Summary
これからアクティブ全長キネシンを分離するためのプロトコルです。
Abstract
モータータンパク質は微小管に沿って貨物を移動し、特定のサブ携帯の場所にそれらを運ぶ。変更されたトランスポートが微小管に基づいてモータの輸送とその調節を理解し、神経変性疾患の様々な根底にあることが示唆されているため、おそらく最終的に改良された治療法につながる。キネシン-1はATPの加水分解により微小管の電源（MTS）に沿って順行性（プラス端）方向に移動する真核生物のモータータンパク質である。ここでは、このように、単一分子生物物理学の研究とショウジョウバエの遺伝学の組み合わせを可能にする、 ショウジョウバエの胚からアクティブな完全な長さのキネシンを分離するための詳細な精製プロトコールを報告します。カップ当たり約1000人の女性で、約50敷設カップを皮切りに、我々は一晩のコレクションを行った。これは、パックされた胚の約10ミリリットルを提供した。胚（胚の約9グラムが得られる）dechorionated漂白剤であったし、ホモジナイズした。 AFTERの中断は、ホモジネートを高速遠心分離に続いて低速のスピンを用いて明らかにした。明らかに上清は、MTSを重合させるGTPおよびタキソールで処理した。キネシンは、ATPアナログ、室温で5'-アデニル酸imidodiphosphateを追加することにより、重合MTの上に固定化されました。キネシンの結合した後、微小管は、ショ糖クッションを介して高速遠心分離を介して沈殿させた。微小ペレットを再懸濁し、このプロセスが繰り返されました。最後に、ATPはMTSからキネシンを解放するために追加されました。高速遠心分離し上清中にキネシンを残して、MTをスピンダウン。このキネシンは、さらに精製するためにフィルタ100 KDカットオフを使用して遠心濾過し、分注し、液体窒素中で凍結し、-80℃で保存されているにスナップブロッティングSDSゲル電気泳動とウェスタン精製サンプルを用いて行った。最後の遠心濾過工程の前と後精製したサンプルの運動in vitroで単一分子の微小管のアッセイで用いて評価した。遠心濾過前と後のキネシン分画は、以前に文献で報告されているように（processivity）を示した。さらに実験では、キネシンやその他の輸送関連タンパク質間の相互作用を評価するために進行中です。
Protocol
ハエの株は、ラボで購入して増幅することができる。受信されたショウジョウバエ培養バイアルの量に応じて、一つは頻繁に一度バイアルが最大容量に達しており、文化バイアルを"反転"する必要があります。約50 ショウジョウバエの培養瓶がいっぱいになるまで増幅が続行されます。一つは、その後（カップ意思フライ次のセクションで説明されています）100ミリリットルビーカートライコーンで "カップを飛ぶ"ことができます。 24時間後に、下部に貼付し、フライ食品と種子新しいショウジョウバエ培養バイアルにこれらのカップから胚を使用しています。室温で一晩胚から完全に成長してハエにショウジョウバエの胚の成長時間は約8.5日です。シードの胚は、最初の幼虫のステージに12から15時間後に孵化。幼虫は孵化後24および48時間で2番目と3番目の幼虫ステージに二回脱皮約4日間、成長します。幼虫はその後pupariumsにカプセル化し、tから新興国まで、4日間の変態に提出する相続人蛹ケース1。各ハエの量を増加させるショウジョウバエ培養バイアルに約2〜3日間以上の成長を可能にします。 400バイアルが満たされている場合、50産卵カップ（カップあたり約1,000雌バエ）のハエのに十分な量が存在します。ハエは、新しい環境に適応する時間が必要です。これは通常のカップに転送された後、コレクションの準備ができている彼らのために二日ほどかかります。毎日の寒天プレートを交換するハエは長生きすることができている、フライカップをきれいに維持されます。 （ ショウジョウバエのケアと増幅のさらなる理解のために、DBロバーツ" ショウジョウバエを参照してください：実践的アプローチ2）。
