Summary
हम maedi visna वायरस के एक आणविक क्लोन है कि GFP व्यक्त करता है और पूरी तरह से संक्रामक है का वर्णन करता है. इस वायरस की प्रतिकृति प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है.
Abstract
भेड़ की Maedi visna वायरस (MVV) एक lentivirus है, धीरे धीरे प्रगतिशील बीचवाला निमोनिया और 1 इन्सेफेलाइटिस के कारण. vivo में MVV का प्राथमिक लक्ष्य कोशिकाओं monocyte वंश 2 का होना माना जाता है. MVV के कुछ उपभेदों अन्य प्रकार की कोशिकाओं में पेश कर सकते हैं, लेकिन 3,4. हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीवित कोशिकाओं में lentiviruses का अध्ययन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया मार्कर है. हम MVV की dUTPase के लिए जीन में EGFP जीन डाला है. dUTPase जीन सबसे भेड़ और बकरियों की lentivirus उपभेदों में अच्छी तरह से संरक्षित है और CAEV 5 की प्रतिकृति में महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है. हालांकि, dUTPase दोनों इन विट्रो में और vivo 6 में इस अध्ययन में इस्तेमाल किया MVV की आणविक क्लोन की प्रतिकृति के लिए नगण्य होना दिखाया गया है. MVV प्रतिकृति सख्ती भेड़ या बकरी मूल की कोशिकाओं तक ही सीमित है. हम भेड़ की रंजित plexus (एससीपी कोशिकाओं) से अभिकर्मक और 7 वायरस के प्रसार के लिए एक प्राथमिक सेल लाइन का उपयोग </> समर्थन. फ्लोरोसेंट MVV पूरी तरह से संक्रामक है और कम से कम 6 से अधिक मार्ग EGFP अभिव्यक्ति स्थिर है 8. 50 TCID और EGFP के मापन के बीच अच्छे संबंध है. इसलिए यह वायरस संक्रमित कोशिकाओं के सेल tropism और इन विट्रो में और vivo में 8 pathogenicity के अध्ययन में तेजी से पता लगाने के लिए उपयोगी होना चाहिए.
Protocol
1. अभिकर्मक
आणविक क्लोन दो plasmids, p8XSp5 EGFP और p67r 12 केबी और 4.5 केबी, क्रमशः में निहित है 9,10.
- दो plasmids, यानी p8XSp5-EGFP की 4.4 ग्राम और 1.6 p67r के ग्राम XbaI साथ equimolar मात्रा में काटें और अभिकर्मक पहले कटी घमनी को बांधना.
- Ligation के लिए, एक 50 μl और 16 ° रातोंरात सी प्रतिक्रिया सेते में 1 ligase की Weiss इकाई का उपयोग करें.
- जब ligation पूरा हो गया है, 65 डिग्री सेल्सियस पर ligase की निष्क्रियता के लिए 15 मिनट के लिए ligation मिश्रण सेते हैं. इस कदम को हटाया जा सकता है.
- दो दिन पहले अभिकर्मक, बीज 10 6 एक T25 टिशू कल्चर फ्लास्क में एससीपी कोशिकाओं, और 5 मिलीग्राम DMEM + 10% भेड़ का बच्चा सीरम और 2mm glutamine में दो दिनों लिए 90% confluency की एक monolayer के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के बिना कोशिकाओं को विकसित. यदि कोशिकाओं के दो दिनों के बाद 90% confluency तक पहुँच नहीं है, कोशिकाओं को एक अतिरिक्त दिन के बढ़ने के लिए छोड़ दें.
नोट: भेड़ का बच्चा सीरम subs हो सकता हैभ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) द्वारा tituted. हम नियमित रूप से भेड़ का बच्चा सीरम का उपयोग, के बाद से MVV के कुछ उपभेदों FBS से हिचकते हैं, इस MVV तनाव FBS से नहीं हिचकते है, तथापि.
- जब कोशिकाओं अभिकर्मक के लिए तैयार कर रहे हैं, एंटीबायोटिक दवाओं के बिना DMEM मध्यम 1% सीरम (भेड़ सीरम या FBS) के साथ बदल जाते हैं.
