Summary
Кальмодулин (CAM) выпадающее анализ является эффективным способом для исследования взаимодействия СаМ с различными белками. Этот метод использует CAM-сефарозе шарики для эффективного и конкретного анализа CAM-связывающих белков. Это является важным инструментом для изучения СаМ сигнализации в функционирование клетки.
Protocol
См. на рисунке 1 представлена основная схема процедуры, начиная с гомогената. Расчетное время от подготовки клеточные экстракты для вымывания CAM-связанных белков составляет около шести-семи часов.
1. Ткань подготовки
- Inject органотипической срезах гиппокампа с вирусом, содержащим плазмиду выражения рекомбинантный белок (в данном примере, зеленый флуоресцентный белок (GFP), помеченные Ng) и позволяют ткани, чтобы выразить белка в одночасье.
- Приблизительно от 12 до 18 часов после вирусной инъекции (в зависимости от вирусного время выражение), подготовить для сбора ткани. Добавить 1 мл буфера рассечение (10 мМ глюкозы, 4мм KCl, 26 мм NaHCO3, 233mM сахарозы, 5 мМ MgCl 2, 1 мМ CaCl 2 и 0,1% фенол-красный, газовые камеры с 5% CO 2 95% O 2) в чашке Петри. Передача культурной ткани / вставить в чашку Петри и добавляют 2 мл буфера для вскрытия вставить, чтобы погрузиться ткани.
- Сборт органотипической гиппокампа ткани (от 5 до 10 ломтиков), аккуратно очищая ткани без вставки мембраны с помощью скальпеля. В частности удаления конкретном регионе интерес (например, СА1) тоже вариант. Передача приостановлено ткани 1,5 мл трубки микроцентрифужных использованием перевернутой пипетки Пастера.
- Центрифуга образцов при 1500 RCF в течение 1 мин отделить ткани от вскрытия буфера. Осторожно удалите супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не потревожить осадок.
- Для каждого среза используется, добавить от 30 до 60 мкл гомогенизации буфера (150 мМ NaCl, 20 мМ Трис рН 7,5, 1 мМ DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL антиболевой, 1μg/mL пепстатина, и 1% Тритон Х -100), чтобы ткани и гомогенизации полностью с пестиком.
- Для того, чтобы удалить продукты распада клеток, центрифуга оставшегося гомогената при 1100 RCF в течение 10 мин и осторожно удалите супернатант аспирацией, избегая при этом загрязнения из гранул.
- Возьмите 10% супернатант в качестве образца на входе (образец 1). Магазин оставшиеся супернатант на льду во время подготовки CAM-сефарозе шарики для использования в шаге 3.
Примечание: ткани, используемые здесь, органотипической срезах гиппокампа. Тем не менее, можно использовать диссоциированных нейронов или любой другой системы культивирования клеток. В таком случае, начнем с пункта 1.4 после сбора вашей ткани в соответствующей манере.
2. Подготовка шарики для выпадающем
При работе с бисером, очень важно, чтобы спасти бисером и максимизировать эффективность реакции, предотвращая бусы из сушки по бокам трубки. Чтобы это сделать, то лучше, чтобы повернуть трубы на их стороне, что позволяет решению на влажные бусины на стенках трубки, непосредственно перед центрифугированием.
- Для каждого выпадающего, пипетки 400 мкл взвешенных кальмодулин-сефарозой бусины в 2 мл микроцентрифужных трубка с относительно FLAт-снизу максимально площадь поверхности и взаимодействие своих решений с бисером во время инкубации.
- Центрифуга бус на 21000 RCF в течение 30 секунд и осторожно удалите супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не потревожить бисером.
- Для мытья бисером, добавить 100 мкл соответствующего буфера гомогенизации, содержащие либо 2 мМ CaCl 2 для тех, которые используются для выпадающем Ca 2 +-СаМ связывающих белков и 2 мМ ЭДТА (известный Са 2 + хелат) для бисера снос ApoCaM связывающих белков. Слегка нажмите на трубке повторно приостанавливать бисером и центрифуге при 1500 RCF в течение 1 мин. Осторожно удалите супернатант аспирацией, убедившись, что не нарушить бисером.
Примечание: Для всех шагов стремление, то рекомендуется использовать пипетки, которая прекрасно открытия (например, советы гель загрузки), чтобы разрешить удаление решение, не снимая бусы.
3. CAM-сефарозе связывания белков
- Разделите на два супернатант условиях, содержащих равный объем. В зависимости от вашего состояния, добавить соответствующее количество CaCl 2 или ЭДТА к надосадочной до 2 мм концентрации для каждого.
- Добавить супернатант, начиная с шага 1,7 до бисер промывали в соответствующие буфера гомогенизации. Слегка нажмите на трубке, чтобы смешаться.