ショウジョウバエの胚を大量に取得するには良い情報源は、市販されている人口ケージ3です。人口ケージの組み立てとメンテナンスは本ショウジョウバエの第5章と7日に見ることができます：P細胞および分子生物学4 ractical用途。しかし、人口のケージは高価であり、維持することは困難です。人口ケージは、ハエの豊富な量を保持できるので、二酸化炭素の使用は、ハエを転送し、供給する必要があります。前に述べたように、二酸化炭素も出さないよう、それらを引き起こして、ハエの健康を減少させます。小さな規模で、100ミリリットルトライコーンのビーカーを使用することができます。 50 100mlのビーカーに、dechorionated胚の9グラムを達成することができます。ために我々は、異なるメッシュサイズのダブルレイヤーふるいキャッチャーを作成している死んだハエ、未使用の酵母ペーストと他の不純物を除去します。死んだハエのようなものふるいトラップが不要な材料の胚は（350ミクロンの孔径）を通過することができた。第二部では、 ショウジョウバエの胚および他の不純物を捕捉することを意味するメッシュ（120ミクロンの孔の大きさ）、メッシュを通過しますが含まれています。
1。カップの準備と胚コレクションを飛ぶ
- フリップ複数のバイアルから空のプラスチックバイアルに増幅されたハエは、ハエの量まで、バイアルの高さの1インチに達しています。その後、100ミリリットル卵コレクションカップ（ナイロンメッシュ窓付きtriconビーカー）にそれらのハエを転送します。ハエを転送するときにハエの脱出を防ぐために、硬い表面の上にカップをタップしてください。寒天プレート含む酵母ペーストでカップをカバーし、安定化時間の24〜48時間が可能になります。
- 50フライカップから一晩寒天プレートを収集し、水をきれいにペイントブラシを使用して実行しているふるいキャッチャーにプレートの内容を洗う。肉はすべて酵母ペーストは、多量の水でふるいに胚を洗い流されるまで。
- 3分間、50％の漂白剤でそれらを浸漬して洗浄し、胚をDechorionate。
- 胚漂白剤の臭いルーズまで幅広く蒸留水で洗い流してください。その後、AC倍タオルを複数回にそれを置くことによって、胚でメッシュを乾燥させます。クリーンバイアルに胚を移し、重量を記録します。 </ LI>
2。胚の均質化、清澄化
- 氷冷抽出緩衝液の1.5倍のボリュームでダウンスホモジナイザーでdechorionated胚を配置します。
- 緩い乳棒で5ストロークを行います。クリーンな遠心チューブに分注しホモジネートを。 40分間15,000 gで遠心します。 4℃で
- 慎重に上部の白い脂質層または下部ペレットせずに上澄み液を収集します。
- 30分50,000 gで遠心チューブと遠心分離機をきれいに上清を移します。 4℃で
- 上記で説明したように収集した結果、高速上清を直ちに使用することができるか月間凍結し、-80℃で保存スナップすることができます。
3。微小管重合とキネシンの結合
- 室温に凍結した高速な上清を解凍します。 、微小管を重合させるGTP（0.3 mm）とタキソール（20μM）を追加し、20分間室温で穏やかに攪拌する回転シェーカー。
- キネシンをバインドするには、回転シェーカーで、室温で10分間撹拌し、続いて2.5 mMの非加水分解性ATPアナログの5'-アデニル酸imidodiphosphate（AMPPNP）を追加します。
4。微小管とキネシンの差動沈降
- 30分間、23000グラム（sw41tiローター、TLS-55）で遠心分離によって等量の蔗糖クッション（抽出緩衝液に20％スクロースおよび10μMのタキソール）を介して堆積物。 4℃で
- 10μMのタキソール、75 mM NaClを含む抽出緩衝液の元のホモジネート量の10％で再懸濁によってペレットを洗浄します。
- ステップ4.1のような別の等量の蔗糖クッションと沈降を繰り返します。
- 20μMタキソール、75mMのNaCl、10mMのMgSO 4を 、10 mMのATPと5％の抽出緩衝液中で塩洗浄からペレットを再懸濁する。
- 4時20分℃で12万グラム（42,000回転：31000回転、TLS-55 sw41tiローター）での堆積物上清（キネシンを収集する画分）。
- 4℃で15分間、14,000 gで遠心ろ過℃を実行します。濃縮されたサンプルを回収し、30分間上記のように、新しいフィルタとろ過を繰り返し、濃縮サンプルを収集します。
- 濃度を決定するタンパク質アッセイを実行します。簡単に言えば、既知のタンパク質の濃度を変化させること（ウシ血清アルブミン、BSA）ブラッドフォード試薬の既知の体積と混合し、波長595nmにおける光学密度を測定した。その後、光学密度対濃度の標準曲線は、標準のBSAのサンプルと同様の条件下で測定し、このサンプルの光学密度を用いたキネシン画分を精製した未知の濃度を計算するために設立されました。ゲル電気泳動と同様にウェスタンブロット法はまた、精製したキネシンの既知量を用いて行った。
