Summary
이것은에서 활성 전체 길이 Kinesin를 분리하는 프로토콜입니다
Abstract
모터 단백질은 microtubules 따라 cargos를 이동하고, 구체적인 하위 세포 위치로 그들을 수송. 변경된 전송이 미세 소관 기반 모터 수송 및 그 규정을 이해하고, neurodegenerative 질병의 다양한 기초하도록 권장되기 때문에 가능성이 궁극적으로 향상된 치료 접근법으로 이어질 것입니다. Kinesin-1은 ATP의 가수 분해에 의해 구동 microtubules (MTS)를 따라 anterograde (플러스 엔드) 방향으로 이동 진핵세포 모터 단백질이다. 여기에서 우리는 따라서 단일 분자 biophysical 연구와 Drosophila 유전자의 조합을 허용, Drosophila의 배아에서 활성 전체 길이 kinesin를 분리하기위한 세부적인 정화 프로토콜을보고합니다. 잔 당 약 1000 여성과 함께 약 50 누워있는 컵 것부터 시작해서, 우리는 밤새 컬렉션을 수행. 이것은 포장 배아들 중 약 10 ML을 제공했습니다. 배아는 (배아의 약 9g을하였으며) dechorionated 표백했다, 그리고 균질. AFter 장애는 homogenate는 고속 원심 분리에 의해 다음 저속 회전을 사용하여 명확히했다. 명확히 뜨는는 MTS를 중합하기 위해 GTP와 taxol로 치료되었다. Kinesin는 ATP 아날로그, 상온에서 5'-adenylyl imidodiphosphate을 추가하여 polymerized MTS에 고정화되었다. kinesin 구속력 후 microtubules은 자당 쿠션을 통해 고속 원심 분리를 통해 sedimented되었다. 미세 소관 펠렛 그런 다음 다시 중지되고,이 과정이 반복되었다. 마지막으로 ATP는 MTS에서 kinesin을 출시하도록 추가되었습니다. 고속 원심 분리 후 뜨는에서 kinesin두고, MTS를 불러 냈어요. 이 kinesin이 더 정화를 위해 필터 100 KD 인하를 이용하여 원심 여과를 받게되었다 aliquoted, 액체 질소에 냉동 및 -80 ° C.에 저장된 스냅 모래 바닥 SDS 겔 전기 영동과 서양은 정화 샘플을 사용하여 수행되었다. 최종 원심 여과 단계 전후 정화 샘플 모터 활동체외 단일 분자 미세 소관 분석에 사용하여 평가되었다. 이전 문헌에 보고된대로 원심 여과 전후 kinesin의 분수는 processivity을 보여주었다. 또한 실험 kinesin 및 기타 운송 관련 단백질 간의 상호 작용을 평가할 진행되고 있습니다.
Protocol
파리의 변종이 구입하여 실험실에서 증폭하실 수 있습니다. 받은 Drosophila 문화 튜브의 크기에 따라 하나는 자주 일단 튜브가 최대 용량에 도달했습니다, 문화 튜브를 '뒤집기'해야합니다. 약 50 Drosophila 문화 튜브가 채워진까지 확대가 계속됩니다. 한 후 (컵 만들기 들아 다음 섹션에서 논의된다) 100 ML tricorn 비커로 '컵 비행을'있습니다. 24 시간 이내에, 아래쪽에 부착된 플라이 음식이 컵에서 종자 새로운 Drosophila 문화 유리병에 배아를 사용합니다. 실온에서 하룻밤 배아에서 전체 재배 파리에 Drosophila의 배아의 성장 시간은 약 8.5 일 수 있습니다. 씨앗을 품고 배아는 첫 번째 애벌레 단계로 12~15시간 후에 부화. 유충 약 4 일 부화 후 24 및 48 시간에, 두 번째 및 세 번째 애벌레 단계로 두 번 털갈이를 위해 성장. 애벌레 다음 pupariums로 캡슐과 T에서 신흥까지 4 일간의 변형에 제출후계자 pupal 가지 경우 1. 각 파리의 양을 증가 Drosophila 문화 유리병에 세 할 약 일간 더 성장하실 수 있습니다. 400 튜브가 채워진 경우, 50 달걀 누워 컵 (잔 당 약 1,000여 파리)에 대한 파리 충분한 양의있을 것입니다. 파리들은 새로운 환경에 적응하는데 시간이 필요합니다. 그것은 보통 종이컵에 전송 후, 컬렉션에 대한 준비를 그들을 위해 이틀 정도 걸립니다. 일일 한천 번호판을 교체하는 것은 파리가 더 오래 살 수있는 파리 컵 깨끗하게 유지됩니다. (Drosophila 관리 및 증폭에 대한 이해를 들면, DB 로버츠 'Drosophila를 참조하십시오 : 실용 접근법 2).
