Summary
Leucin Rich Gentag kinase 2 er et stort multidomain kinase, mutationer i som er den mest almindelige genetiske årsag til Parkinsons sygdom. Analyse af kinase aktiviteten af dette protein har vist sig at være et afgørende redskab i forståelsen af biologi og dysfunktion af dette protein. I dette papir,
Abstract
Leucin Rich Gentag kinase 2 (LRRK2) er en 2527 aminosyre medlem af ROCO familie af proteiner, der besidder en kompleks, multidomain struktur, herunder en GTPase domæne (kaldet ROC, for Ras af komplekse proteiner) og en kinase domæne 1. Opdagelsen i 2004 af mutationer i LRRK2, der forårsager Parkinsons sygdom (PD) resulterede i LRRK2 være fokus for en stor mængde forskning i sin normale funktion og hvordan proteinet går galt i sygdommen staten 2,3. Indledende undersøgelser af funktionen af LRRK2 fokuseret på sine enzymaktiviteter 4-6. Selv om et klart billede er endnu ikke opstå af en konsekvent ændring i disse på grund af mutationer, er data fra en række grupper fremhævede betydningen af den kinase aktivitet LRRK2 i celledød knyttet til mutationer 7,8. De seneste udgivelser har rapporteret hæmmere målrette kinase aktivitet LRRK2, hvilket giver en nøgle eksperimenter med 9-11. I lyset af disse data, er deter sandsynligt, at den enzymatiske egenskaber LRRK2 giver os et vigtigt indblik i biologi dette protein, selv om de er potentielle lægemiddelkandidater til behandling af Parkinsons er åben for debat.
En række forskellige tilgange har været brugt til analyse af kinase aktivitet LRRK2. Oprindeligt blev analyser udføres ved hjælp epitop taggede protein overudtrykt i mammale cellelinier og immunoprecipitated, med analyser foretaget med dette protein immobiliseret på agarose perler 4,5,7. Efterfølgende er renset rekombinant fragmenter af LRRK2 i opløsning også været brugt, for eksempel en GST mærket fragment oprenset fra insekt celler, der indeholder rester fra 970 til 2527 af LRRK2 12. For nylig rapporterede Daniels et al. Isolering af fulde længde LRRK2 i opløsning fra humane embryonale nyre celler, men dette protein er ikke almindeligt tilgængelig 13. I modsætning hertil afkortet den GST fusion form af LRRK2 er kommercielt tilrådighede (fra Invitrogen, tabel 1 for yderligere oplysninger se), og giver et praktisk værktøj til påvisning af en analyse for LRRK2 kinase aktivitet. Flere forskellige udgange til LRRK2 kinase aktivitet er blevet rapporteret. Autophosphorylation af LRRK2 sig selv, fosforylering af myelin Basic Protein (MBP) som et generisk kinase underlag og phosphorylering af en kunstig substrat - døbt LRRKtide, baseret på fosforylering af threonin 558 i Moesin - har alle været anvendt, som er en serie af formodede fysiologiske substrater herunder α-synuclein, Moesin og 4-EBP 14-17. Status af disse proteiner som substrater til LRRK2 fortsat uklart, og som sådan den protokol, der er beskrevet nedenfor, vil fokusere på at bruge MBP som en generisk substrat, idet anvendeligheden af dette system til analyse LRRK2 kinase aktivitet rettet mod en række potentielle substrater.
Protocol
Sikkerhed
Protokollen er beskrevet nedenfor anvender ATP mærket med radioaktivt 32 P på γ fosfat stand til at følge den kinase aktivitet LRRK2. Den er baseret på standard protokoller, der bruges i vores laboratorium, og så med hensyn til mange af trinene i processen, såsom at køre geler, western blotting et cetera de materialer og præcise betingelser bør tages som en rettesnor for det udstyr og protokoller anvendes til disse processer varierer fra laboratorium til laboratorium. Forbindelser, der indeholder isotoper, der udsender ioniserende stråling er potentielt skadelige for menneskers sundhed og strenge krav om tilladelse og forordninger på et institutionelt og nationalt plan kontrollere deres anvendelse. Forsøgene i denne protokol blev gennemført følgende uddannelse i open source-stråling brug på University College London og efter god laboratoriepraksis retningslinjer, som sikkerhedstjenester på skolen (retningslinjer available på http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). Brug af open source-stråling bør ikke forsøges, før passende uddannelse og myndighedsgodkendelse. Det tilsynsorgan, der er ansvarlig for open source-stråling i laboratorieforskning varierer fra land til land. Eksempler på disse er: i Det Forenede Kongerige, Health and Safety Executive ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ), i USA Nuclear Regulatory Commission ( http:// www.nrc.gov / materialer / Miau / Fo-guider-comm.html ), i Canada Canadian Nuclear Safety Commission ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), og i Tyskland Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http : / / www.bfs.de / DE / BFS ). Brugere i andre lande skal bekræfte de lokale regler, regulativer og licensudstedende myndigheder med deres strålingssikkerhed officer. Sikkerhedsforanstaltninger er relevante for denne protokol er blevet bemærket i teksten, fremhævet med det radioaktive kløverblad symbol ( 
).