- 液体窒素中で所望の濃度とスナップ凍結の小さなボリュームにアリコートキネシン画分は-80℃で保存する℃、
フルレングスの機能キネシンは、 ショウジョウバエの胚から精製した。 図1は、精製過程の異なる画分を示す銀染色ゲルを示しています。レーン1、レーン2は明確化した後にペレットのサンプルを解明した後、高速上清（ステップ2.5）のサンプルです、レーン3、レーン4ショ糖クッション（ステップ4.1）を持つ最初沈殿後の上澄み液のサンプルを示します。ペレットのサンプルが最初に沈降した後、レーン5は、第2沈降（ステップ4.3）後の上清のサンプルになっている場合、レーン6は、第2の沈降後ペレットのサンプル、レーン7は、ペレットのサンプルです。最終沈殿（ステップ4.5）、レーン8は、精製されたキネシンのサンプル、レーン9は、フィルタリングキネシンのサンプルであり、レーン10は、マーカーである。レーン8および9で濃縮されたバンドは115前後でKDはFigurと一致しているキネシン重鎖1です。E 1、1988年5公開サクストン紙のレーン8。 図2は、精製したキネシン画分のCウエスタンブロットを表すには、キネシン重鎖抗体を用いて検出されました。抗体AKINO1-著しく他のキ ネシンファミリーのメンバー6で交差しません。画分をキネシン-1に濃縮されている間、注意してその機能キネシンの良い情報源で、このプロトコルの結果が、潜在的に他のキネシンや他のモータータンパク質を含む可能性の汚染物質が存在します。我々は、ろ過によってより小さい汚染物質の様々を削除しました。限り単独でのサイズによって行うことができない他のモータを取り外すと、精製はキネシン7を研究するために他のユーザーによって行われたものと同様であり、我々は、アクティブなモーターの大半は、キネシン-1であると信じていますが、より洗練された精製ができるようになるなどの潜在的なモータの汚染物質の除去はCole ら 8サクストンらによって行われた9。 10 "モータータンパク質の運動アッセイ"と題したスコーリーの本で詳しく説明したようにキネシンの能力（processivity）は、in vitroで単一分子の微小管結合アッセイにより評価した。簡単に言うと、単一のアクティブモータとポリスチレンビーズは、飽和（1 mm）のATPの存在下で、微小管と接触させた。モーターは微小管に取り付けられており、レーザートラップの中心から離れて歩き始めた。トラップの中心部からはビーズの事前定義された変位（100 nm）でレーザービームのパワーは、自動的にモータが無負荷の下でMTに沿って歩くことができ、オフにした。映画は、MTに沿って歩いて、単一のキネシンとビーズ500nmの直径を示しています。ビデオ画面の長さは20μmに対応しています。 図3は、ここで紹介するプロトコールに従って精製し、単一のフルレングスショウジョウバエのキネシン分子のためのランタイムの長さの測定分布を表します。 exponentiらは、ディストリビューションに適合すると、単一のキネシン1.55平均レングス±0.1μmと1.28±それぞれフィルタとフィルタ処理されていないサンプルの0.12μmを提供します。
図1は、精製画分の銀染色ゲル：サンプルそれぞれの画分からは、10％ゲルで実行されています。タンパク質10μgを各レーンにロードされました。レーン1、レーン2は明確化した後にペレットのサンプルを解明した後、高速上清（ステップ2.5）のサンプルです、レーン3、レーン4ショ糖クッション（ステップ4.1）を持つ最初沈殿後の上澄み液のサンプルを示します。ペレットのサンプルが最初に沈降した後、レーン5は、第2沈降（ステップ4.3）後の上清のサンプルになっている場合、レーン6は、第2の沈降後ペレットのサンプル、レーン7は、ペレットのサンプルです。最終沈殿（ステップ4.5）、レーン8は、精製されたキネシンであるサンプル、レーン9は、100 kDのカットオフアミコンウルトラ0.5ミリリットル遠心フィルター（Millipore、米国）を使用してフィルタリングキネシンです。青い矢印は、その金額は減少し、赤の矢印は、このプロトコルで使用される遠心濾過工程によるキネシンの濃度を示したタンパク質を示す。
