Summary
Este é um protocolo para isolar cinesina comprimento ativo total de
Abstract
Proteínas motoras mover cargas ao longo dos microtúbulos, e transportá-los às especificidades sub-celulares locais. Como o transporte alteradas é sugerido para subjacentes uma variedade de doenças neurodegenerativas, compreendendo microtúbulo base de transporte do motor e da sua regulação, provavelmente, em última análise, levar a abordagens terapêuticas melhoradas. Cinesina-1 é uma proteína do motor eucariótica que se move numa direcção anterógrada (plus-fim) ao longo de microtúbulos (MTS), alimentado por hidrólise de ATP. Relatamos aqui um protocolo de purificação para isolar detalhada cinesina comprimento activo total a partir de embriões de Drosophila, permitindo assim que a combinação de Drosophila genética com molécula única estudos biofísicos. Começando com cerca de 50 copos de poedeiras, com cerca de 1000 mulheres por xícara, foram realizadas coletas durante a noite. Isto forneceu cerca de 10 ml de embriões embalados. Os embriões foram lixívia dechorionated (rendendo aproximadamente 9 gramas de embriões), e, em seguida, homogeneizada. Afperturbação ter, o homogeneizado foi clarificada usando uma velocidade de centrifugação de baixa seguido por uma centrifugação de alta velocidade. O sobrenadante clarificado foi tratada com GTP e taxol para polimerizar MTs. Cinesina foi imobilizada em polimerizada MTs adicionando o análogo de ATP, 5'-ciclase imidodiphosphate à temperatura ambiente. Depois de cinesina de ligação, os microtúbulos foram sedimentadas por meio de centrifugação a alta velocidade através de uma almofada de sacarose. O sedimento de microtúbulos foi então re-suspenso, e este processo foi repetido. Finalmente, o ATP foi adicionado para libertar o cinesina a partir do MTs. Centrifugação a alta velocidade, em seguida, centrifugadas a MTS, deixando a cinesina no sobrenadante. Este cinesina foi submetido a uma filtração centrífuga usando um corte 100 KD fora do filtro para a purificação adicional, aliquotadas, encaixe congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C. Electroforese em gel SDS e Western blotting foi realizada utilizando a amostra purificada. A actividade motora das amostras purificadas antes e após o passo de filtração final centrífugafoi avaliada usando um ensaio in vitro única molécula de microtúbulos. As fracções cinesina antes e depois da filtração centrífuga mostrou processabilidade como previamente relatados na literatura. Outros experimentos estão em andamento para avaliar a interação entre cinesina e outras proteínas de transporte relacionados.
Protocol
Cepas de moscas pode ser comprado e amplificado no laboratório. Dependendo da quantidade de frascos de cultura de Drosophila recebidos, uma necessidade de frequência 'flip' os frascos de cultura, uma vez que os frascos atingiu a capacidade máxima. A amplificação continua até cerca de 50 frascos de cultura de Drosophila estão cheios. Um, em seguida, faz "voar copos" com 100 ml tricorn copos (Fly tomada copo é discutida na próxima seção). Após 24 horas, utilizar embriões a partir destes copos para semear novos frascos de cultura de Drosophila com alimentos mosca afixada na parte inferior. À temperatura ambiente, o tempo de crescimento para os embriões de Drosophila a partir de embriões completos durante a noite para moscas crescidas são cerca de 8,5 dias. Embriões semeados eclodem após 12-15 horas para o estágio de larva em primeiro lugar. As larvas crescer durante cerca de 4 dias a muda duas vezes para a fase de larvas de segundo e terceiro, aos 24 e 48 horas após a eclosão. As larvas então encapsular em pupariums e se submeter a uma metamorfose 4 dias até surgir a partir de tcasos herdeiro pupa 1. Permitir uma maior crescimento durante cerca de 2-3 dias nos frascos de cultura de Drosophila para aumentar a quantidade de moscas em cada um. Quando 400 frascos são preenchidos, haverá uma quantidade suficiente de moscas por cinqüenta copos de ovos poedeiras (Cerca de 1.000 moscas fêmeas por xícara). Moscas precisam de tempo para ajustar ao seu novo ambiente. Geralmente, leva cerca de dois dias para eles para estar pronto para a coleta, depois de ser transferido para os copos. Substituição de placas de ágar diária vai manter os copos limpos da mosca, que permitem que as moscas a viver mais tempo. (Para uma maior compreensão de Drosophila cuidado e amplificação, consulte a Drosophila DB Roberts: Uma Abordagem Prática 2).
