Summary
I denne protokol vi kombinerer RNAi-medieret gen silencing med en
Abstract
Denne video protokol viser en effektiv teknik til at Knockdown et bestemt gen i et insekt og udføre en ny bioassay at måle udskillelse. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at opnå en bedre forståelse af processen diurese i insekter, og er især nyttig ved undersøgelse af diurese i blod-fodring arthropoder, som er i stand til at optage store mængder væske i en enkelt blodmel.
Dette RNAi-medieret gen knockdown kombineret med en in vivo-diurese assay blev udviklet af Hansen laboratoriet at undersøge virkningerne af RNAi-medieret knockdown af aquaporin gener på Aedes aegypti myg diurese 1.
Protokollen er setup i to dele: den første demonstration viser, hvordan man kan konstruere en simpel myg injektionsanordning og hvordan man kan forberede og injicere dsRNA i thorax af myg for RNAi-medieret gen knockdown. Den anden demonstration viser, hvordan man fastlæggerudskillelseshastigheder i myg ved hjælp af et in vivo bioassay.
Protocol
Del I - RNAi-medieret gen knockdown i voksen Aedes aegypti myg. Til eksperiment oversigt se figur 1.
1. dsRNA Syntese
- Syntetisere specifikke dsRNAs mod gener af renter og kontrol dsRNAs. Bemærk: Det anbefales at udvikle primere til PCR-fragmenter i området fra 300 til 500 basepar placeret ved 3'-enden af den specifikke cDNA 2 og med T7-primeren sekvensen bundet i 5'-enden (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 '). Entydighed af de fragmenter skal bekræftes ved BLASTN analyse 3.
- Anvende Ambion Megascript T7 High Yield Transcription Kit (Ambion, tabel af reagenser), som anvender T7-RNA-polymerase for transkription-reaktionen til at syntetisere dsRNA. Bemærk: lignende reagenser og kits er tilgængelige andre steder.
- For at rense dsRNA, bundfald med lithiumchlorid følge instruktionerne med Megascript kit.
- Efter purification, opløses dsRNA pellet i sterilt vand. For at sikre tilstrækkelig viskositet til mikroinjektion, bør dsRNA koncentration ikke overstiger 2 ug / ul.
2. Injektionspræparat
- En simpel mikro injektoren kan konstrueres ved hjælp af rør, saks, en metalnål, en 1 ml sprøjte og en 1 ml plastik pipettespidsen (se figur 2). Røret bør skæres til ~ 40 cm i længden. Alternativt kan en automatiseret mikro injektor anvendes, såsom Drummond Nanojet II fire.
- Skære spidsen af sprøjten (kanylemuffen) ved 2 ml skala mærket og fjerne gummi stempelhovedet fra stemplet.
- Punch et hul ved hjælp af en metal nål i gummistemplet hovedet og sted gummistemplet hovedet tilbage i nålehubben.
- Placere kanylemuffen i den ene ende af røret og placere en 1 ml plastpipette spids i den anden ende, som vil blive anvendt som mundstykket (alternativt et 10 ml syRinge kan anvendes til fremstilling af lufttrykket nødvendige til injektion).
- Placere et glaskapillar nål i hullet i gummiet stempelhovedet og bryde spidsen af nålen, så bredden er stor nok til væske at flyde igennem. Bemærk: Den optimale størrelse af nålespidsen skal bestemmes empirisk - hvis bredden af nålen er for stor dette vil resultere i trauma og en høj myg dødelighed, hvis nålen bredden er for lille, vil det være umuligt at trænge myg Exoskeleton.
- Nedsænkes injektionsnålen i den klargjorte dsRNA prøven og trække den flydende prøve i kanylen ved at suge væske op til mundstykket (eller en sprøjte). Bemærk: Dette trin er identisk for alle flydende reagenser, der er injiceret i myg, herunder PBS-buffer, som anvendes i in vivo-diurese assayprotokollen (se nedenfor).
