Summary
Leucine Rich Gjenta Kinase 2 er en stor multidomain kinase, mutasjoner som er den vanligste genetiske årsaken til Parkinsons sykdom. Analyse av kinase aktiviteten til dette proteinet har vist seg å være et viktig redskap i å forstå biologi og dysfunksjon av dette proteinet. I denne artikkelen
Abstract
Leucine Rich Gjenta Kinase 2 (LRRK2) er en 2527 aminosyre medlem av Roco familie av proteiner, besitter en kompleks, multidomain struktur inkludert en GTPase domene (kalt ROC, for Ras of Complex proteiner) og en kinase domenenavn 1. Oppdagelsen i 2004 av mutasjoner i LRRK2 som forårsaker Parkinsons sykdom (PD) resulterte i LRRK2 være fokus for et stort volum av forskning på sin normale funksjon og hvordan proteinet går galt i sykdomsforløpet staten 2,3. Innledende undersøkelser inn i funksjonen av LRRK2 fokusert på sin enzymatiske aktiviteter 4-6. Selv om et klart bilde har ennå å dukke opp på en konsekvent endring i disse på grunn av mutasjoner, har data fra en rekke grupper fremhevet viktigheten av kinase aktivitet LRRK2 i celledød knyttet til mutasjoner 7,8. Nyere publikasjoner har rapportert hemmere rettet mot kinase aktiviteten til LRRK2, og gir et viktig eksperimentelle verktøy 9-11. I lys av disse dataene, er deter sannsynlig at den enzymatiske egenskaper LRRK2 gir oss et viktig vindu inn i biologien til dette proteinet, selv om de er potensielle narkotika mål for Parkinsons er åpent for debatt.
En rekke ulike tilnærminger har blitt brukt til analysen av kinase aktivitet LRRK2. I begynnelsen var analyser utført med epitop tagget protein overexpressed i mammalske cellelinjer og immunoprecipitated, med analysene utføres ved bruk av dette proteinet immobilisert på agarose perler 4,5,7. Senere har renset rekombinant fragmenter av LRRK2 i løsningen også blitt brukt, for eksempel en GST tagget fragment renset fra insekt cellene inneholder rester 970-2527 av LRRK2 12. Nylig, Daniels et al. Rapporterte isolering av full lengde LRRK2 i løsning fra humane embryonale nyre celler, men dette proteinet er ikke allment tilgjengelig 13.. I kontrast til GST fusjon avkortet form av LRRK2 er kommersielt tilgjengelig fore (fra Invitrogen, se tabell 1 for detaljer), og gir et praktisk verktøy for å demonstrere en analyse for LRRK2 kinase aktivitet. Flere forskjellige utganger for LRRK2 kinase aktivitet har blitt rapportert. Autophosphorylation av LRRK2 selv, fosforylering av Myelin Basic Protein (MBP) som en generisk kinase substrat og fosforylering av en kunstig underlag - kalt LRRKtide, basert på fosforylering av treonin 558 i Moesin - har alle vært brukt, som har en rekke mulige fysiologiske substrater inkludert α-synuclein, Moesin og 4-EBP 14-17. Statusen for disse proteinene som underlag for LRRK2 fortsatt uklart, og som sådan protokollen som er beskrevet nedenfor vil fokusere på å bruke MBP som en generisk substrat, merke nytten av dette systemet til analysen LRRK2 kinase aktivitet rettet mot en rekke potensielle underlag.
Protocol
Sikkerhet
Protokollen beskrevet nedenfor benytter ATP merket med radioaktivt 32 P på γ fosfat posisjon til å følge kinase aktivitet LRRK2. Den er basert på standard protokoller som brukes i vårt laboratorium, og så med hensyn til mange av trinnene i prosessen som kjører gels, western blotting et cetera materialer og presise forhold bør tas som en guide som utstyr og protokoller brukes til disse prosessene varierer fra laboratorium til laboratorium. Forbindelser som inneholder isotoper som avgir ioniserende stråling er potensielt skadelige for menneskers helse og strenge lisenser og forskrifter i et institusjonelt og nasjonalt nivå kontrollere bruken. Forsøkene i denne protokollen ble gjennomført følgende opplæring i open source stråling bruk ved University College London og følge god laboratoriepraksis retningslinjer gitt av sikkerheten tjenester på college (retningslinjer available på http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). Bruk av åpen kildekode stråling ikke bør forsøkes før egnet opplæring og regulatorisk godkjenning. Den regulatoriske organ som er ansvarlig for åpen kildekode stråling i laboratorieforsøk varierer fra land til land. Eksempler på disse er: i Storbritannia, Health and Safety Executive ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ), i USA Nuclear Regulatory Commission ( http:// www.nrc.gov / materialer / Miau / regs-guider-comm.html ), i Canada Canadian Nuclear Safety Commission ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), og i Tyskland Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http : / / www.bfs.de / de / BFS ). Brukere i andre land bør bekrefte lokale regler, forskrifter og lisensiering myndigheter med sine strålesikkerhet offiser. Sikkerhetstiltak relevant for denne protokollen ha vært nevnt i teksten, markert med den radioaktive Trefoil symbol ( 
).
