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Biology

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서 Published: January 18, 2012 doi: 10.3791/3495
Automatic Translation
1
1Department of Molecular Neuroscience, UCL Institute of Neurology

Summary

류신 리치 반복 키나제 2 큰 multidomain의 키나제이며, 돌연변이가있는 파킨슨병의 가​​장 흔한 유전적 원인이됩니다. 이 단백질 키나제의 활동 분석은이 단백질의 생물학과 장애를 이해하는 중요한 도구로 입증되었습니다. 본 논문에서는

Abstract

류신 리치 반복 키나제 2 (LRRK2)는 GTPase 도메인 (단지 단백질의 RAS를 위해, ROC를 칭했다)과 키나제 도메인을 하나 포함하여 복잡 multidomain 구조를 보유하고 단백질의 ROCO 제품군의 2527 아미노산 회원입니다. 파킨슨병 (PD)를 일으킬 LRRK2의 돌연변이 2004 년 발견은 정상적인 기능에 연구의 거대한 볼륨의 초점이되고 LRRK2 결과와 단백질이 질병 상태 2,3에서 틀려서 어떻게되는지. LRRK2의 기능에 초기 조사는 효소 활동을 4-6에 주력. 명확한 사진으로 인해 돌연변이 이러한 일관성의 변경의 등장은 아직 있지만, 그룹의 숫자 데이터가 변이 7,8에 연결된 세포 죽음을 LRRK2의 키나제 활동의 중요성을 강조했다. 최근 출판물은 핵심 실험 도구 9-11를 제공 LRRK2의 키나제 활동을 대상으로 억제제를보고있다. 이러한 데이터의 불빛에,그들은 파킨슨병에 대한 잠재적인 약물 표적 여부를 논의하기 위해 열린 있지만 LRRK2의 효소 속성이 단백질의 생물로 우리에게 중요한 창문을 살 가능성이 높습니다.

다른 방식의 숫자는 분석 LRRK2의 키나제 활동을하는 데 사용되었습니다. 처음 assays는 포유 동물 세포 라인에 overexpressed 에피토프 태그 단백질을 사용하여 수행되었으며 assays는 아가로 오스 비즈 4,5,7에 고정이 단백질을 사용하여 실시와 함께, immunoprecipitated. 이후, 솔루션에 LRRK2의 재조합 조각을 정화하는 것은 또한 LRRK2 12 2527에 잔류물 970를 포함한 곤충 세포에서 정화 GST 태그 조각은 예를 들어, 사용되었습니다. 최근 다니엘스 외가. 인간의 배아 신장 세포에서 솔루션에 전체 길이 LRRK2의 고립을보고, 그러나이 단백질은 13 널리 사용할 수 없습니다. 반면, GST 융합은 LRRK2의 양식 상업 availabl는 잘립니다E (Invitrogen에서 자세한 내용은 표 1 참조)하고 LRRK2 키나제 활동에 대한 분석을 보여주는 편리한 도구를 제공합니다. LRRK2 키나제 활동에 대한 몇 가지 출력이보고되었습니다. Moesin에서 트레오닌 558의 인산화에 따라 불리는 LRRKtide - - LRRK2 자체 인공 기판의 일반적인 키나제 기판 및 인산화 등 Myelin 기본 단백질 (MBP)의 인산화의 Autophosphorylation 모두 사용되었습니다 등 putative 생리 기판의 일련을 가지고 α - synuclein, Moesin 및 4 ebp를 14-17을 포함합니다. LRRK2을위한 기판 이러한 단백질의 상태가 불분명 남아 있으며, 아래에 설명된 같은 프로토콜이 잠재적인 기판의 범위에 대한 감독 분석 LRRK2 키나제 활동이 시스템의 유틸리티를 지적, 일반적인 기판으로 MBP를 사용하여 초점을 맞출 것이다대로.