3. Indsaml og bedøver Myg
- Indsamlingt myg med en batteridrevet aspirator til en samling hætteglas. Placer en hætte over opkrævningen hætteglasset og placer hætteglasset på en ren CO 2 pad til at bedøve myg. Bemærk: Alternativt myg kan blive bedøvet på is.
4. Mosquito Injection
- Åbn indsamling hætteglasset og placer myg direkte på CO 2-pad og vente, indtil myg er bedøvet.
- Kassér alle mænd.
- Justér de myg på den side, der giver mulighed for lettere adgang til injektion.
- Grab myg ved benene eller vingerne for at undgå skader. Du kan også bruge en fin pensel eller fjer at manipulere myg.
- Når klar til at injicere den første myg, forsigtigt understøtter den ene side af thorax med pincet og spidsen af nålen i den anden side af thorax (figur 2). Det er bedre at tilføre en tynd del af kutikula og undgå at skubbe nålen tilo dybt ind i brystkassen.
- Når nålen er på plads, blæse væsken til myg. Den ønskede mængde kan bestemmes ved overvågning af væsken menisken i nålen. Antal millimeter nødvendige for en specifik mængde kan bestemmes ved at beregne cylinderen volumen glaskapillar nålen (πr 2 h). Den effektive mængde af dsRNA, der typisk anvendes til injektion er 1 ug.
- Når væsken indsprøjtes i myg, forsigtigt trække nålen. Hvis en stor væskedråbe former på ydersiden af thorax, skal myg kasseres. Derefter skal du gentage denne proces med den næste myg.
5. Mosquito nyttiggørelse og oplagring
- Efter injektion, placeres myg i en beholder til opbevaring. For eksempel, foret en pint voks pap kopper (suppe kopper) med mesh belægning fastgøres med låg af karton. Låget har en del skåret ud for masken omfatter at blive udsat for. Når alle mosquitoes anbringes i beholderen ved at placere beholderen i et miljømæssigt kontrolleret kammer til inkubation og give myg en fødekilde, såsom 20% sucrose gennemvædet vatkugler placeret oven på mesh belægning. Før udførelse af in vivo diurese analyse, fratage dsRNA'et-injicerede myg af en vandkilde for 12 timer at standardisere hydrering tilstand af hver myg.
- Effektiviteten af dsRNA-medieret gen knockdown kan være variabel. Gene silencing kunne begynde 1 dag efter injektion, og det kan vare op til 6 dage efter injektion 4. Den optimale tid til at opnå maksimal genet knockdown skal bestemmes empirisk for hver anvendt genet. Generelt vi vente 3 dage efter dsRNA'et injektion før vi går videre.
Del II - In vivo diurese analysen i voksen Aedes aegypti myg
Bemærk: Denne protokol er blevet udviklet af forfatterne oganvendes til RNAi-medieret knockdown af aquaporinproteiner i den gule feber myg Aedes aegypti 1. For at undgå variation mellem de enkelte myg, bør myg analyseres i grupper. Af tekniske årsager, anbefaler vi grupper af 5 myg per behandling - der er en begrænset mængde tid til at udføre den første vægtmåling før myggene begynder at udskille urin efter injektion.
6. Indsaml og bedøver Myg
- Før opsamling af myg, registrerer vægten af en tom samling hætteglas med et låg med en analytisk nøjagtighed balance. Hætteglasset skal bruges til alle efterfølgende målinger.
- Saml 5 kvindelige myg i den vejede kollektionen hætteglas med en emhætte. Sæt hætten over opkrævningen hætteglasset og lad det sidde på CO 2-pad til flere sekunder til at bedøve de myg.
7. Initial vægtmåling
- Tag than startvægt måling af de 5 myg ved at placere samlingen hætteglasset med myggene med hætten på præcision balance.