1. Klargjøre kinase reaksjoner
Alle reaksjonsblandingene utarbeidet i 1.5ml prøverør med skrulokk som inneholder en O-ring for å hindre spredning av radioaktivitet.
- Tin protein på is - LRRK2 vill type, D1994A, G2019S.
- utgjør reaksjon på is - LRRK2 10Nm, 0.5μg/μl MBP, 5ul av 10x kinase buffer, laget opp til 50μl med vann.
2. Kjøre analysen
Alle trinn benytter 32 P ATP bør ta pblonder i utpekte stråling områder.
Egnet personlig verneutstyr bør brukes - under Standard Operating Procedure i vårt laboratorium disse inkluderer lab frakk, doble hansker og vernebriller.
Prøver som inneholder 32 P ATP bør være skjermet fra brukere av 6mm pleksiglass-skjermer for å minimere eksponering.
Der det er aktuelt, personlig overvåkingsutstyr bør brukes - i UCL, må alle sertifiserte open source stråling brukeren har en film badge å overvåke stråling under eksperimentene.
Alle eksperimentelle overflater bedømmes for radioaktiv forurensning før og etter bruk ved hjelp av en GEIger telleren.
Alle potensielt forurenset forbruksvarer bør destrueres i streng overholdelse av institusjonelle retningslinjer for radioaktivt avfall.
- Før du starter analysen, sett oppvarming blokker til 30 ° C og 100 ° C henholdsvis
- Fjern 32 P ATP fra -20 fryser (merk at lagervilkårene fro 32 P ATP kan variere avhengig av leverandør eller type radionucleotides brukes).
scan utsiden av container før bruk, tine bak pleksiglass skjermen. - Med reaksjoner på is, legg 1μl av 32 P ATP til hvert sammen med 10μM kaldt ATP.
- Bland godt med pipette. Pulse sentrifuge for å bringe væske til bunnen av røret, minimere risiko for forurensning.
- Fjern 15μl delmengde for null tidspunkt end si reaksjon i delmengde med tillegg av 5μl på 4x SDS sample buffer og denaturering ved 100 ° C i 10 minutter. Pulse sentrifuge for å bringe væske til bunnen av røret, minimere risiko for forurensning.
- Gjenværende prøve plassert i oppvarming blokk og inkuberes ved 30 ° C i 60 minutter.
- 15μl fjernet ved 60 minutt tidspunkt og reaksjon avsluttet ved tilsetting av 5μl på 4x SDS sample buffer og denaturering ved 100 ° C i 10 minutter. Pulse sentrifuge for å bringe væske til bunnen av røret, minimere risiko for forurensning.
3. Immunoblotting prøvene og analysere resultater
- Prøver kjørt på SDS-PAGE
- 10 vel 4-12% Bis-Tris polyacrilamide gel forberedt på elektroforese med mopper kjører buffer.
- 20μl av hver prøve lastet inn gel sammen med 7μl av spissmelTain protein standard stigen.
- Gel kjøre på 160v i 90 minutter, eller til fargestoff front har nådd slutten av gel. All væske i kontakt med radioisotoper bør behandles som radioaktivt avfall og kastes som per institusjonelle retningslinjer. UCL forskriftene sier at flytende radioaktivt avfall skal kastes ved å helle ned utpekt radioaktive disposisjon synker med rikelig vann.
- Protein overført til PVDF membran via western blot.
