Summary
钙调蛋白（CAM）下拉实验调查与各种蛋白质的CaM的相互作用的有效途径。此方法使用效率和具体分析CaM结合蛋白钙调素琼脂糖珠。这提供了一个重要的工具，探索细胞功能的CAM信号。
Abstract
钙（ 钙离子）离子通过多种机制调节细胞功能的重要。大部分的Ca 2 +信号是通过介导的钙结合蛋白称为钙调蛋白（CAM） 1,2。 CAM是涉及多层次的，在几乎所有的细胞过程，包括细胞凋亡，代谢，平滑肌收缩，突触可塑性，神经生长，炎症和免疫反应。的蛋白质，帮助调节与CAM的互动关系，通过这些途径。许多这些相互作用依赖于CaM的构象，这是明显不同的CA 2 +（的Ca 2 + - CAM）作为反对它的Ca 2 +自由状态（ApoCaM）3时，势必。
虽然大多数靶蛋白结合的Ca 2 + - CAM，某些蛋白质只能绑定到ApoCaM。有的通过他们的智商域绑定CAM，包括neuromodulin的NG（NG）5，4，和一定的肌球蛋白
这些蛋白质对细胞功能的影响往往依赖于自己的能力结合到CAM中的Ca 2 +依赖性。例如，我们测试的NG - CAM约束力的突触功能的相关性和不同的基因突变如何影响这个约束力。我们生成一个GFP标记的吴CON结构与特定的突变，在IQ域会改变伍CAM中的Ca 2 +依赖性的结合能力。这些不同的基因突变的研究给了我们很大的启示，为参与突触功能的8,15的重要进程。然而，在这些研究中，它是必不可少的证明突变的蛋白质有约束力凸轮预期改变。
在这里，我们目前为检测蛋白质的能力绑定到CAM的Ca 2 +的存在或缺乏，作为例子使用CaMKII和NG方法。这种方法是一种亲和层析的形式简称为CAM的下拉检测。它使用的CaM -琼脂糖珠测试蛋白质结合CAM与此绑定的Ca 2 +的影响。这是相当多的时间效率和需要较少的蛋白质相柱层析及其他实验。总之，这提供了一个宝贵的工具，以探索的Ca 2 + / CaM的信号和蛋白质，在teract与CAM。
Protocol
一个过程的开始与匀浆的基本原理，请参考图1。估计，从细胞中提取的准备钙调素结合蛋白洗脱的时间是6至7小时。
1。组织编制
- 注入病毒包含利益的重组蛋白（在这个例子中，绿色荧光蛋白（GFP）标记伍），并允许组织一夜之间表达蛋白表达质粒器官海马。
- 病毒注射后约12至18小时（取决于病毒表达时间），准备收集组织。加入1ml清扫缓冲区（10MM葡萄糖，4mm的氯化钾，碳酸氢钠26MM，233mM蔗糖，2 5毫米氯化镁，1毫米氯化钙2，和0.1％酚红，供气5％CO 2 95％，O 2的）培养皿。培养组织/插入转移到培养皿中，加入2ml夹层缓冲插入淹没组织。
- 收集吨器官海马组织（5至10片）轻轻刮组织免费使用手术刀插入膜。特别是消除利益的特定区域（如CA1区）也是一种选择。暂停组织转移到1.5ml离心管中，用一个倒置的巴斯德吸管。
- 1500 RCF 1分钟离心样品分开组织解剖缓冲区。小心取出上清液吸。确保不扰乱沉淀。
- 用于每个切片，加30至60μL同质化的缓冲区（氯化钠150MM，20MM三pH值7.5，1mm的数码地面电视，1μg/mL亮肽素，1μg/mLchemostatin，1μg/mLantipain，1μg/mL胃酶抑素及1％TRITON X -100）组织和同质化彻底与杵。
- 为了去除细胞碎片，离心10分钟在1100 RCF其余匀浆和吸小心取出上清液，同时避免颗粒污染。
- 以10％作为输入的样品（样品1）上清。储存期间准备在第3步使用凸轮琼脂糖珠上冰的剩余上清。
注：这里所用的组织器官的海马。然而，人们可以使用分离的神经元或任何其他的细胞培养系统。在这种情况下，以适当的方式收集您的组织后，开始在步骤1.4。
2。下拉珠的制备
在处理珠，重要的是要打捞珠的反应效率，最大限度地防止干燥管双方的珠。要做到这一点，最好是旋转你管，就在自己身边，让解决方案，以湿管的墙壁上的珠子，立即离心前。
- 对于每个上拉下来，加入400μL悬浮的钙调蛋白琼脂糖凝胶珠成2 ml离心管具有相对FLAT -底部，最大限度地在您的孵化珠您的解决方案的比表面积和互动。