- Beregne vægten af gruppe 5 myg ved at tage vægten af myg og samlingen hætteglasset med låg og subtrahere vægten af den tomme samlingen hætteglas med låg.
- Åbn indsamling hætteglasset og placer myg direkte på CO 2 puden efter optagelse af vægten af de myg. Hvis myg er begyndt at vågne op i løbet af vejningen, skal du indstille hætteglasset på CO 2-pad i flere sekunder, før du åbner den og placere myggene på puden.
8. Injektionspræparat
- Opstil mikro injektor følge anvisningerne i RNAi-medieret gen Knockdown protokol.
- Placere et glaskapillar nål i mikro injektoren og bryde spidsen af nålen, så bredden er stor nok til liquid at strømme igennem.
- Nedsænkes nålen i PBS-buffer og trække pufferen i kanylen, den ønskede mængde til brug for denne protokol er 1,25 ul PBS til hver myg. Bemærk: Dette beløb efterligner den gennemsnitlige mængde blodplasma, som er taget op af en kvindelig myg 5.
9. Mosquito Injection
- Justér de myg at give mulighed for lettere adgang til mikro-injektor.
- Når nålen er på plads, blæse PBS buffer i myg.
- Når væsken injiceres i myg kan en dråbe dannes på ydersiden af thorax. Denne dråbe skal fjernes omhyggeligt før næste trin.
- Gentag denne injektionsprocessen med den næste myg. Med erfaring, vil myg overlevelsesrate være næsten 100% efter injektion.
10. Vejning Myg
- Efter injektionen, skal du placere forsigtigt myggene i samlingen hætteglassetog hætten. Tag den første vægtmåling af de 5 myg ved at placere samlingen hætteglasset med myggene med hætten på præcision balance.
- Beregn vægten af den gruppe af 5 myg ved at tage vægten af myg og indsamling hætteglasset med låg og trække vægten af den tomme kollektionen hætteglas med hætte. Bemærk: myg vil begynde at udskille urin inden for 2 minutter efter fjernelse fra CO 2-bedøvelse pad, så det er vigtigt at tage vægtmåling før de begynder at udskille.
- Placer myg i en lille beholder, hvor de vil begynde at udskille urin.
11. Anden og efterfølgende Vejninger
Bemærk: Vejning af de myg, der skal tages i 30 minutters intervaller, men dette kan justeres til kortere eller længere mellemrum alt om udskillelse satser.
- Efter 30 minutter opsamles Group af 5 myg med en aspirator i den samme samling hætteglasset med låg. Tag det næste vægtmåling af myggene ved at placere samlingen hætteglasset med myggene med hætten på præcision balance.
- Efter målingen, placere myg i samme bedrift beholder for de næste 30 minutter.
- Gentage denne proces for en ønsket tid.
12. Bestemmelse Mosquito udskillelse
- Den totale mængde af væske, som blev injiceret i den gruppe af 5 myg kan beregnes ved at subtrahere den oprindelige vægt af myg fra vægten umiddelbart efter injektion.
- Mængden af urin, som blev udskilt af gruppen af myg på et bestemt tidspunkt, kan beregnes ved at subtrahere den oprindelige vægt af myg fra vægten af myggene det specifikke tidspunkt.
- Udskillelsen hastighed på et bestemt tidspunkt, kan beregnes ved at dividing mængden af urin udskilt på dette tidspunkt med den samlede mængde væske injiceres (tabel 1).
13. Repræsentative resultater
RNAi-medieret gen knockdown og in vivo diurese assay er blevet anvendt af Hansen laboratoriet at undersøge virkningerne af aquaporiner i Aedes aegypti myg diurese. Tre aquaporiner, som udtrykkes i Aedes aegypti Malpighian tubuli blev slået ned med en væsentlig indvirkning på udskillelseshastigheder sammenlignet med kontrol myg 1. Figur 4 viser repræsentative resultater af et forsøg, hvor diurese assay er blevet anvendt til at sammenligne udskillelseshastigheder mellem Aedes aegypti og Culex quinquefasciatus ved forskellige temperaturer.