- Transfer buffer forberedt, 1x Tris Glycine pluss 20% metanol. PVDF membran og filter papir kuttet til riktig størrelse for gel og aktivert med glacial metanol i tilfelle av membran eller pre-vått med overføring buffer i tilfelle av filter papir. Membranen skal være pre-merket med kulepenn blekk å tillate identifisering av orientering. Gel fjernet fra plastic casing og overflødig akrylamid fjernes og kastes som radioaktivt avfall.
- Gelen skal formes inn i en sandwich med membranen og filter papir, slik at ingen bobler eksisterer mellom membran og gel, og deretter arrangert i den vestlige klatt apparat med membran mellom gel og anoden.
- Overføring utført ved 25V i 16 timer.
- Transfer buffer forberedt, 1x Tris Glycine pluss 20% metanol. PVDF membran og filter papir kuttet til riktig størrelse for gel og aktivert med glacial metanol i tilfelle av membran eller pre-vått med overføring buffer i tilfelle av filter papir. Membranen skal være pre-merket med kulepenn blekk å tillate identifisering av orientering.
- Etter protein overføring til PVDF, bør membranen tørkes ved romtemperatur. Til slutt bør det tørre membranen bli isolert mellom celluloseacetat ark og utsatt for enten en fosfor-skjerm eller x-ray film å tillate registrering av radiomerket protein. Eksponeringstid kan kjøre fra flere timer til over en uke, avhengig av den spesifikke aktiviteten av radioisotop brukt og enzymkinetikk av reaksjonen.
- Phosphoscreen skannet / film behandlet. Hvis du bruker en fosfor-skjerm, bør bildet lagres som en høyoppløselig TIFF eller bitmap fil, hvis du bruker film da den resulterende transparency bør være skannet ved hjelp av en stasjonær skanner og lagret som en høyoppløselig TIFF eller bitmap fil. Bildet kan deretter bli analysert i ImageJ, et freeware program tilgjengelig på National Institutes of Health nettsted ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
Fire. Representant Resultater
Figur 1 viser representative resultater for en analyse utført ved hjelp av vill type, G2019S og D1994A LRRK2 med Myelin Basic Protein som en generisk fosfat akseptor substrat. Autophosphorylation av LRRK2 er synlig på ≈ 200kDa, med flere band som representerer fosforylert MBP synlig fra 20-40kDa. Legg merke til fraværet av autophosphorylation i D1994A (kinase død) kjørefelt, og økt fosforylering grunn av G2019S mutasjonen. Merk også rester fosforylering av MBP i kinase døde kjørefelt. Dette kan skyldes ufullstendig ablasjon av kinase aktiviteten til LRRK2 av D1994A mutant eller reflektere tilstedeværelse of spor forurensende kinaser i reaksjonen.
Figur 1.
Discussion
Dette notatet beskriver en grunnleggende protokollen for analysere den kinase aktiviteten til LRRK2 hjelp av en in vitro system. Av hensyn til kortfattethet, har dette vært begrenset til en times endepunkt mal å bruke en generisk substrat, men den generelle protokollen er anvendelig til en rekke potensielle underlag, mottakelig for mer sofistikerte analyser undersøke kinetikken av kinase aktivitet LRRK2 . Dette understreker en av de viktigste fordelene ved å bruke en in vitro system for å undersøke kinase oppførsel av et protein som dette: fordi det er full kontroll over konsentrasjonene av enzymet og substratet, er det mulig å generere kinetiske data og beregne K m og V max verdier for reaksjonen. For mer detaljert kinetisk evalueringer eller vurdere effekten av mulige hemmere, er en høyere gjennomstrømning system (som gis ved å bruke LRRKtide underlaget, tilgjengelig fra Invitrogen) en overlegen alternative til den tilnærmingen som er beskrevet her.
Det er imidlertid viktig å erkjenne at den reduksjonistiske modellen systemet leveres av in vitro-kinase analysene er bare ett verktøy for å undersøke biologi av en kinase og dets relasjoner med potensielle underlag. Data fra analyser som dette bør brukes sammen med andre tilnærminger for å få et helhetlig bilde av hvordan en kinase oppfører seg in vitro og i en mobil kontekst. For eksempel kan en antatt substrat fosforylert in vitro bli analysert av massespektrometri for å identifisere mulige phosphosites som så kan manipuleres av målrettet mutagenese (f.eks. Konvertere serin eller treonin fosfat akseptor rester til ikke-phosphorylatable rester som alanin) for å undersøke den funksjonelle Konsekvensene av fosforylering ex vivo.