1. Forberedelse af kinase reaktioner
Alle reaktionsblandingerne udarbejdet i 1,5 ml prøverør med skruelåg indeholdende en O-ring for at forhindre spredning af radioaktivitet.
- Optø protein på isen - LRRK2 vild type, D1994A, G2019S.
- udgør reaktionen på is - 10 nm LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5UL England på 10x kinase buffer, foretages op til 50μl med vand.
2. Kørsel af analysen
Alle trin udnytte 32 P, ATP bør tage pblonder og kniplinger i udpegede stråling områder.
Egnede personlige værnemidler skal bæres - efter standardprocedure i vores laboratorium disse omfatter lab coat, dobbelt handsker og beskyttelsesbriller.
Prøver indeholder 32 P ATP bør være afskærmet fra brugere af 6 mm plexiglas skærme for at minimere eksponering.
Hvor det er relevant, personlige overvågnings-udstyr skal bruges - inden for UCL, skal enhver certificeret open source stråling brugeren har en film badge til at overvåge stråling ved forsøg.
Alle forsøg overflader bør vurderes for radioaktiv forurening før og efter brug med en Geiger tæller.
Alle potentielt forurenede hjælpematerialer skal bortskaffes i nøje overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for bortskaffelse af radioaktivt affald.
- Før start analyse, sæt opvarmning blokke til 30 ° C og 100 ° C.
- Fjern 32 P ATP fra -20 fryser (bemærk, at opbevaringsforhold fro 32 P, ATP kan variere afhængigt af leverandør eller typen af anvendt radionucleotides).
scanning uden for container før brug, tø bag plexiglas skærm. - Med reaktioner på is, tilsæt 1μl af 32 P ATP til hver sammen med 10μM af kold ATP.
- Bland godt med pipetten. Pulscentrifugering at bringe væske til bunden af røret, hvilket minimerer risikoen for forurening.
- Fjern 15μl alikvot for nul tidspunkt end opsige reaktion i alikvot ved tilsætning af 5μl på 4x SDS prøve buffer og denaturering ved 100 ° C i 10 minutter. Pulscentrifugering at bringe væske til bunden af røret, hvilket minimerer risikoen for forurening.
- Resterende Prøven placeres i varmeblok og inkuberes ved 30 ° C i 60 minutter.
- 15μl fjernet på 60 minutter tidspunkt, og reaktionen opsiges af tilsætning af 5μl på 4x SDS prøve buffer og denaturering ved 100 ° C i 10 minutter. Pulscentrifugering at bringe væske til bunden af røret, hvilket minimerer risikoen for forurening.
3. Immunblotting prøverne og analysere resultater
- Prøver at køre på SDS-PAGE
- 10 samt 4-12% Bis-tris polyacrilamide gel forberedt til elektroforese bruger MOPS kører buffer.
- 20μl af hver prøve indlæst gel sammen med 7μl af skarpe genstandeTain protein standard stigen.
- Gel køre på 160V i 90 minutter, eller indtil farvefronten har nået enden af gelen. Alle flydende kontakt med radioisotoper bør behandles som radioaktivt affald og bortskaffes som pr institutionelle retningslinjer. UCL reglementet fremgår, at flydende radioaktivt affald skal bortskaffes ved at hælde ned udpeget radioaktive bortskaffelse vaske med rigeligt vand.
- Protein overføres til PVDF membranen via Western Blot.