Figur 1. Rutediagram over RNAi / diurese assay. 5 grupper med 10 myg ealm injiceres med dsRNA til et specifikt gen, og yderligere fem grupper med ti myg injiceres med kontrol dsRNA. En anden gruppe af myg injiceret med 200 uM HgCl2 i PBS anvendes som en positiv kontrol. Disse myg vejes før injektion, og efter injektion i tredive minutters intervaller i 3 timer.
Figur 2. En simpel mikroinjektion indretning til at RNAi-medieret gen knockdown og in vivo diurese assay. A. De glas kanylerne anvendes til injektion. Den grå trekant repræsenterer millimeter trin trukket på nålen for at angive mængden af væske injiceres i myg. B. 1 ml sprøjte anvendes til at konstruere mikro injektoren. Den hvide trekant repræsenterer nålenavet og den sorte trekant repræsenterer gummistemplet hovedet fastgjort til stemplet i sprøjten. C. Røret anvendes til at fastgøre mundstykket tilinjektoren. D. 1 ml engangspipette spids (blå spids), der anvendes som mundstykke mikroinjektion indretningen. E. mikroinjektion enhed, der inkorporerer AD dele. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Optimal myg injektionsstedet. A. Kvinde Aedes aegypti myg injiceres med et glas kapillar nål mellem de store skalaer på brystkassen. Den sorte streg angiver 1 mm for størrelse sammenligning. B. En tegning af den kvindelige myg thorax og de hvide pletter repræsenterer de hvide skæl i myg Exoskeleton. Injektionskanylen skal stikke myg mellem pletterne for at minimere dødelighed under injektion.
Figur 4. Virkningerne af temperaterne til Culex quinquefasciatus og Aedes aegypti diurese. Den diurese assayet blev udført med to arter af myg, Aedes aegypti og Culex quinquefasciatus, ved forskellige temperaturer. Udskillelsen hastighed i den første time efter injektion er vist i procent.
| Gruppe | TARA (G) | ikke injiceret (G) | efter injektion (G) | 1H efter injektion (G) | gennemsnitlig vægt (mg) | mængde indsprøjtet (Pi) | mængde, der udskilles (Pi) | % Udskilles |
| 1 | 7,5938 | 7,6057 | 7,6104 | 7,6096 | 2,38 | 0,94 | 0,16 | 17,0 |
| 2 | 7,8252 | 7,8349 | 7,8415 | 7,8403 | 1,94 | 1,32 | 0,24 | 18,2 |
| 3 | 7,8896 | 7,9026 | 7,9077 | 7,906 | 2,6 | 1,02 | 0,34 | 33,3 |
Tabel 1. Aedes aegypti in vivo diurese assayresultater. Rådata fra in vivo-diurese assay udført med Aedes aegypti hunmyg ved 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det RNAi anvendte protokol er blevet udviklet i laboratoriet af Alexander Raikhel ved University of California Riverside 6,7 og svarer til en protokol udgivet af Garver og Dimopoulos 4. Den eksperimentelle fremgangsmåde er vist i denne video protokol kan anvendes til at studere gener involveret i insekt diurese i en in vivo omgivelser. De ekskretionsorganerne af insekter, de Malpighian tubuli, har tiltrukket sig interesse for generationer af forskere som en "simpel" model for diurese. Dette organ er involveret i miljøfremmede stoffer clearance 8 og arbejde i Drosophila har påvist talrige gener involveret i Malpighian tubulus fysiologi 9,10, som nu kan studeres i andre insektarter med reverse genetiske metoder som RNAi. Mange homologe gener kan identificeres i de offentliggjorte genom sekvenser af forskellige insektarter 11. Tre dage gamle myg blev anvendt i denne protokol, fordi der på dette tidspunkt point de bliver kompetente til at tage et måltid blod.