हम अभिकर्मक के लिए 2000 Lipofectamin (Invitrogen) का उपयोग करें. - 500μl Opti-सदस्य मध्यम में डीएनए पतला.
- 500μl Opti-सदस्य मध्यम में 20μl 2000 Lipofectamin पतला और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आर टी) पर छोड़ दें.
- 5 मिनट ऊष्मायन के बाद, पतला Lipofectamine 2000 (कुल मात्रा = 1000 μl) के साथ पतला डीएनए गठबंधन. धीरे मिश्रण और आरटी पर 20-30 मिनट के लिए सेते हैं.
- T25 एससीपी कोशिकाओं और मध्यम (5 मिलीग्राम) युक्त कुप्पी अभिकर्मक मिश्रण (1 मिलीग्राम) जोड़ें. धीरे कमाल द्वारा मिक्स.
- 37 पर सेते ° C और 5% सीओ 2 रातोंरात (18 - 24 घंटे).
- मध्यम अगले दिन 1% सीरम, 2mm glutamine के साथ DMEM में बदलें100IU पेनिसिलिन और 100IU स्ट्रेप्टोमाइसिन.
- एससीपी कोशिकाओं में GFP औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा उत्पादन की निगरानी करें. 15% - कम अभिकर्मक दक्षता इन प्राथमिक कोशिकाओं, आमतौर पर 5 के साथ उम्मीद की जा सकती है.
- सेते 37 पर आगे ° C, 5% फ्लास्क में वायरस के प्रसार की अनुमति के लिए कई दिनों के लिए सीओ 2. यह 7-14 दिनों आम तौर पर पूर्ण संक्रमण के लिए लेता है.
- Eppendorf ट्यूब में तैरनेवाला aliquoting वायरस फसल. सेल मलबे को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 3000 rpm पर एक microfuge में स्पिन. नई ट्यूबों को वायरस युक्त तैरनेवाला स्थानांतरण. -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस
2. वायरस के अनुमापन
- 100 μl DMEM एक 96 अच्छी तरह से थाली में 10% सीरम, 2mm glutamine, 100IU/ml पेनिसिलिन और 100IU/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन, प्रति अच्छी तरह से साथ पूरक मध्यम में 3x10 4 एससीपी कोशिकाओं बीज. 37 पर सेते ° सी, 5% सीओ 2.
- यदि कोशिकाओं सहधारा अगले दिन, 1% के सीरम के साथ DMEM के लिए माध्यम के परिवर्तन, 2mm glutamine, 100IU/ml पेनिसिलिन और 100IU/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन, प्रत्येक कुएं में 100 μl.
- निम्नलिखित तरीके में वायरस पतला:
- 1% सीरम के साथ 180 μl DMEM जोड़ें, 2mm glutamine, 100IU/ml पेनिसिलिन और अच्छी तरह से प्रति 100IU/ml एक 96 अच्छी तरह से दौर नीचे या वि नीचे प्लेट में 4 x 10 कुओं स्ट्रेप्टोमाइसिन.
- चार प्रतियों में दस गुना धारावाहिक dilutions, थाली के पहले स्तंभ में 4wells से प्रत्येक के लिए वायरस के 20 μl जोड़ने के लिए, और एक चार चैनल विंदुक का उपयोग, विंदुक ऊपर और नीचे करने के लिए सुनिश्चित करें कि नमूने अच्छी तरह से मिला कर रहे हैं. विंदुक युक्तियाँ बदलें और अगले 4 कुओं और इतने पर 20 μl हस्तांतरण. एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए वायरस के बिना पिछले कुओं छोड़ दें.
- एससीपी कोशिकाओं और मध्यम वायरस dilutions के 100 μl जोड़ें.
- 37 पर सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. GFP प्रतिदीप्ति और दो सप्ताह के लिए कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव के लिए निरीक्षण.
कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव कोशिकाओं से मिलकर बनता गोल और सामान्य कोशिकाओं की तुलना में कम पारदर्शी बनने with प्रक्रियाओं बाहर खींच, multinuclear प्रदर्शित होने कोशिकाओं और कोशिका मृत्यु के साथ समाप्त. - वायरस (TCID50) अनुमापांक रीड MUENCH 11 विधि का उपयोग कर की गणना.
3. संक्रमित कोशिकाओं FACS विश्लेषण
नोट: वायरस की प्रतिकृति की निगरानी के लिए तेजी से, संक्रमित कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा जांच की जा सकती है.
- संक्रमित कोशिकाओं (CA 10 5) Trypsinize, PBS और 500μl पीबीएस में resuspend साथ 1x धो लो.
- 500 μl 4% paraformaldehyde समाधान (2% अंतिम एकाग्रता), आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं जोड़ें.
- 5 मिनट के लिए 3000 rpm पर एक microfuge में गोली कोशिकाओं.
- पीबीएस 2x5 मिनट के साथ धो और एक FACScan विश्लेषक पर विश्लेषण. 10,000 घटनाओं की गणना.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
10 7 50 TCID / एमएल - यह वायरस पूरी तरह से संक्रामक है और 6 10 से अनुमापांक दोहराने होना चाहिए. संक्रमित कोशिकाओं फ्लोरोसेंट हैं और हो सकता है detप्रवाह cytometry और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा ected. आमतौर पर, GFP कोशिकाओं के 60% से अधिक संक्रमित कोशिका प्रवाह cytometry का उपयोग संस्कृतियों (1 छवि) में पता लगाया जा सकता है. इसी तरह, जब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized, कक्षों की एक बहुमत फ्लोरोसेंट (छवि 2A और बी).
चित्रा 1 एससीपी संक्रमण के 7 दिनों के बाद KV1772-EGFP वायरस से संक्रमित कोशिकाओं के FACScan विश्लेषण.
चित्रा एससीपी ऊष्मायन (ए) के 7 दिनों के बाद KV1772-EGFP साथ संक्रमित कोशिकाओं के चरण 2 विपरीत माइक्रोस्कोपी. समान कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (B) द्वारा visualized.
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Discussion
यहाँ प्रस्तुत MVV की आणविक क्लोन व्यक्त GFP मेजबान सेल बातचीत और दोनों इन विट्रो में और vivo में MVV की pathogenicity का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी होना चाहिए. वायरस प्रतिकृति के 7-14 दिनों के बाद प्राप्त निस्संदेह कुछ रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस की अशुद्धि के कारण परिवर्तन का अधिग्रहण किया है. हालांकि, इस क्लोन के एक एकल चक्र वेक्टर के रूप में उपयोग करने के लिए सीमाएं हैं. एक यह है कि क्लोन भेड़ और बकरी मूल की कोशिकाओं के उपयोग के लिए प्रतिबंधित है. हमारे का निर्माण का उपयोग कर इन कोशिकाओं के अभिकर्मक दक्षता 5-15% ही है, और एक वेक्टर pEGFP N3 का उपयोग अभिकर्मक दक्षता 293 टी कोशिकाओं का उपयोग कर 90 से अधिक% की तुलना में 15-20% है. 293 टी कोशिकाओं MVV वैक्टर के लिए पैकेजिंग की कोशिकाओं के रूप में परीक्षण किया गया है, लेकिन जिसके परिणामस्वरूप वायरस कणों दोनों भेड़ कोशिकाओं में और 293 टी 12 शायद अज्ञात प्रतिबंध कारकों के कारण कोशिकाओं में गैर संक्रामक साबित हुआ. संक्रामक क्लोन दो plasmids, जो एक और कमी है में निहित है. इस तथ्य के कारण हैपूरी लंबाई की है कि क्लोन ई. कोलाई में अस्थिर है. हालांकि, यह संभव है कि एक कम प्लाज्मिड कॉपी में पूरी लंबाई क्लोन क्लोन चाहिए.
प्लास्मिड कोशिकाओं और लेखकों से प्राप्त किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम आइसलैंडिक रिसर्च फंड और आइसलैंड रिसर्च फंड के विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10938025 | |
| Opti-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 51985018 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
References
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