Summary
I detta protokoll kombinerar vi RNAi-medierad geners uttryck med en
Abstract
Denna video protokollet visar en effektiv teknik för att knockdown en viss gen i en insekt och genomföra en ny bioassay för att mäta utsöndringshastighet. Denna metod kan användas för att erhålla en bättre förståelse av förfarandet enligt diures hos insekter och är speciellt användbar vid studier av diures i livnär sig på blod artropoder som har förmåga att ta upp stora mängder av vätska i en enda blodmjöl.
Detta RNAi-medierad gen knockdown i kombination med en in vivo-diures analys har utvecklats av Hansen labbet för att studera effekterna av RNAi-medierad knockdown av aquaporin gener på Aedes aegypti mygga diures 1.
Protokollet är inställt i två delar: den första demonstrationen visar hur man konstruerar en enkel anordning mygga injektion och hur man förbereder och injicerar dsRNA i bröstkorgen av myggor för RNAi-medierad gen knockdown. Den andra demonstrationen visar hur man bestämmerutsöndringshastigheter i myggor som använder en in vivo-bioanalys.
Protocol
Del I - RNAi-medierad gen knockdown i vuxen Aedes aegypti myggor. För experimentet översikt se figur 1.
1. dsRNA Syntes
- Syntetisera specifika dsRNA mot gener av intresse och kontroll dsRNA. Observera: Vi rekommenderar u primrar för PCR-fragment i intervallet 300 till 500 baspar är belägna vid 3'-änden av den specifika cDNA-2 och med den T7-primer-sekvensen bunden vid 5'-änden (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 '). Unika fragmenten bör bekräftas med BLASTN analys 3.
- Använd Ambion Megascript T7 hög Kit Yield transkription (Ambion, tabell över reagenser) som använder T7 RNA-polymeras för transkriptionsreaktionen att syntetisera dsRNA. Obs: liknande reagenser och kit finns någon annanstans.
- För att rena dsRNA, fäll ut med litiumklorid följa instruktionerna med Megascript kit.
- Efter purificatjon, upplös pelleten dsRNA i sterilt vatten. För att säkerställa tillräcklig viskositet för mikroinjektion bör dsRNA koncentrationen inte överstiga 2 ng / il.
2. Injektion Framställning
- En enkel mikro injektor kan konstrueras genom användning av rör, saxar, en metall nål, en 1 ml spruta och en 1 ml plastpipett spets (se figur 2). Slangen kapas till ca 40 cm i längd. Alternativt kan en automatiserad mikro injektor användas såsom Drummond Nanojet II 4.
- Skära spetsen av sprutan (nålnavet) vid 2 ml skalmärke och avlägsna huvudet gummikolven från kolven.
- Stansen ett hål med en metallnål i gummit kolvhuvudet och plats gummit kolvhuvudet bakåt i nålnavet.
- Placera nålnavet i en ände av slangen och placera en 1 ml spets plastpipett i den andra änden, som kommer att användas som munstycket (alternativt en 10 ml syRinge kan användas för att framställa det lufttryck som krävs för injektion).
- Placera en glaskapillär nål i hålet i gummit kolvhuvudet och bryta spetsen av nålen så att bredden är tillräckligt stor för vätska att strömma därigenom. Anm: Den optimala storleken på nålspetsen måste bestämmas empiriskt - om bredden hos nålen är för stor kommer det att resultera i trauma och en hög mygga dödlighet, om nålen bredden är för liten, kommer det att vara omöjligt att penetrera Mosquito exoskelett.
- Nedsänkas injektionsnål i den preparerade dsRNA provet och dra det flytande provet i injektionsnål genom att suga upp vätskan med munstycket (eller en spruta). Obs: Detta steg är identisk för alla flytande reagens som injiceras i myggor, inklusive PBS-buffert, som används i in vivo-diures analysprotokollet (se nedan).
3. Samla och Bedöva myggor
- Kollekt myggor med en batteridriven sugapparat i ett uppsamlingskärl. Sätta ett tak över insamlingen flaskan och placera flaskan på en ren CO 2 pad att bedöva myggor. Obs: Alternativt myggor kan vara sövd på is.
4. Mygga Injektion
- Öppna uppsamlingskärl och placera myggen direkt på CO 2 dynan och vänta tills myggor sövs.
- Släng alla män.
- Rada upp myggen på sidan för att möjliggöra enklare tillträde för injektion.
- Ta myggor i benen eller vingarna för att undvika skador. Du kan också använda en fin pensel eller fjäder att manipulera myggor.
- När den är klar att spruta den första mygga försiktigt stödja en sida av bröstkorgen med tången och in spetsen av nålen i den andra sidan av bröstkorgen (figur 2). Det är bättre att injicera i en tunn del av nagelband och undvika att trycka nåleno djupt in i bröstkorgen.