Protocol

안전

아래에서 설명하는 프로토콜은 ATP가 LRRK2의 키나제 활동을 수행하기 위해 γ 인산 위치에서 방사성 32 P로 표시 사용합니다. 그것은 저희 연구실에서 사용되는 표준 프로토콜을 기반으로, 그래서 같은 젤을 실행으로 프로세스의 단계에 많은 관련하여, 서부는 동부 표준시의 등등을 blotting 자료와 정확한 조건은 장비와 프로토콜로 가이드로 이동해야합니다 이러한 프로세스에 사용은 실험실에서 실험실에 따라 다릅니다. 방사선을 이온화 방출 동위 원소를 포함하는 화합물은 인간의 건강과 기관 및 국가 수준의 컨트롤의 사용에 엄격한 라이센스 및 규정에 잠재적으로 해로운 있습니다. 이 프로토콜의 실험 (지침 에바 대학에서 안전 서비스에서 제공하는 좋은 실험실 연습 지침 칼리지 런던 대학에서 오픈 소스 방사선 사용 훈련 다음과 다음과 같은 진행되었다에서 ilable http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). 오픈 소스 방사선의 사용은 적절한 훈련과 규제 당국의 승인 이전에 시도되지 않습니다. 실험실 연구에 오픈 소스 방사선에 대한 책임 규정 본문은 국가마다 다릅니다. 이들의 예는 다음과 같습니다 : 영국에서, 보건 및 안전 이그 제 큐 티브 ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm 미국의) 원자력 규제위원회 ( http://를 www.nrc.gov / 재료 / miau /, 규정 - 가이드 - comm.html ), 캐나다 캐나다 원자력 안전위원회 (에 http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), 독일 Bundesamt 잔 FÜR Strahlenschutz에 ( HTTP : / / www.bfs.de / 드 / BFS ). 다른 국가의 사용자는 방사선 안전 책임자와 현지 법률, 규정 및 라이센스 당국을 확인해야합니다. 이 프로토콜에 관련된 안전 조치는 방사성 개미 자리 기호 (로 강조, 텍스트에 알려져있다 기호 1 ).

1. 키나제 반응 준비

기호 1 모든 반응 혼합물은 방사능의 확산 방지하기 위해 O 링을 포함하는 나사 모자와 1.5ml 샘플 튜브에서 준비했습니다.

  1. 얼음 해동 단백질 - LRRK2 야생의 종류, D1994A, G2019S.
  2. 10X 키나제 버퍼의 5ul 10nM LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 물이 50μl로 만들어 - 얼음에 반응을합니다.

2. 분석을 실행

기호 1 32 P ATP를 이용하는 모든 단계가 P을 취하지정된 방사선 분야에 레이스.

기호 1 적합 개인 보호 장비를 착용한다 - 우리 연구실의 표준 운영 절차에 따라 이들은 실험실 코트, 이중 장갑 및 보호 고글을 포함합니다.

기호 1 32 P ATP를 포함하는 샘플은 노출을 최소화하기 위해 6mm Perspex 화면에서 사용자로부터 격리되어야합니다.

기호 1 적용, 개인 감시 장치를 사용해야합니다 어디에 - UCL 이내에 모든 인증 오픈 소스 방사능 사용자가 실험 도중 방사선 노출을 모니터링하는 필름 배지가 있어야합니다.

기호 1 모든 실험 표면은 Gei를 사용하여 사용 전후의 방사선 오염에 대한 평가되어야합니다GER 카운터.

기호 1 모든 잠재적으로 오염된 소모품은 방사성 폐기물 처리를위한 제도적 지침에 엄격한 준수에 폐기되어야합니다.

