Summary
Quinasa con repeticiones ricas en leucina 2 es una quinasa multidominio grandes, las mutaciones en el que son la causa genética más común de enfermedad de Parkinson. Análisis de la actividad quinasa de la proteína ha demostrado ser una herramienta crucial en la comprensión de la biología y la disfunción de esta proteína. En este trabajo,
Abstract
Quinasa con repeticiones ricas en leucina 2 (LRRK2) es un miembro de 2,527 aminoácidos de la familia ROCO de las proteínas, que poseen una estructura compleja, con varios dominios como un dominio GTPasa (llamado ROC, por Ras de proteínas complejas) y un dominio kinasa 1. El descubrimiento en 2004 de las mutaciones en el LRRK2 que causan la enfermedad de Parkinson (EP) resultó en LRRK2 ser el centro de un enorme volumen de investigación sobre su función normal y cómo la proteína va mal en el estado de la enfermedad 2,3. Las investigaciones iniciales sobre la función de LRRK2 se centró en su actividad enzimática 4-6. A pesar de un panorama claro todavía tiene que emerger de una alteración consistente en estos debido a las mutaciones, los datos de un número de grupos ha puesto de relieve la importancia de la actividad quinasa de LRRK2 en la muerte celular vinculados a las mutaciones 7,8. Publicaciones recientes han descrito inhibidores de la orientación de la actividad quinasa de LRRK2, proporcionando una herramienta clave experimental 9-11. A la luz de estos datos,Es probable que las propiedades enzimáticas de LRRK2 nos ofrecen una ventana importante en la biología de esta proteína, aunque si son blancos potenciales de medicamentos para el Parkinson está abierto a debate.
Una serie de enfoques diferentes se han utilizado para analizar la actividad quinasa de LRRK2. Inicialmente, los ensayos se llevaron a cabo utilizando la proteína epítopo etiquetados sobreexpresado en líneas celulares de mamíferos y immunoprecipitated, con los ensayos realizados con esta proteína inmovilizada en bolas de agarosa 4,5,7. Posteriormente, se purifica fragmentos recombinantes de LRRK2 en la solución también se han utilizado, por ejemplo, un fragmento de etiquetado GST purificada de células de insectos que contengan residuos de 970 a 2527 de 12 LRRK2. Recientemente, Daniels et al. Reportó el aislamiento de LRRK2 de larga duración en solución a partir de células embrionarias de riñón, sin embargo esta proteína no está ampliamente disponible 13. Por el contrario, la fusión GST truncado forma de LRRK2 es comercialmente dise (de Invitrogen, véase el cuadro 1 para más detalles), y proporciona una herramienta útil para la demostración de un ensayo para la actividad de la quinasa LRRK2. Diferentes productos de la actividad quinasa LRRK2 se han reportado. Autofosforilación de LRRK2 en sí, la fosforilación de la proteína básica de mielina (MBP) como sustrato de quinasa genéricos y la fosforilación de un sustrato artificial - LRRKtide llamada, basado en la fosforilación de treonina 558 en Moesin - se han utilizado, al igual que una serie de supuestos sustratos fisiológicos incluyendo α-sinucleína, Moesin y 4-EBP 14-17. El estado de estas proteínas como sustratos para LRRK2 aún no está claro, y como tal, el protocolo descrito a continuación se centrará en el uso de MBP como sustrato genérico, teniendo en cuenta la utilidad de este sistema de ensayo de actividad de la quinasa LRRK2 contra una amplia gama de sustratos potenciales.