- När nålen är på plats, blåsa upp vätskan i myggan. Den önskade mängden kan bestämmas genom övervakning av vätskemenisken i nålen. Antalet millimeter som är nödvändiga för en specifik volym kan fastställas genom beräkning av cylindern volym av glaskapillären nålen (πr 2 h). Den effektiva mängden av dsRNA som typiskt används för injektion är 1 pg.
- När väl vätskan injiceras i mygga, noggrant dra in nålen. Om en stor vätskedroppe bildas på utsidan av bröstkorgen, bör mygga kasseras. Sedan upprepa processen med nästa mygga.
5. Mosquito Återvinning och lagring
- Efter injektion, placera myggor i en behållare för lagring. Till exempel, fodrad en pint vax kartong koppar (soppa koppar) med mesh beläggning säkras med kartongen locket. Locket har en del utskuren för nät som täcker exponeras. När alla mosquitoes placeras i behållaren, placera behållaren i en miljömässigt kontrollerad kammare för inkubation och ge myggor med en näringskälla, såsom 20% indränkt bollarna sackaros bomull placerade ovanpå nätet täcker. Innan du utför in vivo diures analys, beröva dsRNA-injicerade myggor i en vattentäkt i 12 timmar för att standardisera hydratisering tillstånd för varje mygga.
- Effektiviteten av dsRNA-medierad gen knockdown kan vara variabel. Geners uttryck kan börja 1 dag efter injektionen och det kan vara upp till 6 dagar efter injektion 4. Den optimala tiden för att uppnå maximal gen knockdown måste bestämmas empiriskt för varje använt gen. Generellt väntar vi 3 dagar efter dsRNA injektion innan vi går vidare.
Del II - In vivo diures analys i vuxen Aedes aegypti myggor
Obs: Detta protokoll har utvecklats av författarna ochanvänds för RNAi-medierad knockdown av aquaporin proteiner i gula febern mygga Aedes aegypti 1. För att undvika variabilitet mellan enskilda myggor, bör myggor analyseras i grupp. Av tekniska skäl rekommenderar vi grupper om 5 myggor per behandling - det finns en begränsad tid för att utföra den första vikten mätning före myggor börjar utsöndra urin efter injektion.
6. Samla och Bedöva myggor
- Före uppsamling av myggor, registrera vikten för en tom uppsamlingskärl med ett lock med användning av en analytisk precisionsvåg. Injektionsflaskan kommer att användas för alla efterföljande mätningar.
- Samla 5 kvinnliga myggor i den vägda uppsamlingskärl med en aspirator. Placera locket över insamlingen flaskan och låt det sitta på CO 2 pad under flera sekunder för att bedöva myggen.
7. Initial viktmätning
- Ta tHan ursprungliga vikt mätning av de 5 myggor genom att placera uppsamlingskärl som innehåller myggor med locket på precision balansen.
- Beräkna vikten av den grupp av 5 myggor genom att vikten av myggor och uppsamlingskärl med lock och subtrahera vikten av den tomma uppsamlingskärl med lock.
- Öppna uppsamlingskärl och placera myggor direkt på CO 2 dynan efter registrering av vikten av myggor. Om myggor börjar vakna upp under viktmätningar, som flaskan på CO 2 pad för flera sekunder innan du öppnar den och placera myggor på plattan.
8. Injektion Framställning
- Ställ in mikro injektorn att följa instruktionerna som ges i RNAi-medierad gen knockdown protokollet.
- Placera en glaskapillär nål i mikro injektorn och bryta spetsen av nålen bort så bredden är stor nog för Liquid att strömma igenom.
- Sänk nålen i PBS-buffert och dra bufferten i injektionsnålen är önskad mängd som ska användas för detta protokoll 1,25 fil av PBS för varje mygga. Obs: Detta belopp efterliknar genomsnittliga mängden blodplasma som tas upp av en kvinnlig mygga 5.
9. Mygga Injektion
- Rada upp myggen för att möjliggöra enklare åtkomst med mikro injektorn.
- När nålen är på plats, blåsa PBS-buffert in i myggan.
- När väl vätskan sprutas in i mygga, kan en droppe bildas på utsidan av bröstkorgen. Denna droppe måste noggrant avlägsnas innan nästa steg.
- Upprepa denna injektion process med nästa mygga. Med erfarenhet kommer myggor överlevnad är nästan 100% efter injektion.
10. Vägning Myggor
- Efter injektionen försiktigt placera myggor i samlingen flaskanoch locket. Ta den första vikten mätningen av de 5 myggor genom att placera uppsamlingskärl som innehåller myggor med locket på precision balansen.