  1. 분석을 시작하기 전에, ° C 100 ° C 각각 30 가열 블록을 설정
  2. -20 냉동기 (저장 조건이 서있 32 P ATP가 사용 radionucleotides의 공급자 또는 유형에 따라 달라질 수 있습니다)에서 32 P ATP를 제거합니다. 기호 1 perspex 화면 뒤에 녹여 사용하기 전에 컨테이너 밖에서 스캔.
  3. 얼음 반응, 감기 ATP의 10μM과 함께 각 32 P ATP의 1μl를 추가합니다.
  4. 피펫과 잘 섞는다. 기호 1 펄스 원심 분리기는 오염의 위험을 최소화, 튜브의 바닥에 액체 가져올 수 있습니다.
  5. 제로 시점에 대한 15μl 나누어지는을 제거D 100 4X SDS 샘플 버퍼와 변성의 5μl를 추가로 나누어지는에 반응 ° 10 분 C를 종료할 수 있습니다. 기호 1 펄스 원심 분리기는 오염의 위험을 최소화, 튜브의 바닥에 액체 가져올 수 있습니다.
  6. 남은 샘플 가열 블록에 배치하고 60 분 30 ° C에서 incubated.
  7. 15μl 10 분 동안 100 4X SDS 샘플 버퍼와 변성의 5μl를 추가하여 종료 60분 시점과 반응 ° C에서 삭제되었습니다. 기호 1 펄스 원심 분리기는 오염의 위험을 최소화, 튜브의 바닥에 액체 가져올 수 있습니다.

3. 샘플을 Immunoblotting 및 결과를 분석

  1. 샘플은 SDS - PAGE에서 실행
    1. 10 잘 4-12% 비스 - 트리스의 polyacrilamide 젤은 맙스 실행 버퍼를 사용하여 전기 영동을위한 준비.
    2. 각 샘플의 20μl는 sharps의 7μl과 함께 겔에로드주석박 단백질 표준 사다리.
    3. 젤 90 분 동안 160v에서 실행하거나 염료 앞에는 젤의 끝에 도달 때까지. 기호 1 radioisotopes과 접촉의 모든 액체 방사성 폐기물로 취급하고 당 기관 지침 폐기해야합니다. 액체 방사성 폐기물이 풍부한 물로 지정 방사성 폐기 싱크를 흘러내리고으로 폐기되어야한다는 UCL 규정은 상태.
  2. 단백질은 서양 얼룩을 통해 PVDF 막으로 전달.
    1. 전송 버퍼, 1X 트리스 글리신 플러스 20 %의 메탄올을 준비했습니다. PVDF 분리막 및 필터 종이 젤에 대한 크기를 해결하기 위해 잘라 멤브레인 또는 필터 종이의 경우 전송 버퍼와 함께 사전 서부 유럽 표준시의 경우에는 빙하 메탄올과 활성화. 막은 방향의 신분을 수 있도록 볼펜 잉크로 미리 표시해야합니다. 기호 1 젤 plast에서 제거IC 케이싱 및 초과 아크릴 아미드는 방사성 폐기물로의 제거 및 처리.
    2. 젤 더 거품이 막과 젤 사이에 존재하지 않는 보장, 멤브레인 및 필터 종이 샌드위치로 구성된 다음 겔과 양극 사이에 멤브레인와 서부 얼룩 장치에 배치해야합니다.
    3. 전송은 16 시간 동안 25V에서 실시.
  3. PVDF에 단백질 전송 따라 멤브레인는 실온에서 건조해야합니다. 마지막으로, 건조 막은 셀룰로오스 아세테이트 시트 사이의 절연 및 형광체 화면 또는 radiolabelled 단백질의 검출을 허용하는 X - 선 필름 중 하나에 노출되어야합니다. 노출 시간은 사용되는 방사성 동위 원소와 반응의 효소 반응 속도론의 특정 활동에 따라 일주일에 몇 시간에서 실행할 수 있습니다.
  4. Phosphoscreen는 / 필름 스캔 처리. 형광체 스크린을 사용하는 경우 이미지가 필름을 사용하는 경우 다음 결과 트란, 고해상도 TIFF 또는 비트맵 파일로 저장해야합니다sparency은 데스크탑 스캐너를 사용하여 스캔하고 고해상도 TIFF 또는 비트맵 파일로 저장해야합니다. 이미지가 ImageJ, 건강 웹사이트의 국립 연구소 (에서 사용할 수있는 프리웨어 프로그램에서 분석할 수 http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).