- 30秒21,000 RCF离心珠，小心取出上清液吸。确保不打扰珠。
- 洗珠，添加100μL含有2个毫米氯化钙2正在使用下拉的Ca 2 + - CAM为珠蛋白和2毫米EDTA（已知的Ca 2 +螯合剂）拉低各自的同质化缓冲区ApoCaM约束力的蛋白质。 1500 RCF 1分钟，轻轻拍打管重悬珠和离心机。小心取出吸上清，确保不打扰珠。
注：对于所有的愿望步骤，建议使用吸头，拥有良好的开放（如凝胶加载提示）允许不拆除的解决方案，消除珠。
3。 CAM -琼脂糖结合的蛋白质
- 拆分成两个同等体积的条件下上清液。根据你的病情，添加适量的氯化钙或EDTA您上清2毫米为每个浓度。
- 从步骤1.7中添加的上清液洗净，在相应的同质化缓冲区的珠子。轻轻拍打管组合。
- 在4 ° C孵育3小时在摇床样品。重新暂停珠每30分钟左右，以增加有约束力的效率。
- 含3分钟1500 RCF离心管样品和珠子。
- 未结合的蛋白质样品（样品2）取上清液50μL，并仔细清除愿望和丢弃剩余的上清。
- 洗珠如在步骤2.3中使用各自的同质化液100μL中所述的三倍。
4。洗脱
- 加入50μL洗脱缓冲液（50毫米的Tris - HCl pH值为7.5，和150mm氯化钠）含有相反的条件（10MM彗星ACL 2或10mm EDTA）珠。例如，样品匀浆和约束缓冲含Ca 2 +被洗脱洗脱含有EDTA反之亦然的缓冲。
可选：升温洗脱缓冲至37 ° C之前加入珠，可提高产量。
- 孵育珠在室温下在摇床30分钟的解决方案。混合轻轻拍打约每5分钟管珠。
- 3分钟，在1500 RCF离心珠和愿望结合蛋白（样品3）小心取出上清液50μL。确保不打扰珠。
- 所有样品（即匀浆，束缚和结合蛋白，以及那些仍然绑定到珠）加入蛋白上样缓冲液。
注：为了最大限度洗脱（尤其是在效率低下的洗脱的情况下），添加相应的洗脱缓冲液50μL（例如加入EDTA含BUFFER来约束氯化钙2）加热前的样本，以帮助洗脱任何剩余的结合蛋白和4.3中描述的重复步骤，以消除剩余的结合蛋白的珠子珠。
5。 SDS - PAGE和免疫印迹
进行SDS - PAGE和分析你的兴趣和探针蛋白探测已知绑定在相反的条件作为阳性对照CAM一种蛋白质，用Western blot。
6。代表性的成果
图2B显示一个凸轮下拉检测测试的GFP标记的吴CAM约束力相比，内源性吴的例子。要做到这一点，在我们的器官海马过度表达GFP - NG隔夜和组织匀浆。匀浆孵育与CAM -琼脂糖珠在任的Ca 2 +或EDTA存在。匀浆输入显示，除了内源性吴和Ca 2 + / CaM依赖的蛋白激酶Ⅱ表达GFP - NG（CaMKII）。正如预期的基础上已知的具有约束力的内源性NG（图2a所示），GFP标记吴洗脱的Ca 2 +（EDTA的结合蛋白）的情况下存在的Ca 2 +绑定（图2B） 。相比之下，控制，CaMKII，洗脱的Ca 2 +结合蛋白的存在，并在其缺席（EDTA）的未绑定。这表明，凸轮珠的正常运行和洗脱是有效率的。最重要的，这表明，GFP - NG ApoCaM内源性的形式以类似的方式结合，这表明绿色荧光蛋白标记并没有改变我们的重组蛋白的功能。
图1。CAM下拉试验大纲
（一）组织匀浆降速去除细胞碎片。约10％的上清液作为输入（1）样本。为不同的平分剩余的上清被添加到测试在这些条件的约束条件和适当的试剂（氯化钙或EDTA） 。每个上清（含要么氯化钙或EDTA）装上分别编写的CaM - Sepharose树脂和（二）培养允许绑定。未绑定的蛋白质被删除（2），（三）结合蛋白（3）使用洗脱缓冲液（EB）载有约束力相反的条件珠的洗脱。使用SDS - PAGE和Western blot分析，可以分析这三种蛋白质样品的蛋白质组成。
图2。A.）原理的Ca 2 +依赖的CAM约束力和洗脱下拉检测的例子是两种类型的蛋白质结合在CA 2 CAM +依赖性。神经颗粒素（NG）表示，绑定的apo - CaM和CaMKII代表绑定的Ca 2 +丰富的蛋白质，蛋白质CAM。 CAM是在其分离状态，孵化前的匀浆蛋白。一旦培养高的Ca 2 +浓度（2毫米）的条件下，或存在的CA 2 +螯合剂EDTA（2毫米），蛋白质将绑定到CAM相应。吴在EDTA条件结合CAM，因为几乎没有CA +目前，将洗脱的Ca 2 +的存在凸轮琼脂糖珠。 CaMKII，但是，将绑定到CAM中存在高含量的Ca 2 +，将游离的Ca 2 +螯合后。