Uma boa fonte para obter grandes quantidades de embriões de Drosophila são gaiolas população 3, que são comercialmente disponíveis. A montagem e manutenção de gaiolas população pode ser visto no capítulo 5 e 7 do livro de Drosophila melanogaster: PUsos ractical na célula e 4 de Biologia Molecular. No entanto, as gaiolas da população são caros e são difíceis de manter. Uma vez que as gaiolas população pode conter uma quantidade abundante de moscas, o uso de dióxido de carbono é necessário para a transferência e de alimentação moscas. Como indicado antes, o dióxido de carbono diminui a saúde das moscas, fazendo com que eles não estabelecer também. Em pequena escala, copos de 100 ml tricorn pode ser usado. Com cinquenta 100 ml provetas, 9 gramas de embriões dechorionated pode ser alcançada. A fim remover as moscas mortas, pasta de levedura utilizada e outras impurezas que criamos um apanhador de peneira dupla camada com diferentes tamanhos de malha. Uma peneira armadilhas materiais indesejados, como moscas mortas enquanto permite a passagem de embriões (350 tamanho dos poros micron). A segunda parte contém uma malha (120 tamanho de poro microns), que se destina a pegar embriões de Drosophila e outras impurezas passarão através da malha.
1. Fly Preparação Cup e colheita de embriões
- Sacudiras moscas amplificadas a partir de frascos múltiplos em um frasco de plástico vazio, até que a quantidade de moscas ter atingido uma polegada de altura do frasco. Em seguida, transfira essas moscas em um ovo de 100 ml coleção xícara (Tricon copo com nylon de malha janelas). Continue a tocar o copo sobre uma superfície dura para impedir a fuga de moscas durante a transferência de moscas. Cubra copo com agar de levedura de pasta placa contendo e permitir 24-48 horas de tempo de estabilização.
- Collect placas de agar durante a noite a partir de cinquenta copos mosca e lavar os conteúdos das placas para o apanhador crivo usando um pincel de tinta limpo e água corrente. Carne dos embriões na peneira com água em abundância até que todo o fermento pasta é lavada.
- Dechorionate os embriões limpos por imersão em água sanitária 50% durante 3 min.
- Enxágüe com água destilada extensivamente até embriões soltos o odor lixívia. Em seguida, seque a malha com embriões, colocando-o em tempos de toalha ac vezes múltiplos. Transferir os embriões para um frasco limpo e registar o peso. </ Li>
2. Homogeneização embrião e Esclarecimento
- Coloque embriões dechorionated em Dounce homogeneizador com 1,5 x volume de tampão gelado de extracção.
- Faça 5 cursos com o pilão solto. Alíquota o homogeneizado em tubos de centrífuga limpo. Centrifugar a 15.000 g durante 40 min. a 4 ° C.
- Cuidadosamente recolher o líquido claro sobrenadante sem a camada lipídica superior branco ou a pelete inferior.
- Transferir o sobrenadante para limpar tubos de centrífuga e centrifugar a 50.000 g durante 30 min. a 4 ° C
- Resultante sobrenadante de alta velocidade recolhido como explicado acima pode ser utilizada imediatamente ou podem ser encaixe congeladas e armazenadas a -80 ° C durante meses.
3. A polimerização dos microtúbulos e cinesina Binding
- Descongelar o sobrenadante de alta velocidade congelado até à temperatura ambiente. Para polimerizar microtúbulos, adicionar GTP (0,3 mM) e taxol (20 uM) e agitar suavemente à temperatura ambiente durante 20 min emum agitador rotativo.
- Para ligar cinesina, adicionar 2,5 mM ATP nonhydrolyzable analógico imidodiphosphate 5'-ciclase (AMPPNP), seguido por uma agitação de 10 min à temperatura ambiente em um agitador rotativo.
4. Sedimentação diferencial de microtúbulos e cinesina
- Sedimento através de uma almofada de igual volume de sacarose (sacarose a 20% e 10 uM de taxol em tampão de extracção) por centrifugação a 23.000 g (sw41ti rotor, TLS-55) durante 30 min. a 4 ° C.
- Lavar pelete por ressuspensão em 10% do volume original em homogenato de tampão de extracção contendo 10 mM de taxol e 75 mM de NaCl.
- Repita a sedimentação com uma outra almofada igual volume de sacarose como no passo 4.1.
- Re-suspende pelete de lavagem sal em tampão de extracção de 5% com 20 mM de taxol, 75 mM de NaCl, 10 mM de MgSO4, e 10 mM de ATP.
- Sedimento no 120.000 g (sw41ti rotor: 31.000 rpm, TLS-55: 42.000 rpm) durante 20 min a 4 ° C. Recolher o sobrenadante (cinesinafração).