4. 대표 결과

그림 1은 일반적인 분석 인산염 수용체 기판으로 Myelin 기본 단백질과 야생 유형, G2019S 및 D1994A LRRK2를 사용하여 수행을위한 대표적인 결과를 보여줍니다. LRRK2의 Autophosphorylation 20 - 40kDa에서 볼 수 phosphorylated MBP를 대표하는 여러 밴드와 함께 ≈ 200kDa에서 볼 수 있습니다. D1994A (키나제 죽음) 차선 autophosphorylation의 부재를 참고로 인해 G2019S 돌연변이에 인산화 증가. 키나제 죽은 차선 MBP 또한 잔류 인산화를 적어 둡니다. 이것은 돌연변이에 의해 D1994A LRRK2의 키나제 활동의 불완전 절제로 인해하거나 존재 O이 반영될 수 있습니다F는 반응 kinases를 오염 흔적.

그림 1
그림 1.

Discussion

본 논문은 체외 시스템을 사용하여 LRRK2의 키나제 활동을 시금위한 기본 프로토콜을 설명합니다. 짧음의 관심에서, 이것은 일반적인 기판을 사용하여 한 시간 동안 엔드 포인트 템플릿 제한하지만, 일반적인 프로토콜은 잠재적인 기판의 다양한 적용과 LRRK2의 키나제 활동의 속도론을 조사보다 정교한 분석 의무가 있습니다되었습니다 . 이것은이 같은 단백질 키나제의 행동을 조사하기 위해 체외 시스템을 사용하여의 주요 장점 중 하나를 강조 : 효소와 기판의 농도를 완벽하게 제어가 있기 때문에, 그것은 운동 데이터를 생성하고 K m을 계산 할 수 있습니다 반응 및 V 최대 값. 자세한 운동 평가 또는 putative 억제제의 영향을 평가, 높은 처리량 시스템은 (예 : Invitrogen에서 사용할 수있는 LRRKtide 기판을 사용하여 여유되는 등) 뛰어난 alternati입니다여기에서 설명한 접근했습니다.

그것은 중요하지만, 체외의 키나제의 assays에 의해 제공 reductionist 모델 시스템이 인식하는 하나의 도구는 키나제 및 잠재적인 기판과의 관계의 생물학을 검사합니다. 이와 같은 assays에서 데이터는 키나제는 체외에서 세포 맥락에서 작동하는 방법의 포괄적인 그림을 얻기 위해 다른 접근법과 함께 사용해야합니다. 예를 들어, 체외에서 phosphorylated putative 기판은 다음 기능을 검사를 타겟으로 돌연변이 유발 (예. 변환할 세린이나 알라닌과 같은 ​​없음 - phosphorylatable 잔류물에 트레오닌 인산염 수용체의 잔류물)로 조정할 수있어 가능한 phosphosites를 식별하는 질량 분석계로 분석 가능 인산화의 전의 생체내의 결과.

이와 같은의 시험 관내 분석 시스템에서 데이터를 해석에서 중요한 고려 eithe 가능성있다R 타입 I 또는 유형 II (거짓 양성 또는 거짓 부정적인) 오류. 이 시스템의 reductionist의 자연 안타깝게도 모두 그것을 disposes - 전직의 경우 (휴대폰 환경에 비해) 정화 putative 기판을 앓고 있고 인위적으로 가까이에있는 높은 농도에서 키나제를 정화하는 것은 artefactual 인산화 이벤트를 발생할 수 있습니다. 반대로, 많은 kinases는 세포의 컨텍스트 내에서 복합의 일환으로 기능하고, 발생할 주어진 기판의 인산화 공동 요소를 필요로합니다. 위에서 명시한대로, putative 기판의 인산화에서 긍정적인 결과가 시험 관내 분석 시스템을 사용하여 그 다음 결과를 확인하기 위해 셀룰러 시스템에서 테스트해야하고, 부정적인 결과를주의해서 해석해야합니다.