- Инкубируйте образцы при температуре 4 ° С в течение 3 часов на шейкере. Повторное приостановить бисером каждые 30 минут или около того, чтобы повысить эффективность связывания.
- Одноразовая пробирка с образцами и бусы в 1500 RCF в течение 3 мин.
- Возьмите 50 мкл надосадочной в качестве образца несвязанных белков (образец 2) и осторожно удалите оставшиеся супернатант аспирацией и выбросьте.
- Вымойте бусин в три раза, как описано в пункте 2.3 с 100 мкл соответствующего буфера гомогенизации.
4. Элюирование
- Добавить 50 мкл элюирующего буфера (50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, и 150 мМ NaCl), содержащий противоположные условия (10 мМ CACL 2 или 10 мМ ЭДТА) на бусы. Например, образцы, которые были связаны гомогенизируют и в буфере, содержащем Ca 2 + вымываются в элюции буфера, содержащего ЭДТА и наоборот.
Дополнительно: Потепление элюции буфера до 37 ° С перед добавлением бисера может повысить урожайность.
- Инкубируйте решение бисером при комнатной температуре в течение 30 минут на шейкере. Смешайте бисер аккуратным постукиванием трубки примерно каждые 5 мин.
- Центрифуга бус на 1500 RCF в течение 3 мин и осторожно удалите 50 мкл надосадочной для связанного белка (образец 3) стремлением. Убедитесь в том, чтобы не потревожить бисером.
- Добавить буфера белка загрузки всех образцов (т.е. гомогената, несвязанных и связанных белков, а также тех, кто еще связан с бисером).
Примечание: Для обеспечения максимальной элюирования (особенно в случае неэффективного элюирования), добавить 50 мкл соответствующего буфера элюирования (например, добавление ЭДТА содержащих буферефер, чтобы бусины связаны в CaCl 2), чтобы бисер перед нагреванием образцов, чтобы помочь элюировать оставшиеся белком и повторить шаги, описанные в 4.3, чтобы удалить остатки связанных белков.
5. SDS-PAGE и Вестерн-блот
Поведение SDS-PAGE и анализировать использование западных пятно с помощью зондирования для белок и зонд для белок, известный связывать СаМ в противоположном состоянии, положительного контроля.
6. Представитель Результаты
Рисунок 2B показывает пример CAM-выпадающем анализа тестирования обязательные веб-камера GFP с метками Ng по сравнению с эндогенным Ng. Чтобы сделать это, GFP-Нг был избыточно экспрессируется в нашей органотипической срезах гиппокампа в ночное время и ткани гомогенизировали. Гомогенат инкубировали с CAM-сефарозе бусины в присутствии либо Ca 2 + или ЭДТА. Гомогената вход показывает, что GFP-Ng была выражена в дополнение к эндогенным Нг и Са 2 + / CAM-зависимой киназы II(CaMKII). Как и ожидалось на основе известных связывание эндогенного Нг (показано на рис. 2A), GFP с метками Ng элюировали в отсутствие Са 2 + (ЭДТА связанного белка) и несвязанного в присутствии ионов Са 2 + (рис. 2В) . В отличие от контроля, CaMKII, элюировали только в присутствии ионов Са 2 + (белком) и несвязанных в его отсутствие (ЭДТА). Это показывает, что СаМ шарики функционирует нормально, и elutions были эффективными. Самое главное, это показывает, что GFP-Ng связывается с ApoCaM в аналогии с эндогенной форме, предполагая, что теги GFP не изменило функции нашего рекомбинантного белка.
Рисунок 1. Очерк СаМ выпадающего анализа
(А) гомогената ткани вращается вниз, чтобы удалить продукты распада клеток. Около 10% надосадочной взят как образец мощность (1). Остальные супернатант делится поровну на различныхусловий и соответствующих реагентов (CaCl 2 или ЭДТА) добавляются в тест обязательным в таких условиях. Каждый супернатант (содержащие либо CaCl 2 или ЭДТА) загружается на соответственно подготовленных CAM-сефарозе бисером и (Б) инкубировали чтобы обязательными. Свободные белки удаляются (2) и (C) связанных белков (3), элюировали из бисера использованием элюирующего буфера (EB), содержащий противоположное условие, как обязательные. Белкового состава этих трех образцов белка могут быть проанализированы с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блот анализа.