- Realizar uma filtração centrífuga a 14.000 g durante 15 min a 4 ° C. Recuperar amostra concentrada e repetir filtração com um filtro novo como acima durante 30 minutos e recolher a amostra concentrada.
- Executar um ensaio de proteína para determinar a concentração. Resumidamente, variando as concentrações de uma proteína conhecida (albumina de soro bovino; BSA) foi misturada com um volume conhecido de reagente de Bradford e medido a densidade óptica no comprimento de onda 595nm. Em seguida, uma densidade óptica versus curva padrão de concentração foi estabelecida para calcular a concentração desconhecida de fracção purificada cinesina usando a densidade óptica da amostra medida sob condições similares às que as amostras de BSA padrão. A electroforese em gel, bem como western blotting foi também realizada utilizando uma quantidade conhecida do cinesina purificada.
- Fracção alíquota cinesina em pequenos volumes de concentração desejada e congelamento em azoto líquido encaixe para armazenar a -80 ° C.
Full-length cinesina funcional foi purificado a partir de embriões de Drosophila. A Figura 1 mostra o gel corado com prata mostra as diferentes fracções durante a purificação. Pista 1 é uma amostra do sobrenadante de alta velocidade após clarificação (passo 2.5), a pista 2 é uma amostra do sedimento após clarificação, pista 3 é uma amostra do sobrenadante após a sedimentação primeiro com almofada de sacarose (passo 4.1), pista 4 é uma amostra do sedimento após a sedimentação em primeiro lugar, pista 5 é uma amostra do sobrenadante após a sedimentação segundo (passo 4.3), a pista 6 é uma amostra do sedimento após a sedimentação segundo, pista 7 é uma amostra do sedimento de a sedimentação final (passo 4.5), pista 8 é a amostra cinesina purificado, pista 9 é a amostra cinesina filtrada, e pista 10 é o marcador. A banda concentrado na pista 8 e 9 em cerca de 115 kD é cinesina de cadeia pesada 1, o que é consistente com Figure 1, pista 8 do papel Saxton publicado em 1988 5. Figura 2 representa o c western blot da fracção purificada cinesina detectado utilizando o anticorpo de cadeia pesada cinesina. O anticorpo AKINO1-A não significativamente reagem de forma cruzada com outros membros da família cinesina 6. Note-se que apesar de o protocolo resulta em uma boa fonte de cinesina funcional, enquanto que a fracção é enriquecido para cinesina-1, existem contaminantes susceptíveis, incluindo potencialmente kinesinas outros e proteínas motoras outros. Nós removido de uma variedade de contaminantes menores por filtração. No que diz respeito a remoção outros motores que não pode ser feito por tamanho por si só, a purificação é semelhante ao que foi feito por outros para estudar cinesina 7, e acreditamos que a maioria do motor activa é cinesina-1, mas a purificação mais sofisticado permitiria remoção de contaminantes de motor potenciais, como foi feito por Cole et al 8 e Saxton et al. 9 A processabilidade de cinesina foi avaliada por ensaio in vitro única molécula de microtúbulos de ligação, como descrito em mais detalhe no livro por Scholey intitulado "Ensaio Motilidade para Motor Proteínas" 10. Resumidamente, esferas de poliestireno com um único motor activa foram postos em contacto com o microtúbulo, na presença de saturar (1 mm) de ATP. O motor ligado ao microtúbulo, e começou a andar de distância do centro da armadilha laser. Com um deslocamento de pré-definido do grânulo a partir do centro armadilha (100 nm) a potência do feixe de laser foi automaticamente desligado, permitindo que o motor para caminhar ao longo do MT sem carga. O filme mostra um diâmetro 500 nm talão com kinesin único andando MT. O comprimento do ecrã de vídeo corresponde a 20 microns. Figura 3 representa a distribuição medida de run-comprimentos individuais para todo o comprimento moléculas de Drosophila cinesina, purificada de acordo com o protocolo apresentado aqui. O exponentiai apto para a distribuição fornece o RunLength média de cinesina único 1,55 ± 0,1 mM e 1,28 ± 0,12 mM para a amostra filtrados e não filtrados, respectivamente.