Protocol
Seguridad
El protocolo se describe a continuación utiliza ATP marcado con 32 P radiactivo en la posición del fosfato γ para seguir la actividad de la quinasa de LRRK2. Se basa en los protocolos estándar utilizados en nuestro laboratorio, y por lo tanto con respecto a muchos de los pasos en el proceso como la ejecución de los geles, el Western Blot et cetera los materiales y las condiciones precisas se debe tomar como guía los equipos y protocolos utilizados para estos procesos varían de un laboratorio a otro. Los compuestos que contienen isótopos que emiten radiaciones ionizantes son potencialmente dañinos para la salud humana y las licencias y regulaciones estrictas en un control de nivel institucional y nacional de su uso. Los experimentos en este protocolo se llevaron a cabo después del entrenamiento en el uso de radiación de la fuente abierta en el University College de Londres y siguiendo las directrices de buenas prácticas de laboratorio proporcionados por los servicios de seguridad en el colegio (directrices available en http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). El uso de la radiación de código abierto no debe ser intentado antes de la formación adecuada y la aprobación regulatoria. El organismo regulador responsable de la radiación de fuentes abiertas en la investigación de laboratorio varía de país a país. Ejemplos de estos son: en el Reino Unido, la Health and Safety Executive ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ), en los Estados Unidos la Comisión Reguladora Nuclear ( http:// www.nrc.gov / materiales / miau / reglas-guías comm.html- ), en Canadá la Comisión Canadiense de Seguridad Nuclear ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), y en Alemania Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http : / / www.bfs.de / de / BFS ). Usuarios de otros países deben confirmar las reglas, los reglamentos y autoridades que otorgan licencias con el oficial de seguridad radiológica. Precauciones de seguridad pertinentes para este protocolo se han observado en el texto, resaltado con el símbolo del trébol radiactivo ( 
).
1. Preparación de las reacciones de quinasa
Todas las mezclas de reacción preparada en tubos de muestra de 1,5 ml con tapón de rosca que contiene una junta tórica para evitar la propagación de la radiactividad.
- Descongele la proteína en el hielo - LRRK2 de tipo salvaje, D1994A, G2019S.
- constituyen una reacción en el hielo - 10 nM LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5UL de tampón quinasa 10X, compuesto de 50μl con agua.
2. Al realizar el análisis
Todos los pasos que utilizan 32 P ATP debe tomar pencaje en las áreas designadas de radiación.
Equipo de protección personal se debe usar - en un procedimiento operativo estándar en nuestro laboratorio que incluyen bata de laboratorio, guantes dobles y gafas protectoras.
Las muestras que contienen 32 P ATP debe ser protegido de los usuarios de pantallas de metacrilato de 6 mm para minimizar la exposición.
Cuando se utilicen dispositivos de aplicación, el seguimiento personal debe ser utilizado - en la UCL, cualquier certificado de usuario abierta la radiación de origen debe tener una placa de cine para monitorear exposición a la radiación durante los experimentos.
Todas las superficies experimentales se debe evaluar la contaminación radiactiva antes y después de su uso mediante un Geiger contra.
Todos los consumibles potencialmente contaminados deben ser eliminados en estricto apego a las directrices institucionales para la eliminación de los residuos radiactivos.
- Antes de comenzar la prueba, establecer bloques de calentamiento a 30 ° C y 100 ° C, respectivamente,
- Retire 32 P ATP a partir de congelador a -20 (tenga en cuenta que las condiciones de almacenamiento de aquí para allá 32 P ATP puede variar en función de proveedor o el tipo de radionucleótidos se utiliza).
exploración fuera del contenedor antes de su uso, descongelar detrás de la pantalla de metacrilato. - Con las reacciones en el hielo, añadir 1μl de 32 P ATP a cada junto con 10μM de ATP frío.
- Mezclar bien con la pipeta. Centrífuga de pulso para llevar líquido a la parte inferior del tubo, reduciendo al mínimo el riesgo de contaminación.
- Quitar alícuota 15μl de punto cero del tiempo unad terminar la reacción de parte alícuota de la adición de 5μl de tampón de muestra SDS 4x y desnaturalización a 100 ° C durante 10 minutos. Centrífuga de pulso para llevar líquido a la parte inferior del tubo, reduciendo al mínimo el riesgo de contaminación.
- Resto de la muestra colocada en el bloque de calentamiento y se incuba a 30 ° C durante 60 minutos.
- 15μl retirado a los 60 minutos de tiempo y punto de terminar la reacción mediante la adición de 5μl de tampón de muestra SDS 4x y desnaturalización a 100 ° C durante 10 minutos. Centrífuga de pulso para llevar líquido a la parte inferior del tubo, reduciendo al mínimo el riesgo de contaminación.
3. Inmunotransferencia las muestras y el análisis de los resultados
- Muestras analizadas por SDS-PAGE
- 10 y 12.4% Bis-Tris gel de poliacrilamida preparados para electroforesis con buffer MOPS funcionamiento.
- 20μl de cada muestra cargada en gel junto con 7μl de objetos punzantesmantener escalera cantidad estándar de proteínas.