- Overførsel buffer forberedt, 1x Tris Glycine plus 20% methanol. PVDF membranen og filterpapir afkortet til den korrekte størrelse til gel og aktiveres med glaciale methanol i tilfælde af membranen eller pre-vådt med transfer buffer i tilfælde af filtrerpapir. Membranen skal være præ-mærket med kuglepen blæk til at tillade identifikation af orientering. Gel fjernes fra Plastic kabinet og overskydende acrylamid fjernes og bortskaffes som radioaktivt affald.
- Gelen skal formes i en sandwich med membranen og filterpapir, sikrer, at ingen bobler findes mellem membranen og gel, og derefter arrangeret i den vestlige skamplet apparat med membranen mellem gel og anoden.
- Overførsel udført på 25V i 16 timer.
- Overførsel buffer forberedt, 1x Tris Glycine plus 20% methanol. PVDF membranen og filterpapir afkortet til den korrekte størrelse til gel og aktiveres med glaciale methanol i tilfælde af membranen eller pre-vådt med transfer buffer i tilfælde af filtrerpapir. Membranen skal være præ-mærket med kuglepen blæk til at tillade identifikation af orientering.
- Efter protein overførsel til PVDF, skal membranen tørres ved stuetemperatur. Endelig bør det tørre membranen isoleres mellem celluloseacetat plader og udsat for enten en fosfor-skærm eller x-ray film til at tillade påvisning af radioaktivt protein. Eksponeringstid kan køre fra flere timer til over en uge, afhængigt af den specifikke aktivitet af de anvendte radioisotop og enzymkinetik af reaktionen.
- Phosphoscreen scannes / film behandlet. Hvis du bruger en fosfor-skærm, skal billedet gemmes som en høj opløsning TIFF eller bitmap-fil, hvis du bruger filmen så den resulterende TRANsparency skal scannes ved hjælp af en stationær skanner og gemmes som en høj opløsning TIFF eller bitmap-fil. Billedet kan derefter blive analyseret i ImageJ, et freeware program, der findes på National Institutes of Health hjemmeside ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
4. Repræsentative resultater
Figur 1 viser repræsentative resultater for en analyse udført ved hjælp af vildtype, G2019S og D1994A LRRK2 med Myelin Basic Protein som en generisk fosfat acceptor substrat. Autophosphorylation af LRRK2 er synlig på ≈ 200kDa, med flere bands, der repræsenterer phosphoryleres MBP synlig fra 20-40kDa. Bemærk den manglende autophosphorylation i D1994A (kinase død) vognbane, og øget fosforylering på grund af den G2019S mutation. Bemærk også residual fosforylering af MBP i kinase døde vognbane. Dette kan skyldes ufuldstændig ablation af kinase aktivitet LRRK2 af D1994A mutant eller afspejle tilstedeværelsen of spore forurener kinaser i reaktionen.
Figur 1.
Discussion
Denne afhandling beskriver et grundlæggende protokol for analysering af kinase aktivitet LRRK2 ved hjælp af en in vitro-system. Af hensyn til kortfattethed, har dette været begrænset til en times slutpunkt skabelon ved hjælp af en generisk substrat, men den generelle protokol gælder for en række potentielle substrater og gøres til genstand for mere avancerede analyser undersøge kinetik af den kinase aktivitet LRRK2 . Dette understreger en af de vigtigste fordele ved at bruge et in vitro system til at undersøge kinase opførsel af et protein som denne: fordi der ikke er fuld kontrol over koncentrationer af enzym og substrat, er det muligt at generere kinetiske data og beregne K m og V max værdier for reaktionen. For mere detaljerede kinetiske evalueringer eller evaluere virkningen af formodede-hæmmere, er en højere overførselshastighed system (som den, der ydes ved hjælp af LRRKtide substrat, der er tilgængelig fra Invitrogen) en overlegen alternativer,ve til den fremgangsmåde, der beskrives her.
Det er dog vigtigt at erkende, at den reduktionistiske model system leveret af in vitro-kinase assays er et af redskaberne til at undersøge biologi af en kinase og dens relationer med potentielle substrater. Data fra analyser som denne skal bruges sammen med andre tilgange for at få et omfattende billede af, hvordan en kinase opfører sig in vitro og i et trådløst sammenhæng. For eksempel kan en formodet substrat fosforyleret in vitro analyseres ved massespektrometri at identificere mulige phosphosites, som så kan manipuleres af målrettet mutagenese (f.eks. Konvertering af serin eller threonin fosfat acceptor rester to none-phosphorylatable restprodukter som alanin) for at undersøge den funktionelle konsekvenser af fosforylering ex vivo.