A Figura 1 Prata gel corado das fracções purificadas:. Amostras de cada fracção foram executados num gel de 10%. 10 ug de proteína foi carregada em cada pista. Pista 1 é uma amostra do sobrenadante de alta velocidade após clarificação (passo 2.5), a pista 2 é uma amostra do sedimento após clarificação, pista 3 é uma amostra do sobrenadante após a sedimentação primeiro com almofada de sacarose (passo 4.1), pista 4 é uma amostra do sedimento após a sedimentação em primeiro lugar, pista 5 é uma amostra do sobrenadante após a sedimentação segundo (passo 4.3), a pista 6 é uma amostra do sedimento após a sedimentação segundo, pista 7 é uma amostra do sedimento de a sedimentação final (passo 4.5), pista 8 é a cinesina purificadoamostra, pista 9 é a cinesina filtrada usando um 100 kD de corte Amicon ultra-filtro de 0,5 ml centrífuga (Millipore, EUA). As setas azuis indicam as proteínas cujos valores foram reduzidos ea seta vermelha indica a concentração de cinesina devido à etapa de filtração centrífuga utilizada neste protocolo.
. Figura 2 purificada fracção KHC blotted contra o anti-anticorpo cinesina: purificada amostra cinesina foi submetido à eletroforese em gel e apagados (em membrana de nitrocelulose) contra o anticorpo primário AKINO1-A (1:1.000 em TBST) durante 1 hora à temperatura ambiente seguido de incubação em Donkey-anticorpo anti-coelho (1:10.000 em TBST) durante uma hora à temperatura ambiente. Um ECL kit (quimioluminescente) foi utilizado para detectar o sinal de cinesina mostrado acima.
Figura 3. Drosophila total: (A) e (B) RunLength e Velocidade de amostra kinesin filtrada. (C) e (D) RunLength e velocidade de amostra cinesina não filtrada.
Figura 4. Vídeo da motilidade cinesina. Clique aqui para ver o vídeo .
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Discussion
Cérebro de bovino é o material mais amplamente utilizado de partida 11 para purificar full-length cinesina, embora cérebro de murídeo tem sido utilizado como bem 12. Uma grande desvantagem da utilização de cérebro de bovino como fonte de cinesina é a disponibilidade de material de partida fresco: matadouros são tipicamente inacessível, eo cérebro deve ser extremamente fresco, a fim de obter cinesina activo. Além disso, apenas os cérebros de vacas jovens são eficazes. Finalmente, a manipulação genética de vacas de momento não é uma opção viável, portanto, apenas "tipo selvagem" proteína pode ser estudada.
Os ratos são mais acessíveis, mas a colheita cérebro murino está consumindo um pouco difícil e demorado como a purificação pode exigir mais de 50 cérebros. Além disso, a manutenção de uma colônia do mouse pode ser muito caro.
Em contraste com as fontes de bovino ou de murino, Drosophila tem um número de vantagens. Em primeiro lugar, as moscas pode facilmente ser cultivadas em laboratório com mínimo de capital para foraleigos, e são, portanto, facilmente acessível. Drosophila leigos embriões prolíficos, que são facilmente colhidas conforme descrito aqui. Porque o genoma de Drosophila pode ser manipulado, e na verdade muitas moscas mutantes são facilmente obtidos, ambas as proteínas do tipo selvagem e mutante pode ser purificado, e devido à combinação de manipulações genéticas e um vão de geração curto, mais mutantes podem ser isolados. No entanto, deve notar-se que, devido a perda completa da função cinesina é letal, e de proteína nos embriões é fornecido predominantemente maternalmente, não é possível purificar os mutantes cinesina puros que são dramaticamente prejudicada. No entanto, é possível purificar a proteína a partir de embriões heterozigotas (kin-mut / +), e caracterizar a função da população mista e, em seguida, potencialmente, tais mudanças em função de fenótipos no animal.
Alteração ou deficiência de transporte parece estar por trás de muitas doenças neurodegenerativas, no entanto, o link mecanicistaentre a doença e alteração da função de uma única molécula de (devido quer a mutações ou um ambiente de sinalização alterada) não é clara. O ensaio de purificação de proteínas aqui desenvolvido deverá ser uma ferramenta importante para concretizar este compreensão, porque molécula única ensaios podem ser utilizados para determinar a motores 'função. Ao combinar esses estudos com a caracterização de fenótipos vivo, e auxiliado por modelagem, isto permite a determinação direta da relação entre alterando específicas individuais e propriedades moleculares da doença de desenvolvimento / progressão (como exemplo, veja o link entre a função dineína alteradas molécula única e transporte neuronal prejudicada, em 13).
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Agradecimentos especiais a Kris Ngai e Jason Del Rio, pelo apoio e ajuda neste projeto. Este trabalho foi apoiado por RO1 concessão GM070676 para SPG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Petri Dishes | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5’-adenylyl imidodiphosphate | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | EMD Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H. Kinesin Family in Murine Nerwous System. The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