- Gel funcionar a 160V durante 90 minutos, o hasta que frente tinte ha llegado al final del gel. Todo el líquido en contacto con radioisótopos deben ser tratados como residuos radiactivos y eliminados de las directrices institucionales de acuerdo. Regulaciones estatales UCL que los residuos radiactivos líquidos deben ser desechados mediante el vertido de abajo designado fregaderos de desechos radiactivos con abundante agua.
- Proteínas transferidas a una membrana de PVDF a través de Western blot.
- Tampón de transferencia preparada, 1x Tris glicina y un 20% de metanol. Membrana de PVDF y papel de filtro cortado al tamaño correcto para el gel y se activa con metanol de los glaciares en el caso de la membrana o humedecer previamente con tampón de transferencia en el caso del papel de filtro. La membrana debe ser pre-marcado con tinta de bolígrafo para permitir la identificación de la orientación. Gel retirado de plastIC carcasa y el exceso de acrilamida retirados y eliminados como residuo radiactivo.
- El gel debe ser formado en un sándwich con la membrana y el papel de filtro, asegurando que no existen burbujas entre la membrana y el gel, y luego dispuestos en el aparato de Western blot con la membrana entre el gel y el ánodo.
- Transferencia realizada a 25V durante 16 horas.
- Tampón de transferencia preparada, 1x Tris glicina y un 20% de metanol. Membrana de PVDF y papel de filtro cortado al tamaño correcto para el gel y se activa con metanol de los glaciares en el caso de la membrana o humedecer previamente con tampón de transferencia en el caso del papel de filtro. La membrana debe ser pre-marcado con tinta de bolígrafo para permitir la identificación de la orientación.
- Después de la transferencia de proteínas a PVDF, la membrana se debe secar a temperatura ambiente. Finalmente, la membrana en seco deben ser aislados entre las hojas de acetato de celulosa y se expone a cualquiera de una pantalla de fósforo o de película de rayos X para permitir la detección de la proteína marcada radiactivamente. Tiempo de exposición puede ejecutar de varias horas a más de una semana dependiendo de la actividad específica del radioisótopo utilizado y la cinética enzimática de la reacción.
- Phosphoscreen escaneados / película procesada. Si se utiliza una pantalla de fósforo, la imagen debe ser guardado como un archivo TIFF de alta resolución o un archivo de mapa de bits, si se utiliza película entonces la resultante transiciónsparency deben ser escaneados con un escáner de escritorio y guarda como un archivo TIFF de alta resolución o un archivo de mapa de bits. La imagen puede ser analizada en ImageJ, un programa gratuito disponible en el sitio web de los Institutos Nacionales de Salud ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
4. Resultados representante
La figura 1 muestra los resultados representativos de un ensayo llevado a cabo utilizando el tipo salvaje, y LRRK2 G2019S D1994A con proteína básica de mielina como sustrato aceptor de fosfato de genéricos. Autofosforilación de LRRK2 es visible en ≈ 200kDa, con múltiples bandas que representan a MBP fosforilada visible a partir del 20-40kDa. Nótese la ausencia de autofosforilación en el D1994A (quinasa muertos) de carril, y el aumento de la fosforilación debido a la mutación G2019S. Tenga en cuenta también la fosforilación de residuos de MBP en el carril de muertos quinasa. Esto puede ser debido a la ablación incompleta de la actividad quinasa de LRRK2 por el mutante D1994A o reflejar la presencia of rastro contaminante quinasas en la reacción.
Figura 1.
Discussion
Este documento describe un protocolo básico para el ensayo de la actividad quinasa de LRRK2 usando un sistema in vitro. En aras de la brevedad, este se ha limitado a una plantilla final de una hora con un punto de sustrato genérico, pero el protocolo general es aplicable a una amplia gama de sustratos potenciales y susceptibles de análisis más sofisticados examinar la cinética de la actividad quinasa de LRRK2 . Esto pone de relieve una de las principales ventajas de la utilización de un sistema in vitro para examinar el comportamiento de una proteína quinasa, como esta: porque no hay un control completo sobre las concentraciones de la enzima y el sustrato, es posible generar los datos de cinética y calcular la K m V y los valores máximos para la reacción. Para las evaluaciones más detalladas cinética o evaluar el impacto de los inhibidores putativos, un sistema de mayor rendimiento (como la que ofrece el uso del sustrato LRRKtide, disponible en Invitrogen), es un espléndido alternative al método descrito aquí.