一次抗体に対する精製したキネシンのサンプルはゲル電気泳動に供し、（ニトロセルロース膜で）ブロットしたAKINO1·インキュベーション、続いて室温で1時間（TBSTで1:1000）： 図2精製KHC画分は抗キネシン抗体に対してブロットした。室温で1時間のためにロバ抗ウサギ抗体（TBSTで1:10,000）であった。 ECL（化学発光）キットは、上記のようにキネシン信号を検出するために使用された。
図3。 ショウジョウバエ全長キネシンの>ランレングスと速度（A）と（B）フィルタキネシンサンプルのランレングスと速度。 （C）と（D）フィルタ処理されていないキネシンサンプルのランレングスと速度。
図4。キネシンの運動のビデオはビデオを見るにはここをクリック 。
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Discussion
マウス脳は同様に12使用されているものの、ウシの脳は、フルレングスキネシンを精製するために最も広く使用されている出発材料11である。キネシン源としてウシの脳を使用しての大規模な欠点は、新鮮な原料の可用性です。屠殺場は、通常アクセスできないと、脳はアクティブキネシンを得るために非常に新鮮でなければなりません。さらに、若い牛の脳だけが有効である。最後に、牛の遺伝子操作は、現在実行可能な選択肢ではないので、唯一の "野生型"タンパク質を研究することができます。
マウスは、より多くのアクセス可能ですが、マウスの脳を収穫する浄化としてやや困難と時間がかかり、50以上の頭脳を必要とすることができます。さらに、マウスのコロニーを維持することは非常に高価になることができます。
ウシやマウスソースとは対照的に、ショウジョウバエは多くの利点があります。最初に、ハエが容易で、最小限の資本金は実験室で成長させることができる置くため、容易にアクセスできます。 ショウジョウバエは、ここで説明するように簡単に収穫される多産の胚を、レイアウトされています。 ショウジョウバエのゲノムを操作することができ、実際に多くの変異体のハエが容易に得られるため、両方の野生型および変異体タンパク質を精製することができ、原因遺伝子操作と短い世代のスパンの組み合わせに、より多くの変異体を単離することができる。しかし、キネシンの機能の完全な損失は致命的であり、胚の蛋白質は、それが劇的に損なわれている純粋なキネシン変異体を精製することが可能ではありませんが、母体主に提供されているので、ことに留意すべきである。それにもかかわらず、ヘテロ接合体胚（血縁MUT / +）からタンパク質を精製し、混合集団の機能を特徴づけることが可能であるし、潜在的に動物の表現型と機能的にこのような変化を関連しています。
トランスポートの変更または障害は、多くの神経変性疾患の根底にあるように見えますが、機構的リンク病気や単一分子機能の変化との間で（どちらかの突然変異または改変されたシグナリング環境に起因する）は不明である。単分子アッセイはモータの機能を決定するために使用することができますので、ここで開発したタンパク質精製アッセイは、このような理解を追求する上で重要なツールである必要があります。表現型のin vivo特性にしてこのような研究を組み合わせ、モデリングによる支援では、これは変更する特定の単一分子特性と疾患の開発/進行（の間の関係の直接測定を可能にする例として、変更された単一分子ダイニンの機能との間のリンクを参照してください。障害のあるニューロンの輸送、13）。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトの支援と支援のためのクリス·ガイ、ジェイソン·デル·リオに感謝します。この作品は、RO1 SPGへの助成金GM070676によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Petri Dishes | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5’-adenylyl imidodiphosphate | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | EMD Millipore | UFC510008 |
References
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