Adskillige andre udskillelse assays er blevet rapporteret. Den klassiske Ramsay assay er blevet anvendt til at undersøge diurese i isolerede Malpighian tubuli in vitro 12. I dette assay enkelt tubuli isoleres, og den distale del er placeret i en dråbe saltopløsning, medens den proximale del er åben. Diuretisk aktivitet beregnes ved at måle størrelsen af urin dråben, der danner ved enden af den proximale del. Under anvendelse af Ramsay assayet, kan man måle mængden af urin produktionen af individuelle Malpighian tubuli. Vores diurese assay tillader målinger af hel-myg udskillelseshastighed og er derfor ikke et alternativ til Ramsay assayet. I stedet kan begge analyser give supplerende oplysninger, hvis de anvendes sammen.
Andre in vivo udskillelse assays er blevet udviklet til Musca domestica og Aedes aegypti. M. domestica undersøgelse inddraged måling af vandtab ved en gennemstrømnings-fugtmåler 13. En lignende teknik er blevet anvendt til at undersøge Aedes aegypti diurese ved måling udskillelseshastigheder med en præcision fugtighedskammer 14. In vivo diurese analysen præsenteres her er ikke så teknisk krævende som de ovennævnte teknikker og alligevel giver meget præcise data om udskillelse satser i forbindelse med en komplet organisme.
Der er en bred vifte af fremtidens applikationer til in vivo diurese analysen præsenteret her. Ud over vende genetik metoder som RNAi kan anvendes til at studere virkningen af lægemidler, f.eks signaltransduktionsinhibitorer etc., på insekt diurese. Det er også et virkningsfuldt assay til at undersøge fremgangsmåden xenobiotika clearance i mål-insekter.
Problemer, som vi vil tage fat, mens videreudvikle denne analyse er: A) Koncentrationen og sammensætningen af injektionen buffer. Vianvendt PBS til de forsøg, vi hidtil udførte, men andre buffere som Aedes Fysiologiske Saline 15 kan vise sig at være mere passende for myg og andre insekter. B) Påførsel af denne metode til andre arter, især ikke-blod sugende insekter. Mængden af puffer, som kan indsprøjtes i sådanne arter skal bestemmes empirisk for hver art. C) at minimere eksperimentel fejl. Vi vil optimere vores injektion og måleteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Victoria Carpenter for hendes kritiske kommentarer i denne protokol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion | AM1334 | |
| PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Plastic tubing | Local Supplier | PVC | |
| 1 ml plastic pipette tip | VWR international | 83007-376 | Blue tip |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Scissors | Local Supplier | ||
| Metal needle | Carolina Biological | 654307 | Size 5 |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | |
| Glass capillary needles | World Precision Instruments, Inc. | 1B200-6 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| One pint waxed lined cardboard cups | Local Supplier | Manufactured soup cups | |
| Mesh net | Local Supplier | plastic fly gauze |
References
- Drake, L. L., et al. The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 5, e15578 (2010).
- Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination. Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).
- Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).
- Clements, A. N. Volume 1 Development, Nutrition, and Reproduction. The Biology of Mosquitoes. 2, Chapman & Hall. London. (1992).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10626-10631 (2004).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. The Journal of biological chemistry. 280, 20565-20572 (2005).
- Pannabecker, T. Physiology of the Malpighian Tubule. Annual review of entomology. 40, 493-510 (1995).
- Dow, J. New insights into Malpighian tubule function from functional genomics. Comp Biochem Phys A. 150, S135 (2008).
- Dow, J. A. T. Insights into the Malpighian tubule from functional genomics. Journal of Experimental Biology. 212, 435-445 (2009).
- Lawson, D., et al. VectorBase: a data resource for invertebrate vector genomics. Nucleic acids research. 37, 583-587 (2009).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).
- Coast, G. M. Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis. Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).
- Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).
- Hays, A. R., Raikhel, A. S. A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes. Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).