En central overvejelse i fortolkning af data fra en in vitro assay system som dette er sandsynligheden for eitheR type I eller type II (falsk positive eller falsk negative) fejl. Den reduktionistiske karakteren af dette system desværre afhænder det til begge - i tilfælde af førstnævnte, der har en renset formodet substrat og renset kinase i kunstigt nærheden af hinanden og i høj koncentration (i forhold til den cellulære miljø) kan resultere i kulturgenstandsspor fosforylering begivenheder. Omvendt er mange kinaser fungere som del af et komplekst inden for rammerne af cellen, og kræver co-faktorer for fosforylering af et givent substrat at forekomme. Som nævnt ovenfor, et positivt resultat ved fosforylering af en formodet substrat ved hjælp af en in vitro-system bør derefter testes i et trådløst system til at validere resultatet, og et negativt resultat bør fortolkes med forsigtighed.
I lyset af dette, er det afgørende, hvor det er muligt at have både positive og negative kontroller for at muliggøre en sammenlignende undersøgelse af aktiviteten i din kinase af interesse. Omhyggelig udvælgelse af en positiv control, der har en kendt aktivitet mod din protein af interesse, sammen med en negativ kontrol, der er usandsynligt, at phosphorylerer din formodede substrat, er yderst værdifuld. En kandidat kontrol for LRRK2 er Receptor interagerende kinase 3, der har et nært beslægtet primære sekvens til kinase domæne LRRK2, men har en meget forskellige overordnede domæne struktur 18. Dette er tilgængelig som rekombinant protein fra Invitrogen og bruges som en standard kontrol i vores laboratorium.
Det skal også bemærkes, at de kommercielt tilgængelige form af LRRK2 mangler den N-terminale ende af proteinet og er tagget med glutathion-S-transferase, og dette bør tages i betragtning som en potentiel forstyrrende faktor, når de udfører kinase assays med dette protein, da det ikke vides, hvilken rolle den N-terminale af LRRK2 kan spille i den normale funktion af dette protein. Hvis for eksempel brugte den N-terminale del af LRRK2, der er fraværende i proteinet i denne protokoler afgørende for rekruttering af et bestemt substrat til kinase domæne LRRK2 så vil det have stor indflydelse på de observerede fosforylering af sagde substrat i in vitro-systemet beskrevet ovenfor.
Selv med disse forbehold er det imidlertid vægt på biologi LRRK2 i Parkinsons forskning fremhæver nytten af denne protokol som et værdifuldt redskab til at undersøge adfærd af dette protein i en in vitro-indstilling.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatteren er en af Parkinsons Storbritannien Research Fellow (tilskud F1002). Dette arbejde blev støttet delvist af Wellcome Trust / MRC Fælles Ring i neurodegeneration Award (WT089698) til det britiske Parkinsons Disease Consortium (UKPDC), hvis medlemmer er fra UCL Institute of Neurology, University of Sheffield og MRC Protein phosphorylering Unit ved University of Dundee.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signaling Technology | 9802S | |
| MBP | Sigma-Aldrich | M1891 | |
| 32P g ATP | PerkinElmer, Inc. | BLU002X500UC | 500μCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 | |
| Table 1. Reagents | |||
| Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps | |||
| Geiger counter | Mini Instruments | ||
| SDS PAGE tank | Invitrogen | ||
| Transfer tank | Invitrogen | ||
| Heat blocks (2) | Eppendorf | ||
| Phosphor screen | GE Healthcare | X-ray film can be substituted | |
| Phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Exposure cassette | GE Healthcare | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Perspex shielding | |||
| 1.5ml tubes | VWR international | Screw top with O ring | |
| Table 2. Equipment | |||
References
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).
- Paisan-Ruiz, C. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44, 595-600 (2004).
- Zimprich, A. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44, 601-607 (2004).
- West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).
- Gloeckner, C. J. The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity. Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).
- Lewis, P. A. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).
- Greggio, E. Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin. Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).
- Smith, W. W. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity. Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).
- Deng, X. Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2. Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).
- Lee, B. D. Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson's disease. Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).
- Nichols, R. J. Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson's disease. The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).
- Anand, V. S. Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays. FEBS. J. 276, 466-478 (2009).
- Daniels, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).
- Jaleel, M. LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity. Biochem. J. , (2007).
- Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).
- Imai, Y. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila. Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).
- Greggio, E. The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation. J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