Рисунок 2. A.) Схема Ca 2 +-зависимый СаМ обязательными и элюирования в выпадающем Примеры анализа даны два типа белков, которые связываются камеры в Ca 2 +-зависимым образом. Neurogranin (Ng) представляет собой белки, которые связываются апо-CAM и CaMKII представляет белков, которые связываются с Са 2 +-богатыхCAM. СаМ показана в ее состоянием диссоциации до инкубации с гомогената белков. После инкубировали в условиях высоких Са 2 + концентраций (2 мм) или в присутствии Са 2 + хелатором, ЭДТА (2 мМ), белки связываются с СаМ соответственно. Ng связывает камеры в условиях ЭДТА как там практически нет Са 2 + подарок, и будет элюировали CAM-сефарозе бусин в присутствии ионов Са 2 +. CaMKII, однако, будет связываться с камеры в наличии большое количество Са 2 + и будет отделить один раз Са 2 + был хелатные.
Б) Результаты Например СаМ выпадающего анализа. Эта цифра демонстрирует ожидаемый конечный результат CAM-сефарозе тянуть вниз образцы исследовали на Нг и CaMKII. Оба эндогенных Нг и GFP-Ng присутствуют в полосы белки, которые связываются СаМ в присутствии ЭДТА. Нет Нг обязан, когда образцы инкубировали с камеры в присутствии ионов Са 2 +, демонстрируя, что Nг только связывает апо-CAM. Наш положительный контроль, CaMKII, с другой стороны, связывает СаМ только в присутствии ионов Са 2 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При условии, протокол использует CAM-сефарозе бусин для расследования Ca 2 +-зависимость CAM-связывающих белков. Многие белки связываются камеры в Ca 2 +-зависимым образом. Эти взаимодействия имеют большое значение, учитывая количество CAM-связывающих белков и их важную роль во многих сигнальных путей. В этом протоколе, CAM-сефарозе бусин используются для разделения CAM-связывающих белков из гомогената ткани в наличии или отсутствии Ca 2 +. Результаты этой простой подход будет способствовать пониманию того, как белки могут взаимодействовать с камеры в Ca 2 +-зависимым образом. Этот подход отличается от обычно используемых в технике связывания с белками исследований, колоночной хроматографии, в том, что CAM-сефарозе бисер в растворе, а не фиксируется в матрице.
Отказ от использования колонка является одним преимуществом такого подхода, потому что без колонки протокол является менее трудоемким, так как нет перед, чтобы уравновесить колонку или ждать тяжести проточные. Из-за силу своей эффективности, СаМ выпадающего требует значительно меньше ткани, чем колоночной хроматографии и упрощает пробоподготовки, как разделение распада клеток из образцов белка требуется только короткие центрифугирования для CAM-сефарозе выпадающее описано. Столбцы требуют белка образцы, которые без каких-либо продукты распада клеток, что может потребовать дополнительных стадий очистки. Этот подход также имеет преимущества перед другими выпадающее методы, такие как совместное иммунопреципитации, которая требует антител против белка приманку, чтобы захватить его и любое взаимодействующих белков в образце. Использование антител для захвата приманки белок может быть ограничение, как бедные взаимодействия между антителом и белком в ходе эксперимента может привести к неэффективному тянуть вниз. Эти потенциальные проблемы можно избежать с помощью описанных CAM-сефарозе выпадающее.
Однако, как исовместно иммунопреципитации и анализы колоночной хроматографии, CAM-сефарозе выпадающего ограничивается исключая виво CAM-обязательный характер. Полученные результаты могут не отражать действительность в естественных условиях взаимодействия CAM. Например, пост-трансляционной модификации часто воздействия белковых взаимодействий. Это тот случай, для neurogranin, взаимодействие которого с СаМ препятствует PKC-опосредованного фосфорилирования его IQ домена 5. Гомогенизация ткани могут изменить пост-трансляционной модификации, например, позволяя ферменты, такие как киназ и фосфатаз для доступа к целевой белков, которые, как правило, изолированы от ферментов в клетке. Нарушение локализации и / или дробление могло бы также позволить обязательными, когда два белка, как правило, не будет иметь возможность взаимодействовать в клетке. Чтобы минимизировать эти реакции, важно, чтобы хранить все образцы на льду между подготовкой и погрузки. Кроме того, по этой причине инкубации с бусинок донуэлектронная при 4 ° C. Фосфатазы ингибиторами или другими ингибиторами фермента также может быть добавлен к гомогенизации буферов, чтобы помочь ограничить их последствия.