- Beräkna vikten av den grupp av 5 myggor genom att vikten av myggor och uppsamlingskärl med locket och subtrahera vikten av den tomma uppsamlingskärl med lock. Obs: myggor börjar utsöndra urin inom 2 minuter efter avlägsnande från CO 2 anestesi pad, så det är viktigt att ta viktmätning innan de börjar utsöndra.
- Placera myggor i en liten behållare där de kommer att börja utsöndra urin.
11. Andra och efterföljande Vikt Mått
Anmärkning: Vikt mätningar av myggor bör tas i 30 minuters intervall, men detta kan justeras med kortare eller längre intervall beroende på utsöndringshastigheter.
- Efter 30 min uppsamlades den grupperap av 5 myggor med en sug i samma uppsamlingskärl med lock. Ta nästa vikten mätning av myggor genom att placera uppsamlingskärl som innehåller myggor med locket på precision balansen.
- Efter mätningen placera myggor i samma anläggning behållare för de kommande 30 minuter.
- Upprepa denna procedur för en önskad tidsperiod.
12. Fastställande Mosquito utsöndringshastighet
- Den totala mängden vätska som sprutas in i gruppen av 5 myggor kan beräknas genom att subtrahera den ursprungliga vikten av myggorna från vikten omedelbart efter injektion.
- Den mängd urin som utsöndrades av gruppen av myggor vid en specifik tidpunkt kan beräknas genom att subtrahera den ursprungliga vikten av myggor från vikten av myggor vid den specifika tidpunkten.
- Utsöndringshastighet vid en specifik tidpunkt kan beräknas genom diviDing mängden urin utsöndras vid denna tidpunkt med den totala mängden vätska insprutad (tabell 1).
13. Representativa resultat
RNAi-medierad gen knockdown och in vivo diures analys har använts av Hansen labbet för att studera effekterna av aquaporiner i Aedes aegypti mygga diures. Tre aquaporiner som uttrycks i Aedes aegypti Malpighian tubuli slogs ned med betydande effekter på utsöndringshastigheter jämfört med kontroll myggor 1. Figur 4 visar representativa resultat av ett experiment där diures analysen har använts för att jämföra utsöndringshastigheter mellan Aedes aegypti och Culex quinquefasciatus vid olika temperaturer.
Figur 1. Flödesschema för RNAi / diures analys. 5 grupper om 10 myggor ealm injiceras med dsRNA för en specifik gen och ytterligare fem grupper om tio myggor injiceras med kontroll dsRNA. En annan grupp av myggor som injicerats med 200 ^ M HgCl 2 i PBS användes som en positiv kontroll. Dessa myggor väges före injektion och efter injektion i trettio minuters intervaller under 3 timmar.
Figur 2. En enkel mikro injektion enhet för RNAi-medierad gen knockdown och in vivo diures analys. A. Glaset kapillära nålar används för injektion. Den grå triangeln representerar millimeter steg dras på nålen för att indikera mängden vätska sprutas in i mygga. B. 1 ml spruta används för att konstruera mikro injektorn. Den vita triangeln representerar nålnavet och en svart triangel representerar huvudet gummikolven fäst till kolven i injektionssprutan. C. slangar som används för att fästa munstycket för attinjektorn. D. 1 ml pipettspets av engångstyp (blå spets) som används som munstycket på mikroinjektion anordningen. E. mikroinjektion enhet som innehåller AD delar. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Optimal mygga injektionsstället. A. Kvinna Aedes aegypti mygga injiceras med en glaskapillär nål mellan de stora skalorna på bröstkorgen. Den svarta stapeln visar 1 mm för storlek jämförelse. B. En ritning av den kvinnliga myggor bröstkorgen och de vita fläckarna representerar vita fjäll i mygga exoskelett. Injektionsnålen ska genomborra mygga mellan fläckarna för att minimera dödligheten under injektion.
Figur 4. Effekter av temperaning på Culex quinquefasciatus och Aedes aegypti diures. diures Analysen utfördes med två arter av myggor, Aedes aegypti och Culex quinquefasciatus, vid olika temperaturer. Utsöndringshastighet under den första timmen efter injektion ges i procent.