이걸로 미루어 보아, 그것은 관심의 키나제의 활동의 비교 연구를 허용하는 긍정과 부정 모두 컨트롤이 가능합니다 어디에 중요합니다. 긍정적인 contro주의 선택귀하의 putative 기판 phosphorylate하지 않을 수 있습니다 부정적인 컨트롤과 함께 관심의 단백질을 향해 알려진 활동이 난 매우 중요합니다. LRRK2 하나의 후보 제어 LRRK2의 키나제 도메인에 밀접하게 관련 기본 순서를 가지고 있지만 매우 다른 전체 도메인 구조 18가 키나제 3, 상호 작용 수용체이다. 이것은 Invitrogen에서 재조합 단백질로 사용할 수 있으며 저희 연구실에 표준 컨트롤로 사용됩니다.

이것은, LRRK2의 상용 양식이 단백질의 N - 말단이 부족하고 글루타티온 - S - transferase이 단백질과 키나제 assays을 수행하면 이것은 잠재적인 혼란함을 주죠 요소로 고려되어야 태그가 있는지 또한 지적해야 그것이 알려진이 아니므로 LRRK2의 N - 터미널이 단백질의 정상적인 기능에서 어떤 역할을 수 있습니다. 예를 들어, 단백질에 결석 LRRK2의 N - 터미널 부분은이 프로토콜에 사용되는 경우,그러면이의 관찰 인산화에 큰 영향을 미칠 것입니다 LRRK2의 키나제 도메인에 특정 기판의 채용에 중요 체외 시스템에의 기판 위에서 설명한했다.

도 이러한 경고와 함께, 그러나 파킨슨병의 연구에 LRRK2의 생물에 부착된의 중요성은 체외 설정에서이 단백질의 동작을 조사하는 귀중한 도구로이 프로토콜의 유틸리티를 강조 표시합니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

저자는 파킨슨병의 영국 리서치 연구원 (부여 F1002)입니다. 이 작품은 그의 회원 신경과의 UCL 연구소, 셰필드 대학과 MRC 단백질 인산화 단위에서에서 온 영국 파킨슨병 컨소시엄에 Neurodegeneration 수상의 Wellcome 신뢰 / MRC 공동 통화 (WT089698) (UKPDC)에 의해 부분적으로 지원되었다 던디 대학.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LRRK2 wild type Invitrogen PV4873
LRRK2 G2019S Invitrogen PV4881
LRRK2 D1994A Invitrogen PV6051
Kinase buffer Cell Signaling Technology 9802S
MBP Sigma-Aldrich M1891
32P g ATP PerkinElmer, Inc. BLU002X500UC 500μCi, 30Ci /mMole
4x LDS sample buffer Invitrogen NP0007
2-Mercapt–thanol Sigma-Aldrich M6250
Protein standards Invitrogen LC5800
MOPS running buffer Invitrogen NP0001
Bis-tris acrylamide gel Invitrogen NP0321 4-12% 1mm 10well
PVDF membrane EMD Millipore IPVH00010
Transfer buffer Invitrogen NP0006
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
Geiger counter Mini Instruments
SDS PAGE tank Invitrogen
Transfer tank Invitrogen
Heat blocks (2) Eppendorf
Phosphor screen GE Healthcare X-ray film can be substituted
Phosphor imager GE Healthcare
Exposure cassette GE Healthcare
Centrifuge Eppendorf
Perspex shielding
1.5ml tubes VWR international Screw top with O ring
Table 2. Equipment

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References

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분자 생물학 제 59 키나제 LRRK2 파킨슨병
LRRK2의 키나제 활동 시금<em> 체외에서</em
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