Положительный контроль важен для этого эксперимента, чтобы убедиться, что никаких существенных ошибок в ходе эксперимента. Он может также гарантировать, что различия в условиях было достаточно, чтобы вызвать конформационные изменения в CAM, что позволяет связывать различные белки в присутствии и отсутствии Ca 2 +. Например, если нет сигнала для белок, это может быть связано с загрузкой ошибки или других возможных ошибок. Зондирование для другой белок, известный связывать в других условиях (например, в CaMKII примера, приведенного) может помочь в решении возможных ошибок. Низкий Ca 2 + или Са 2 + хелатором (например, ЭДТА) концентрациях может также столкнуться с ожидаемыми результатами. ЭДТА успешно используется, но и других Са 2 + энтеросорбенты (например EGTA) может быть более эффективным, если даже выше concentratионами являются неэффективными. Чрезмерное Cam-связывающий белок также может привести к неожиданным результатам, как это может насытить доступны CAM-сефарозе бисером, в результате чего элюции белка, когда она должна быть связана. Это видно на примере показано, как относительно небольшое количество GFP-Ng вымывается в состояние ЭДТА. Количественное белка до инкубации с бисером может помочь улучшить это.
Правильная подготовка и обработка CAM-сефарозе бусин в течение всего эксперимента также имеет важное значение для достижения успеха. Бисер может быть легко потеряны во время эксперимента, либо случайно удалены с надосадочной должны быть уничтожены или застряли на бокам и сверху трубкой 2,0 мл. Этого можно избежать, используя осторожность, удаляя супернатант и обеспечения тщательного перемешивания непосредственно перед центрифугированием. Старайтесь не давать образцы находятся между смешивания и центрифугирования, так как позволяет CAM-сефарозе бисером сушить по бокам трубки. В качестве меры предосторожности, ресуспендируют бисером и ротатэ раствора вокруг трубки на влажные бусины непосредственно перед центрифугированием. Тщательная погружения образцов с бисером, как во время связывания и элюции инкубации очень важно. Без соответствующей перемешивания образца с бисером, связывания и элюции, вероятно, будет неэффективным.
Этот протокол является универсальным и может быть легко изменены для других целей. Выполнение этого эксперимента с усеченными или мутировавших белков может раскрыть информацию о регионе (регионах) и остатки белков, которые важны для СаМ обязательными и Ca 2 +-зависимости, если наблюдается. В случае Нг, мы смогли показать, что GFP-Нг, как и эндогенный белок, связывает СаМ только в отсутствие ионов Са 2 + 8. Для дальнейшего изучения этой функции этой привязки, различные мутации этого белка изменяя его IQ-домена поможет понять характер взаимодействия Нг с СаМ, а также функцию пост-трансляционных модификаций, которые изменяют эту Интераction. Мы протестировали важность Ng-CAM обязательным использованием двух различных мутантов: phosphomimic аспартат вместо серина (S36D или Ng-SD) и IQ-менее Ng для предотвращения связывания с CAM. Мы также генерируются мутант (Ng-SFAW), который повысил обязательные СаМ, оставаясь связанным даже в присутствии ионов Са 2 +. Наконец, мы использовали не-phosphorylatable мутант (Ng-SA), который связывается с камеры в Ca 2 +-зависимый моды аналогичный эндогенному Нг, но предотвращает фосфорилирование от протеинкиназы С (ПКС). СаМ выпадающего анализа помогли проверить функциональность этих различных мутантов и помог показать важность Ng-CAM обязательными в синаптической функции 8 и как Ng фосфорилирования помогает точно настроить синаптической пластичности 15.
Кроме того, белки, которые связываются с CAM-связывающие белки могут быть элюировали. Это могло бы обеспечить дальнейшее применение этого анализа при определении белков, которые косвенно связывают CAM. Это позволяет изучение этих других взаимодействуютионов и других потенциальных вниз по течению от СаМ и его связывания партнеров.
Таким образом, СаМ выпадающего препарат обеспечивает эффективный и действенный путь для исследования Ca 2 +-зависимость CAM-белковых взаимодействий. Это может быть важным инструментом для изучения CAM-белковых взаимодействий и, как различные мутации или изменения могут повлиять на эти взаимодействия. Это может быть полезным в изучении регуляции Са 2 + / CAM сигнальных путей. Кроме того, мы можем использовать это для изучения патологии вызваны перебоями в Ca 2 + / CAM сигнализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Тиффани Вишня в ее помощи в оптимизации этого протокола. Эта работа финансировалась Национальным институтом старения (AG032320), а также продвижение здоровой Висконсин.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calmodulin-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0529-01 | |
| Anti-CamKII alpha | Sigma-Aldrich | C6974 | |
| Anti-neurogranin | EMD Millipore | 07-425 | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-138 | Use for aspiration of supernatants |
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-146 | Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads |
References
- Vincenzi, F. F. Calmodulin in the regulation of intracellular calcium. Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).
- Cheung, W. Y. Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation. Science. 207, 19-27 (1980).
- Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin. Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).
- Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein. J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).
- Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain. Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).
- Bahler, M., Rhoads, A. Calmodulin signaling via the IQ motif. FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).
- Routtenberg, A. Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth. Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).
- Needham, D. M. Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction. Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).
- Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).
- Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain. J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).
- Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).
- Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes. Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).
- Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides. Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