| Grupp | TARA (G) | inte injicerat (G) | efter injektion (G) | 1h efter injektion (G) | medelvikt (mg) | Mängden injicerad (Il) | mängd utsöndras (Il) | % Utsöndras |
| 1 | 7,5938 | 7,6057 | 7,6104 | 7,6096 | 2,38 | 0,94 | 0,16 | 17,0 |
| 2 | 7,8252 | 7,8349 | 7,8415 | 7,8403 | 1,94 | 1,32 | 0,24 | 18,2 |
| 3 | 7,8896 | 7,9026 | 7,9077 | 7,906 | 2,6 | 1,02 | 0,34 | 33,3 |
Tabell 1. Aedes aegypti resultat in vivo diures analysbetingelser. Rådata från in vivo-diures-analys utfördes med Aedes aegypti honmyggorna vid 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det RNAi protokoll som används har utvecklats i laboratoriet Alexander Raikhel vid University of California Riverside 6,7 och liknar ett protokoll publicerats av Garver och Dimopoulos 4. Den experimentella metoden visad i denna video protokoll kan användas för att studera gener involverade i insekts diures i en in vivo-miljö. Utsöndringsorganen av insekter, de Malpighian tubuli, har väckt intresse hos generationer av forskare som en "enkel" modell för diures. Detta organ är involverad i xenobiotika clearance 8 och arbete i Drosophila har identifierat ett flertal gener som är involverade i Malpighian tubuli fysiologi 9,10 som nu kan studeras i andra insektsarter med omvända genetiska metoder som RNAi. Många homologa gener kan lätt identifieras i de publicerade genomet sekvenser av olika insektsarter 11. Tre dagar gamla myggor användes i detta protokoll eftersom det vid denna tid point de blir behörig att fatta ett blodmjöl.
Flera andra utsöndring analyser har rapporterats. Den klassiska Ramsay analys har använts för att studera diures i isolerade Malpighian tubuli in vitro 12. Vid denna analys enstaka tubuli isoleras och den distala delen placeras i en droppe av saltlösning, medan den proximala delen är öppen. Diuretisk aktivitet beräknas genom att mäta storleken på droppen urin som bildar vid slutet av den proximala delen. Med hjälp av Ramsay analysen kan man mäta mängder urin produktionen av enskilda Malpighian tubuli. Vår diures analysen möjliggör mätningar av hel-mygga utsöndringshastigheter och är därför inte ett alternativ till den Ramsay analysen. Istället kan båda analyserna ger kompletterande information om de används tillsammans.
Andra in vivo-utsöndring analyser har utvecklats för Musca domestica och Aedes aegypti. Den M. domestica studie inbegriperd mätning av vattenförlust genom en genomflödes-fuktighet mätaren 13. En liknande teknik användes för att studera Aedes aegypti diures genom mätning utsöndringshastigheter med användning av en precisions fuktkammare 14. In vivo diures analys presenteras här är inte så tekniskt krävande som de ovan nämnda teknikerna och ändå producerar mycket exakta uppgifter om utsöndring priser i samband med en komplett organism.
Det finns ett brett utbud av framtida tillämpningar för in vivo diures analys som presenteras här. Förutom att omvänd genetik metoder som RNAi kan användas för att studera effekten av läkemedel, för transduktion exempel på en signal inhibitorer etc, på insekt diures. Det är också en kraftfull analys för att studera processen av xenobiotika clearance i målinsekter.
Problem som vi kommer att ta upp medan ytterligare utveckla denna analys är: A) Koncentrationen och sammansättningen av injektionen bufferten. Vianvänds PBS för experimenten vi klarat sig hittills men andra buffertar som Aedes Fysiologisk saltlösning 15 kan visa sig vara mer lämpliga för myggor och andra insekter. B) Tillämpning av denna metod till andra arter, särskilt icke-blodsugande insekter. Mängderna av buffert som kan injiceras in i sådana arter måste bestämmas empiriskt för varje art. C) Minimera experimentella fel. Vi kommer att optimera vår injektion och mätteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar Victoria snickare för hennes kritiska kommentarer i detta protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion | AM1334 | |
| PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Plastic tubing | Local Supplier | PVC | |
| 1 ml plastic pipette tip | VWR international | 83007-376 | Blue tip |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Scissors | Local Supplier | ||
| Metal needle | Carolina Biological | 654307 | Size 5 |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | |
| Glass capillary needles | World Precision Instruments, Inc. | 1B200-6 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| One pint waxed lined cardboard cups | Local Supplier | Manufactured soup cups | |
| Mesh net | Local Supplier | plastic fly gauze |
References
- Drake, L. L., et al. The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 5, e15578 (2010).
- Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination. Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).
- Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).
- Clements, A. N. Volume 1 Development, Nutrition, and Reproduction. The Biology of Mosquitoes. 2, Chapman & Hall. London. (1992).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10626-10631 (2004).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. The Journal of biological chemistry. 280, 20565-20572 (2005).
- Pannabecker, T. Physiology of the Malpighian Tubule. Annual review of entomology. 40, 493-510 (1995).
- Dow, J. New insights into Malpighian tubule function from functional genomics. Comp Biochem Phys A. 150, S135 (2008).
- Dow, J. A. T. Insights into the Malpighian tubule from functional genomics. Journal of Experimental Biology. 212, 435-445 (2009).
- Lawson, D., et al. VectorBase: a data resource for invertebrate vector genomics. Nucleic acids research. 37, 583-587 (2009).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).
- Coast, G. M. Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis. Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).
- Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).
- Hays, A. R., Raikhel, A. S. A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes. Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).