Drosophila의 배아의 대량 취득하는 좋은 소스가 상업적으로 사용할 수있는 인구 케이지 3입니다. 인구 케이지의 조립 및 유지 보수는 책에 Drosophila Melanogaster에 제 5 장 및 7에서 볼 수 : P세포 및 분자 생물학 4 ractical 용도. 그러나 인구 연습장은 비싼이며 유지 관리가 어렵다. 인구 케이지는 파리의 풍부한 양을 저장할 수 있기 때문에 이산화탄소의 사용은 파리를 전송하고 먹이가 필요합니다. 전에 언급한 바와 같이, 이산화탄소뿐만 누워 말라고의 원인, 파리의 건강을 감소시킵니다. 작은 규모에, 100 ML tricorn의 비커를 사용할 수 있습니다. 쉰 100 ML의 비커로 dechorionated 배아의 9g을 획득 수 있습니다. 위해서는 우리가 서로 다른 메쉬 크기로 이중 계층 체의 포수를 만들었 죽은 파리, 미사용 효모 붙여넣기 및 기타 불순물을 제거합니다. 죽은 파리와 같은 하나의 체 트랩 원하지 않는 자료 배아는 (350 마이크론 기공 크기)를 통과하도록 허용하는 동시에. 두번째 부분은 메쉬 통과하게된다 Drosophila의 배아 및 기타 불순물을 잡는 의미 메쉬 (120 미크론의 기공 크기)를 포함합니다.
1. 컵 준비 및 배아 컬렉션 들아
- 뒤집기빈 플라스틱 약병을 여러 개의 튜브에서 증폭 파리가까지 파리의 양은 유리병의 높이 1 인치에 도달했습니다. 다음 100 ML 계란 컬렉션 컵 (나일론 메쉬 창문 tricon의 비커)에 그 파리를 전송합니다. 파리를 전송할 때 파리의 탈출을 방지하기 위해 하드 표면에 잔을 도청 유지. 한천 플레이트가 들어있는 효모 페이스트와 컵 커버 및 안정화 시간은 24-48 시간을 허용합니다.
- 쉰 플라이 컵에서 하룻밤 한천 플레이트를 수집하고 깨끗한 페인트 브러시 및 실행 물을 사용하여 체의 포수로 접시의 내용을 씻는다. 육체는 모든 효모 페이스트는 물이 가득한 체의 배아를 씻겨 때까지.
- 3 분 동안 50 %의 표백제에 그들을 immersing하여 청소 배아를 Dechorionate.
- 배아 표백제 냄새 느슨한까지 광범위하게 증류수로 씻어. 그런 다음 AC 접이식 수건으로 여러 번 그것을 배치하여 배아와 메쉬를 건조시키십시오. 깨끗한 유리병에 배아를 전송하고 체중을 기록합니다. </ 리>
2. 배아 균질화 및 명시
- 얼음처럼 차가운 추출 버퍼의 1.5 X 볼륨으로 다운스 호모 지 나이저에 dechorionated 배아를 놓습니다.
- 느슨한 유봉과 함께 5 스트로크를 해. 깨끗한 원심 분리기 튜브로 나누어지는 homogenate합니다. 40 분 동안 15,000g에서 원심 분리기. 4에 ° C.
