Summary
このプロトコルは、のための器官培養のための尾骨ウシ椎間板のための収穫技術を示しています。
Abstract
椎間板（IVD）は椎骨に椎を接続する脊椎の関節です。それは、背骨の荷重を伝達し、背骨に柔軟性を与えるために機能します。線維輪（AF）で取り囲む最も内側の髄核（NP）、および両側の椎体にNPとAFを接続する2つの軟骨終板：それは3つの区画から構成している。おそらく変性椎間板疾患（DDD）と椎間板ヘルニアが原因で椎間板の痛みは私達の現代社会における主要な問題として同定されている。 IVD変性の機序を調べるために、ライブディスクの細胞を用いたin vitro器官培養系で非常に魅力的です。そのままウシ尾骨IVDsのin vitro培養十分に制御生理学的および機械的な環境におけるメカノ生物学的側面 の研究を可能にする、関連するモデルシステム、に進んでいる。牛テールIVDsは高い数値で、比較的容易に得ることができますdは、細胞密度、細胞集団と寸法に関する人間の腰椎IVDsと非常によく似ています。栄養経路が明らかに凝固した血液によってブロックされたしかし、軟骨終板と骨のエンドプレートを保持し、前のウシ尾IVD収穫テクニックは、文化の1〜2日後に失敗しました。 IVDsが最大の無血管器官である、したがって、NPの細胞への栄養素は、隣接する椎体から毛細管芽を経由して拡散にもっぱら依存しています。エンドプレートの表面上に骨の破片と血餅の存在は、ディスクと妥協の細胞の生存の中心に栄養の拡散を妨げることができる。当社グループは、汚染のリスクが低いとアウトテールからIVDsを"クラック"することは比較的迅速なプロトコルを確立した。我々は、血栓や切削屑を除去し、非常に効率的に栄養の拡散経路を再オープン外科ジェット洗浄システムを使用して、切りたての骨端板の表面を透過することができますIVDの中心に。脊椎骨の両側の成長板の存在は、避けるべきと前の文化に削除する必要があります。このビデオでは、我々は準備中に重要なステップを概説し、無料の腫れ文化で14日間高い細胞生存率を維持し成功した器官培養するキーを示しています。培養時間は、適切な機械的な環境が機械的荷重のバイオリアクターを使用して維持することができるときに拡張することができる。ここで示した手法は、ブタ、ヒツジ及びウサギの尾と腰IVD分離など他の動物種に拡張することができます。
Protocol
1。椎間板の収穫
- 皮膚の存在は、汚染の可能性（図2）を増加させるので、全体の長さのウシの尾は皮なしで可能であれば、地元の食肉処理場から得られる。
- 大きなまな板を準備して、カッティングボード（図2）の上に滅菌ワークステーションと楽器を準備。
- 滅菌ガーゼは、55mmのクエン酸ナトリウムを含む0.9％塩化ナトリウムで湿らせ、6ウェルプレートの各ウェルに入れ、無菌層流フードの下準備。
- 流域を準備し、水道水で1:100 Betadineソリューションを希釈する。
- 5分間、1％Betadine溶液を含む流域の全体の牛の尾を浸し。
- 簡潔に乾いた滅菌ガーゼで尾と無菌ワークステーション上に置きます。
- 慎重に手術用メスの刃＃22とテール周りの筋肉を取り除く。
- 比較的大きいと非常に小さいが含まれて通常必要とされていないテールの部分、尾の両端を、離れてチョップIVDs（図3）。
- さらに手術用メスの刃＃10を使用してIVD周囲の筋肉や腱をトリミング。ディスクの外側の環を切らないように注意してください。
- 外科皮膚マーカとIVDの前にマークを付ける（このステップはオプションです、それは私たちのバイオリアクターでの軸回転の中心を決定するのに役立ちます）。
- 静かに尾を移動することによって、IVDと脊椎の接続ポイントを見つけます。手術用メスの刃の鈍い側でIVDと骨の間に境界線を感じる。切断部位は、脊椎骨に向かってIVDの離れて1〜2ミリメートルでなければなりません。場所のカスタムは、切断部位（図4）産業のブレードホルダーを作った。
- カスタムメイドの工業用ブレードホルダー（図3）の上にハンマーで開裂するIVDと椎。
- IVD -椎接続の反対側に繰り返します。
- ラップは、55mmのクエン酸ナトリウムを含む0.9％塩化ナトリウムで湿らせた滅菌ガーゼでIVD分離。
- 希望のサンプル番号（通常は約6缶にIVDsの分離を継続する10〜20ミリメートル）との間の直径で収穫される。
- 滅菌乳酸リンゲル液でジェット洗浄システムを（ジマー、税込）に接続、5L袋は便利なサイズ（代わりに滅菌PBSまたは0.9％生理食塩水）です。
- 鉗子とジンマーPulsavacジェット洗浄システム（図1C）を使用して、エンドプレートの表面のジェット洗浄両面でIVDを保持する。ジェットガンは、30の間の角度で終板の表面に撮影してください - 60 °各側面に30秒程度のために。 （図1及び図7）
- ジェットは別のディスクのサンプルを洗浄しながら、湿らせたガーゼで6ウェルプレートとラップにIVDsを元に戻します。
- IVDsは、器官培養とダウンストリームのアプリケーション（例えば、細胞の生存率、機械的荷重、器官培養）（図1D）のための準備が整いました。
2。代表的な結果