Es importante, sin embargo, reconocer que el sistema proporcionado por el modelo reduccionista en los ensayos de quinasa in vitro no es más que una herramienta para examinar la biología de una quinasa y sus relaciones con los posibles sustratos. Los datos de los ensayos de este tipo se debe utilizar en combinación con otros métodos para obtener un cuadro completo de cómo se comporta una quinasa in vitro y en un contexto celular. Por ejemplo, un sustrato putativo fosforilada in vitro pueden ser analizados por espectrometría de masas para identificar phosphosites posible que luego pueden ser manipulados por mutagénesis dirigida (por ej. Serina treonina o la conversión de los residuos de aceptor de fosfato de phosphorylatable no-residuos como la alanina) para examinar el funcionamiento consecuencias de la ex vivo fosforilación.
Una consideración clave en la interpretación de los datos de un sistema de ensayo in vitro de este tipo es la probabilidad de either de tipo I o tipo II (falsos positivos o falsos negativos) errores. La naturaleza reduccionista de este sistema por desgracia, dispone de dos - en el caso de la primera, tiene un sustrato purificada putativo y purificada quinasa muy cerca artificialmente y en alta concentración (en comparación con el medio celular) puede dar lugar a eventos de fosforilación artefacto. Por el contrario, muchas quinasas funcionan como parte de un complejo en el contexto de la célula, y requieren de cofactores para la fosforilación de un sustrato dado que se produzca. Como se señaló anteriormente, un resultado positivo de la fosforilación de un sustrato supuesto usando un sistema de ensayo in vitro se debe probar en un sistema celular para validar el resultado, y un resultado negativo debe ser interpretado con cautela.
En vista de ello, es fundamental que sea posible la realización de controles positivos y negativos para permitir un estudio comparativo de la actividad de la quinasa de interés. La selección cuidadosa de un contro positivol que tiene una actividad conocida a la proteína de interés, junto con un control negativo que es poco probable que fosforilan el sustrato putativo, es extremadamente valioso. Un candidato para el control de LRRK2 es la interacción del receptor quinasa 3, que tiene una secuencia estrechamente relacionados con el principal dominio de la quinasa LRRK2 pero tiene una estructura global de dominio muy diferente 18. Esto está disponible como proteína recombinante de Invitrogen y se utiliza como un control estándar en nuestro laboratorio.
También hay que señalar que la forma comercial de LRRK2 carece de la N-terminal de la proteína y se etiqueta con glutatión-s-transferasa y esto debe ser tenido en cuenta como posible factor de confusión en la realización de ensayos con esta proteína quinasa, ya que no se sabe cuál es el papel de la N-terminal de LRRK2 pueden desempeñar en la función normal de esta proteína. Si, por ejemplo, la porción N-terminal de LRRK2 que está ausente en la proteína usada en este protocoloes fundamental para la contratación de un sustrato específico para el dominio quinasa de LRRK2 entonces esto tendrá un impacto importante en la fosforilación observados de dicho sustrato en el sistema in vitro se ha descrito anteriormente.
Aun con estas salvedades, sin embargo, la importancia que tiene la biología de LRRK2 en la investigación de Parkinson destaca la utilidad de este protocolo como una herramienta valiosa para investigar el comportamiento de esta proteína en un entorno en vitro.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El autor es un Reino Unido de Parkinson Research Fellow (subvención F1002). Este trabajo fue apoyado en parte por el Wellcome Trust / MRC convocatoria conjunta en la concesión de neurodegeneración (WT089698) al Consorcio de la Enfermedad de Parkinson del Reino Unido (UKPDC), cuyos miembros son del Instituto UCL de Neurología de la Universidad de Sheffield y la proteína MRC Unidad de Fosforilación en la Universidad de Dundee.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signaling Technology | 9802S | |
| MBP | Sigma-Aldrich | M1891 | |
| 32P g ATP | PerkinElmer, Inc. | BLU002X500UC | 500μCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 | |
| Table 1. Reagents | |||
| Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps | |||
| Geiger counter | Mini Instruments | ||
| SDS PAGE tank | Invitrogen | ||
| Transfer tank | Invitrogen | ||
| Heat blocks (2) | Eppendorf | ||
| Phosphor screen | GE Healthcare | X-ray film can be substituted | |
| Phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Exposure cassette | GE Healthcare | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Perspex shielding | |||
| 1.5ml tubes | VWR international | Screw top with O ring | |
| Table 2. Equipment | |||
References
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