- 위쪽 흰색 지질 층 또는 낮은 펠렛없이 맑은 뜨는 액체를 조심스럽게를 수집합니다.
- 원심 분리기 튜브를 청소하고 30 분 동안 50,000g에서 원심 분리기에 뜨는 전송합니다. 4에 ° C
- 위에서 설명했던 것과 같이 수집된 결과 고속 뜨는 즉시 사용할 수 또는 개월간 냉동 및 -80 ° C에 저장된 스냅이 될 수 있습니다.
3. 미세 소관의 중합 및 Kinesin 바인딩
- 실내 온도에 냉동 고속 뜨는을 녹여. , microtubules을 중합 GTP (0.3 ㎜)와 taxol (20 μm의) 추가하고 20 분 동안 실온에서 부드럽게 선동하려면회전 흔드는.
- kinesin을 바인딩하려면 회전 통에 상온에서 10 분 교반 다음에 2.5 밀리미터 nonhydrolyzable ATP 아날로그 5'-adenylyl imidodiphosphate (AMPPNP)를 추가합니다.
4. Microtubules 및 Kinesin의 차동 침강
- 30 분 대한 2만3천그램 (sw41ti 로터, TLS-55)에서 원심 분리하여 동일한 볼륨 자당 쿠션 (추출 버퍼에 20 % 자당 및 10 μm의 제품 taxol)를 통해 침전물. 4에 ° C.
- 10 μm의 제품 taxol 75 MM NaCl을 포함한 추출 버퍼에 원래 homogenate 볼륨의 10 %에 resuspension하여 펠렛 씻으십시오.
- 단계 4.1에서와 같이 다른 동등한 볼륨 자당 쿠션과 침강을 반복합니다.
- 20 μm의 taxol, 75 MM NaCl, 10 MM MgSO 4, 및 10 밀리미터 ATP로 5 % 추출 버퍼에 소금 세차에서 펠릿를 다시 일시 중지합니다.
- 4에 20 분 대한 ° C. 120,000그램 (42,000 RPM : 31,000 RPM, TLS-55 sw41ti 로터)의 침전물 뜨는을 (kinesin 수집분수).
- 4 15 분 14,000그램에서 원심 여과 ° C를 수행 농축 샘플을 복구하고 30 분 이상 같은 새 필터로 여과를 반복하여 농축 샘플을 수집합니다.
- 농도를 결정하는 단백질 분석을 수행합니다. 간단히, 알려진 단백질의 농도를 변화시키는 것은 (소 혈청 알부민, BSA) 브래드 포드 시약의 알려진 볼륨과 혼합하고 파장 595nm에서 광학 밀도를 측정했습니다. 그렇다면 광학 밀도 대 농도 표준 곡선은 표준 BSA 샘플 있으므로 유사한 조건 하에서 측정이 샘플의 광학 밀도를 사용하여 kinesin 분획을 정제의 미지의 농도를 계산하기 위해 설립되었습니다. 젤 전기 영동은 물론 서양의 모래 바닥도 정화 kinesin의 알려진 금액을 사용하여 수행되었다.
- 액체 질소에서 원하는 농도와 스냅 동결 작은 볼륨으로 나누어지는의 kinesin 분율은 -80에 저장합니다 ° C.