成功した椎間板の準備を判断するアウトカムの測定値は、小さな分子量の蛍光色素（例えばprocion赤）拡散実験することができますPBS 2の1％溶液として調製される。 IVDは、色素溶液と色素の少なくとも100 mLをして自由膨張の下で24時間のためのIVDに受動的に拡散することを許可されて保持されます。 IVDは、° Cと、最終的に室温に液体窒素で瞬間凍結し、室温に戻し、アセトン転送（最初-80にプリ℃まで冷却し、C、-20 °次にC、4シリーズで脱水です）。ディスクは、ポリメチルアクリレート（PMMA）に埋め込まれ、厚さ100μmのセクションを生成するために鋭利な刃でカットすることができます。これらのセクションは、任意の標準的な明視野顕微鏡ではなく優先的にprocion赤は赤色蛍光（図5-6）を発するので、蛍光顕微鏡の使用によって見ることができます。骨表面のtrabeculiはジェットlavagingのステップ（図7）の後に非常にきれいに表示されます。
成功した器官培養のためのパラメータは、汚染のすべての不在の最初の維持、細胞生存率（図8-9）、ディスクの高さとです。組織切片およびサフラニンO /ファストグリーン染色やマイヤーのヘマトキシリン3で測定された全体的な"ディスクの整合性"、。我々は、ライブディスクの組織を染色し、共焦点レーザー走査型顕微鏡とLIVE / DEAD染色キット（Molecular Probes社、Invitrogen社、バーゼル、スイス）を使用して3Dで細胞の生存性をスキャンするために別の場所で4,5公開プロトコルとマクロを開発した。我々は、さらにNIH ImageJのプラットフォーム4-6を用いて三次元組織または3Dのキャリアで、細胞生存率を推定するために計数自動化されたセルを実行するマクロ、ルーチンを開発した。代替プロトコルはプロナーゼとコラゲナーゼの種類を使用して細胞外マトリックスの連続消化を使用して初期消化によってディスクの細胞の細胞生存率を決定するために2とし、細胞懸濁液7を染色するために提案されている。十倍を含むPBSでのインキュベーションステップを関連するプロトコルの以前のバージョンのディスク前に臓器Cuの収穫後の10分のためのより高濃度のペニシリン/ストレプトマイシン濃度lture。このステップは、培養の目的のために有益と思われるので、ジェットの洗浄ステップでは、このステップは不要になります。
図1方法論の手順の概要は、そのままエンドプレートと骨の薄層（1 - 2mm）をウシ尾骨椎間板を準備する。椎間板（IVD）とその栄養経路のA）の模式図。 B）カスタマイズしたブレードホルダーと産業鋭い刃とIVDをカットする手順。 C）ジェット洗浄ステップでは、高い細胞生存率を確保し、エンドプレートと両側に接続されている骨の1〜2 mmを維持する栄養交換を可能にする。 D）最後に、IVDは、バイオリアクターの試料室で培養することができますまたは任意のダウンストリームアプリケーションに使用される。
図2トップ：全長新鮮な牛テール（理想的にobta高い細胞の生存を確保するために事後の2〜3時間以内にined。底部：骨の終板（EP）と椎体（VB）との間で、成長板（GP）、骨化の二次中心の存在を示す6ヶ月歳前後牛テールのX線画像。
図3。）ツールは、無菌条件下でウシの尾を解剖する。椎間板を削減しながらB）カスタマイズされたブレードホルダーは、アクションの牛テールから運動のセグメントを切り出しする。標準的な工業用ブレード（ルッツ、ドイツ）とカスタマイズされたブレードホルダーのC）サイドビュー。
図4。運動セグメントをカットする切断部位を示す周囲の筋肉と靭帯を除去した後、牛テールの描画と画像。部分的な椎骨はwiを"クラック"する必要がある離れて軟骨終板からカスタムメイドのブレードホルダー番理想的に1〜2ミリメートルの完全な骨の表面を確実にする。
図5。の前に（）と（B）の後、ジェット洗浄ステップの効果的な洗浄のデモンストレーション。噴霧手順の後に椎間板セグメントのクリーンな骨の表面に注目してください。
図6。作りたての成長板によって閉塞効果を発揮、1％procion赤色の溶液に24時間放置牛テール椎間板（IVDs）を切り出したの自由膨潤拡散実験。のデジタルX線矢状画面に2つの後も軟骨や骨端板と尾骨ウシ椎間板の外植片を介して成長板と矢状カットの骨蛍光顕微鏡画像の第二層を含むIVD4時間自由拡散。 GP：成長板、2ndry CO：骨化の二次中心。
図7。1％procion赤色の溶液に24時間放置、新たに調製した摘出したウシの尾部椎間板（IVDsが）、ジェット洗浄療法の洗浄効果を示すの自由膨潤実験。治療（右）ジェットlavaged処理なしジェット洗浄療法（左）制御側を受けた〜1.5 mmthick骨端板と摘出したウシIVDsの矢状厚いセクション（〜100mm）に。入口は1％procionの赤のウシ椎間板の外植片のジンマーの傷デブリドマンシステム24時間無料の拡散実験から使用されたスプレーパターンを示しています。
図8。共焦点イメージングスタックの投影のデッド/ライブ画像（250μm）bovinから撮影電子椎間板セグメントは髄核（NP）、内側の線維輪（IA）と外側の線維輪（OA）のためそれぞれ0と14日間無料の膨潤性の下に置かこのジェット洗浄法を用いて調製。緑色のセルは=生きている細胞は、カルセインAM（アセチルメチルエステル）、赤血球エチジウムホモダイマー-1で染色=死んだ細胞の核で染色。
