용되었다. 기술적으로 위에서 언급한 기술로 요구하고 그럼에도 불구하고 완전한 유기체의 맥락에서 배설 률에 대한 매우 정확한 데이터를 생산으로서 여기에 제시된 생체내의 이뇨 분석에 있지 않습니다.
여기에 제시된 생체내의 이뇨 분석에서 향후 애플 리케이션의 광범있다. RNAi과 같은 유전 방식을 바꿀뿐만 아니라 그것은 곤충 이뇨에, 예를 들어 신호 전달 억제제 등을 위해 약물의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 대상 곤충에 xenobiotics 통관 과정을 연구하는 강력한 분석이다.
더 이상 이러한 분석을 개발하면서 우리가 해결할 수있는 문제는 다음과 같습니다) 농도 및 사출 버퍼의 조성. 우리우리가 식염수 15 모기와 다른 곤충에 대한 더 적절한 될 것 같은 생리 Aedes처럼 지금까지 있지만 다른 버퍼를 수행한 실험에 PBS를 사용했습니다. 나) 특히 다른 종, 비 피를 빨아먹는 곤충이 방법을 적용합니다. 같은 수종으로 주입 수있는 버퍼의 금액은 경험적으로 각 종족에 대한 결정되어야한다. C) 실험 오류를 최소화합니다. 우리는 우리의 분사 및 측정 기법을 최적화합니다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
저자는이 프로토콜의 그녀 비판적 의견 빅토리아 카펜터 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion | AM1334 | |
| PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Plastic tubing | Local Supplier | PVC | |
| 1 ml plastic pipette tip | VWR international | 83007-376 | Blue tip |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Scissors | Local Supplier | ||
| Metal needle | Carolina Biological | 654307 | Size 5 |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | |
| Glass capillary needles | World Precision Instruments, Inc. | 1B200-6 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| One pint waxed lined cardboard cups | Local Supplier | Manufactured soup cups | |
| Mesh net | Local Supplier | plastic fly gauze |
References
- Drake, L. L., et al. The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 5, e15578 (2010).
- Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination. Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).
- Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).
- Clements, A. N. Volume 1 Development, Nutrition, and Reproduction. The Biology of Mosquitoes. 2, Chapman & Hall. London. (1992).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10626-10631 (2004).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. The Journal of biological chemistry. 280, 20565-20572 (2005).
- Pannabecker, T. Physiology of the Malpighian Tubule. Annual review of entomology. 40, 493-510 (1995).
- Dow, J. New insights into Malpighian tubule function from functional genomics. Comp Biochem Phys A. 150, S135 (2008).
- Dow, J. A. T. Insights into the Malpighian tubule from functional genomics. Journal of Experimental Biology. 212, 435-445 (2009).
- Lawson, D., et al. VectorBase: a data resource for invertebrate vector genomics. Nucleic acids research. 37, 583-587 (2009).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).
- Coast, G. M. Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis. Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).
- Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).
- Hays, A. R., Raikhel, A. S. A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes. Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).