전체 길이 기능성 Kinesin은 Drosophila의 배아에서 정화되었다. 그림 1은 정화하는 동안 다른 분수를 보여주는 실버 스테인드 젤 모습. 레인 1은 명확 후 고속 뜨는 (단계 2.5)의 예제이고, 차선 2 명확 후 펠렛의 표본이며, 레인 3 자당 쿠션있는 최초의 침강 (단계 4.1) 이후 차선 4 뜨는의 샘플입니다 펠렛의 예제는 첫 번째 침강 후 차선 5 번째 침강 (단계 4.3) 이후에 뜨는의 예제입니다, 차선 6 번째 침강 후 펠렛의 표본이며, 레인 7의 펠렛의 견본입니다 최종 침전 (4.5 단계), 차선 8 정화 kinesin 샘플이며, 레인 9 필터링된 kinesin 샘플이며, 레인 10 마커입니다. 115 주위 KD에서 레인 8 9 농축 밴드 Figur과 일치 kinesin 무거운 체인 1입니다E 1, 1988 5 게시된 Saxton 용지의 레인 8. 그림 2는 정화 kinesin 분율의 C 서양 얼룩을 나타내는가 kinesin 중쇄 항체를 사용하여 감지. 항체 AKINO1 - 크게 다른 kinesin의 가족 6 교차 반응하지 않습니다. 참고이기는하지만 분수는 kinesin-1에 대한 풍부한하는 동안 잠재적으로 다른 kinesins 및 기타 모터 단백질을 포함 가능성이 오염 있는데, 기능성 kinesin의 좋은 원천이 프로토콜은 결과를. 우리는 여과하여 작은 오염 물질의 종류를 제거했습니다. 멀리 혼자의 크기로 할 수없는 다른 모터를 제거로 정화는 kinesin 7을 공부하고 다른 사람에 의해 수행하고 있었는지와 유사한, 우리는 적극적으로 모터의 대부분 Kinesin-1입니다 있다고 생각하지만,보다 정교한 정화가 허용됩니다 같은 잠재적인 모터 오염 물질의 제거는 콜 외 8 Saxton 외 의해 수행되었다 9. kinesin의 processivity가로 "모터 단백질에 대한 운동성 분석"10 자격 Scholey하여 책에 자세히 설명되어 체외 단일 분자 미세 소관 결합 분석에 의해 평가되었다. 간단히, 단일 활성 모터 폴리스티렌 구슬은 포화의 존재 (1 ㎜) ATP에 미세 소관과 접촉 반입되었다. 모터 미세 소관에 붙어 있으며 레이저 트랩의 중심 꿈쩍도 시작했다. 트랩 센터 (100 nm의)에서 구슬의 사전 정의된 변위에서 레이저 빔을 전원이 자동으로 모터가 부하없이 MT를 따라 걸을 수 있도록 해제되었다. 영화는 MT를 따라 도보로 하나의 kinesin과 구슬 500 nm의 직경을 보여줍니다. 비디오 화면의 길이는 20 μm의에 해당합니다. 그림 3은 여기에 제시된 프로토콜에 따라 정화, 하나의 장편 Drosophila kinesin 분자에 대한 런타임 길이의 측정 분포를 나타냅니다. exponenti알이 배포에 맞게하는 것은 하나의 kinesin 1.55의 평균 runlength ± 0.1 μm의 및 1.28 ± 필터링 및 필터없는 샘플을위한 0.12 μm의 각각을 제공합니다.
그림 1은 정화 분수의 실버 스테인드 겔 :. 샘플 각 분획으로부터는 10 % 젤에서 실행되었다. 단백질 10 μg은 각 차선에로드되었습니다. 레인 1은 명확 후 고속 뜨는 (단계 2.5)의 예제이고, 차선 2 명확 후 펠렛의 표본이며, 레인 3 자당 쿠션있는 최초의 침강 (단계 4.1) 이후 차선 4 뜨는의 샘플입니다 펠렛의 예제는 첫 번째 침강 후 차선 5 번째 침강 (단계 4.3) 이후에 뜨는의 예제입니다, 차선 6 번째 침강 후 펠렛의 표본이며, 레인 7의 펠렛의 견본입니다 최종 침전 (4.5 단계), 차선 8 정화 kinesin이다샘플 레인 9 100 KD 컷 - 오프 Amicon 울트라 0.5 ML 원심 필터 (Millipore, 미국)를 사용하여 필터링 kinesin이다. 파란 화살표가 누구 금액 감소와 빨간색 화살표가이 프로토콜에 사용되는 원심 여과 단계로 인해 kinesin의 농도를 표시했습니다 단백질을 나타냅니다.