図9。生きている組織や3Dスタックのスキャンの共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて椎間板の細胞バイアビリティ。自由膨潤性条件下で21日間の培養上髄核（NP）およびアニュラス線維症（AF）の細胞の生存。 （± SEM、N = 6の平均）統計的な違いは、ノンパラメトリッククラスカルワリスのグループ間での順位和検定を署名した使用してテストされました。有意な差は21日目とNPの他のすべての時間の点の間に発見された。 AFに有意な差で7日目までの間に発見されたが0日目。 （* P <0.05、** P <0.01）。
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Discussion
成功した器官培養のための最初のステップは、外植片が汚染されるべきではないことを確認することです。この手順を始める前に尾にはスキンは適用されるべきである。無菌室に持ち込むあらゆる動物の毛は、汚染の点で問題である可能性があります。牛テールは、理想的に（これは初期の細胞の生存に影響を与える）可能な限り新鮮なはずです。さらに、betadineの洗浄工程は、さらなる汚染のリスクを軽減することをお勧めします。代わりに、カスタムメイドのブレードホルダーと椎体からのIVDを分離するためにハンマーを使用する代わり、これは組織学的バンドソーを（切削中のダイヤモンドブレードは、PBSまたはリンガー溶液を冷却する必要がある）を使用して実行することができます。バンドソー、試料ホルダーと切刃は無菌でなければならないことに注意してください。ここで示した手法は、牛テールIVD分離に限定されるものではなく、そのようなブタ、ヒツジ及びウサギの尾側、あるいは腰椎IVD分離など他の動物種に拡張することができます。 IVD時間脊髄のプロセスが存在する地域でarvest、それは最初にすべてのプロセスを削除することが重要です。
図9に所定の細胞生存率のデータは、最大21日間無料の膨潤性の下で収集し、リファレンスとして使用することができます。このメソッドは、自由膨張で14日間のための細胞の生存を維持します。 21日で細胞の生存率の低下は、エンドプレートを介して栄養普及を支援する上で重要になるとディスクの細胞の生存率3を維持することが示されている機械的荷重の不足が原因である可能性があります。それは、細胞生存率が静水圧圧縮および/ または追加の昼間のロード8-10の下にさらに高くなる可能性が高いでしょう。
代替プロトコルとして、ウシのディスクは、歯科用バーを使用し、ちょうど軟骨終板11を残すことによって脊椎の隣接する骨のすべてを除去することによって調製することができる。 IVD細胞の生存率は、このメソッドを使用して、4週間にわたって維持された。ディスクを"つかむ"ために利用可能な硬い骨がないので、しかし、この場合にはねじれ運動のセグメントへの簡単な方法で適用することはできません。凹面が両側に平行な面の代わりに、エンドプレートもロードプロファイルの違いは11のアカウントへのバイオリアクターの設計に試料室の調整を必要とします。また、骨のエンドプレート間の分子の拡散の評価は、これらの外植片の可能性もないです。
我々の仕事の意義
- 器官培養のためにそのまま椎間板セグメントをカットするシングル利用産業ブレードの使用量は大幅に組織学的バンドを見たと最先端ステップを含むプロトコールに比べて収穫プロトコルを短縮。それはダイヤモンド鋸刃付研削ムーブメントからケースであるとしても、骨の骨梁構造は影響を受けません。
- 骨表面のジェットlavaging凝固血非常に効率的かつSI洗浄アウトgnificantly未治療の椎間板に比べて時間の経過とともに髄核（ディスクの中心）の細胞生存率を向上させます。
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Disclosures
我々は、開示することは何もない。
Acknowledgments
このプロジェクトは、スイス国立科学財団（SNF＃310030-127586/1）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack d–s also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton | #10: 0201 #22: 0208 | |
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 | |
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | Techno Plastic Products | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible |
References
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