Et viktig hensyn i tolke data fra en in vitro test system som dette er sannsynligheten for either type I eller type II (falske positive eller falske negative) feil. Den reduksjonistiske natur dette systemet dessverre disponerer den til begge deler - i tilfelle av tidligere, har en renset antatt substrat og renset kinase i kunstig nær hverandre og ved høy konsentrasjon (i forhold til cellular miljøet) kan resultere i artefactual fosforylering hendelser. Omvendt, mange kinaser fungere som en del av et kompleks innenfor rammen av cellen, og krever co-faktorer for fosforylering av et gitt substrat å skje. Som nevnt ovenfor, et positivt resultat fra fosforylering av en antatt underlaget med en in vitro analyse system skal deretter testes i et mobiltelefonnettverk system for å godkjenne resultatet, og et negativt resultat bør tolkes med forsiktighet.
I lys av dette, er det avgjørende der det er mulig å ha både positive og negative kontroller for å tillate en komparativ studie av aktiviteten til din kinase av interesse. Nøye valg av en positiv control som har en kjent aktivitet mot din protein av interesse, sammen med en negativ kontroll som er usannsynlig å phosphorylate din utlagde substrat, er meget verdifull. En kandidat kontroll for LRRK2 er Receptor samhandler 3 kinase, som har et nært beslektet primære sekvensen til kinase domene LRRK2 men har en helt annen overordnet domene struktur 18 år. Denne er tilgjengelig som rekombinant protein fra Invitrogen og brukes som en standard kontroll i vårt laboratorium.
Det bør også bemerkes at de kommersielt tilgjengelig form av LRRK2 mangler N-terminus av proteinet og er merket med glutation-S-transferase og dette bør tas i betraktning som en mulig konfunderende faktor ved gjennomføring av kinase analyser med dette proteinet, som det ikke er kjent hvilken rolle N-terminal av LRRK2 kan spille i normal funksjon av dette proteinet. Hvis for eksempel den N-terminale delen av LRRK2 som er fraværende i protein brukes i denne protokoller avgjørende for rekruttering av en spesifikk substrat til kinase domene LRRK2 da dette vil ha stor innvirkning på de observerte fosforylering av sa substrat i in vitro system er beskrevet ovenfor.
Selv med disse begrensninger, men understreker viktigheten knyttet til biologi LRRK2 i Parkinsons forskning nytten av denne protokollen som et verdifullt verktøy for å undersøke oppførselen til dette proteinet i en in vitro setting.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatteren er en Parkinsons britiske Research Fellow (tilskudd F1002). Dette arbeidet ble støttet delvis av Wellcome Trust / MRC Joint Call i neurodegeneration award (WT089698) til Storbritannia Parkinsons sykdom Consortium (UKPDC) hvis medlemmer er fra UCL Institute of Neurology, University of Sheffield og MRC Protein fosforylering Unit ved University of Dundee.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signaling Technology | 9802S | |
| MBP | Sigma-Aldrich | M1891 | |
| 32P g ATP | PerkinElmer, Inc. | BLU002X500UC | 500μCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 | |
| Table 1. Reagents | |||
| Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps | |||
| Geiger counter | Mini Instruments | ||
| SDS PAGE tank | Invitrogen | ||
| Transfer tank | Invitrogen | ||
| Heat blocks (2) | Eppendorf | ||
| Phosphor screen | GE Healthcare | X-ray film can be substituted | |
| Phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Exposure cassette | GE Healthcare | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Perspex shielding | |||
| 1.5ml tubes | VWR international | Screw top with O ring | |
| Table 2. Equipment | |||
References
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).
- Paisan-Ruiz, C. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44, 595-600 (2004).
- Zimprich, A. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44, 601-607 (2004).
- West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).
- Gloeckner, C. J. The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity. Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).
- Lewis, P. A. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).
- Greggio, E. Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin. Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).
- Smith, W. W. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity. Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).
- Deng, X. Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2. Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).
- Lee, B. D. Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson's disease. Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).
- Nichols, R. J. Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson's disease. The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).
- Anand, V. S. Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays. FEBS. J. 276, 466-478 (2009).
- Daniels, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).
- Jaleel, M. LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity. Biochem. J. , (2007).
- Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).
- Imai, Y. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila. Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).
- Greggio, E. The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation. J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