. 그림 2 정화 KHC 분율는 안티 kinesin 항체에 대해 blotted : 정화 kinesin 샘플 AKINO1가 - 1 시간 정도합니다 (TBST에 1:1,000) 상온에서 부화 다음 겔 전기 영동에 노출 및 기본 항체에 대해 (nitrocellulose 막에서) blotted되었습니다 상온에서 시간 동안의 돈키 - 안티 - 토끼 항체 (TBST에서 1:10,000). ECL (chemiluminescent) 키트는 위의 그림 kinesin 신호를 감지하는 데 사용되었다.
그림 3. Drosophila 전체 길이 kinesin의> Runlength과 속도 ()와 (B) 필터링 kinesin 샘플의 Runlength과 속도. (C)와 (D) 필터없는 kinesin 샘플의 Runlength과 속도.
그림 4. Kinesin의 운동성의 비디오. 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
murine 두뇌는 물론 12 사용되고 있지만 소의 머리, 전신 kinesin을 정화하기 위해 가장 널리 사용되는 출발 물질 11. kinesin 원본으로 소 두뇌를 사용하는 큰 단점은 신선한 시작하는 자료를 사용할 수있다 : slaughterhouses은 일반적으로 액세스할 수 있으며, 두뇌 활성 kinesin를 얻기 위해 매우 신선해야합니다. 또한, 젊은 암소만을 두뇌가 효과적입니다. 마지막으로, 암소의 유전자 조작은 현재 실행 가능한 옵션이되지 않으므로 전용 '야생 타입'단백질은 공부를 할 수 있습니다.
마우스가 더 접근하지만, murine 두뇌를 수확하는 것은 정화가 50 개 이상 머리를 요구할 수 있으므로 다소 어렵고 시간이 소요됩니다. 또한, 마우스 식민지를 유지하는 것은 매우 비쌉니다.
소의 또는 Murine 소스와는 달리, Drosophila는 장점을 가지고 있습니다. 첫째, 파리는 쉽게 나올 최소한의 자본으로 실험실에서 재배하실 수 있습니다누워서, 그래서 쉽게 이동할 수 있습니다. Drosophila 여기에서 설명하는 것처럼 쉽게 수확하고 다작 배아를 누워있다. Drosophila 게놈을 조작 할 수 있으며, 실제로 많은 돌연변이 파리가 쉽게 획득되기 때문에 모두 야생 유형과 돌연변이 단백질은 투석 수 있으며 인해 유전자 조작과 짧은 세대 기간의 조합으로, 더 많은 돌연변이 격리 수 있습니다. 그러나, 그것은 kinesin 기능의 완전한 상실은 치명적이며, 배아의 단백질은 그것이 극적으로 장애인하고 순수 kinesin의 돌연변이를 정화하는 것은 불가능, maternally 주로 제공하고 있기 때문에, 것을인지해야합니다. 그럼에도 불구하고, 그것은 heterozygous 배아 (친척-mut / +)에서 단백질을 정화하고, 혼합 인구의 기능을 특성화하는 것이 가능하고 잠재적으로 동물의 phenotypes에 함수에서 그러한 변화를 즐거웠다.
교통 변경이나 손상은 많은 neurodegenerative 질병 기초가 보인다 있지만, 기계론의 링크단일 분자 기능 (인해 두 변이 또는 변경된 신호 환경)의 질환과 변조 사이 불확실하다. 단일 분자 assays가 모터 '기능을 결정하는 데 사용할 수 있기 때문에 현재 개발된 단백질 정제 분석,이 이해를 추구하는 데 중요한 도구가 있어야합니다. phenotypes의 생체내 특성에서와 같은 연구를 결합하고, 모델링하여 주었으로 이것은 변경 특정 단일 분자 특성과 질병 개발 / 진행 (관계의 직접적인 결정을 허용 예로, 변경된 단일 분자 dynein 기능과 사이의 링크를 참조하십시오 장애인의 연결 교통, 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
크리스 Ngai이 프로젝트들의 지원과 도움 제이슨 델 리오에 대한 특별 감사합니다. 이 작품은 RO1 SPG에 부여 GM070676에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Petri Dishes | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5’-adenylyl imidodiphosphate | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | EMD Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H. Kinesin Family in Murine Nerwous System. The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