B）例如CAM下拉检测结果。这个数字表明，预计最终结果的CAM -琼脂糖拉吴和CaMKII探测与样品。内源性吴和GFP - NG是目前在EDTA存在必然凸轮的蛋白质车道。没有吴是必然样品时，培养与CAM的Ca 2 +的存在，这表明了N克只绑定APO - CAM。另一方面，我们积极的控制，CaMKII，只约束中存在的 Ca 2 CAM + 。
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Discussion
提供的协议利用CaM的琼脂糖珠调查的Ca 2 +依赖CaM结合蛋白。许多蛋白质结合CAM中的Ca 2 +依赖性。这些相互作用CaM结合蛋白的数量和他们的许多信号通路中的关键作用给予高度重视。在这个协议中，CAM - Sepharose树脂用于组织匀浆中的Ca 2 +的存在或缺乏独立于CaM结合蛋白。这个简单的方法的结果将进一步了解蛋白质如何与CAM中的Ca 2 +依赖的方式进行交互。这种方法不同于在蛋白质的常用技术结合的研究，柱层析，凸轮琼脂糖珠的解决方案，而不是固定在一个矩阵。
避免使用列的是这种方法的一个优势，因为没有列该协议是费时少，有没有NE到平衡列或等待通过重力流。由于凭借其效率，CAM下拉需要显著小于柱层析组织，并简化了样品制备，分离蛋白质样品的细胞碎片，只需要一个短CAM -琼脂糖离心拉下来描述。列需要的蛋白质样品，无任何细胞碎片，这可能需要额外的纯化步骤。这种方法也有优势比其他拉下来的方法，如免疫共沉淀，这就需要对捕捉到它的诱饵蛋白相互作用的蛋白质样品中的任何抗体。可以使用一种抗体来捕捉诱饵蛋白的限制差抗体和蛋白质之间的相互作用在实验过程中可能会导致效率低下的拉下来。这些潜在的问题是避免使用的CAM -琼脂糖下拉。
然而，像免疫共沉淀和柱色谱分析，CAM -琼脂糖下拉是有限的体外 CaM结合。得到的结果可能不反映在体内的CaM相互作用的现实。例如，翻译后修饰，往往影响蛋白质的相互作用。这是的NG的情况下，其互动与CAM无法PKC介导的磷酸化其IQ 域 5 。均质组织可能会改变如激酶或磷酸酶来访问目标通常会从细胞内的酶孤立的蛋白质翻译后修饰，例如。本地化和/或条块分割的影响，也让具有约束力时，这两种蛋白质，通常不会有机会在细胞相互作用。为了最大限度地减少这些反应，重要的是，存储之间的准备和加载冰所有样品。这也就是这个原因，孵化与珠唐Ë在4 ° C。磷酸酶抑制剂或其他酶抑制剂，也可以添加到同质化的缓冲区，以帮助限制了他们的影响。
重要的是，本次实验，以确保没有显著的错误，在实验过程中发生的阳性对照。它也可以确保条件的差异，足以导致在CAM中的构象变化，允许它绑定不同的蛋白质 ，钙的存在和缺乏+。举例来说，如果没有信号蛋白，它可能是由于装载错误或其他潜在的错误。探测已知结合，在其他条件（如在提供的例子CaMKII）另一种蛋白质，可以帮助解决潜在的错误。低Ca 2 +或Ca 2 +螯合剂（如EDTA）的浓度也可以干扰与预期的结果。已成功用于EDTA的，但其他的Ca 2 +螯合剂（如EGTA）可能会更有效，如果甚至更高concentrat离子是无效的。过量的钙调素结合蛋白也可能导致意想不到的结果，因为它可能可用CAM -琼脂糖珠饱和，造成蛋白质的洗脱时，它应该是必然。这被认为是在所示的例子中相对少量的GFP - NG是在EDTA条件洗脱。蛋白定量与珠孵化前，可能有助于改善这种。
适当的准备和处理整个实验凸轮琼脂糖珠也是取得成功的关键。珠可以很容易地失去了在实验过程中，无论是无意中删除与上清被丢弃或卡到2.0毫升管的两侧和顶部。这可避免使用谨慎，同时消除上清，并确保充分混合立即前离心。尽量不要让样品坐，因为它允许的CaM -琼脂糖珠干管双方之间的混合，离心。作为一项预防措施，重悬珠和RO大老管立即离心前的湿珠周围的解决方案。与珠样本进行彻底浸泡在两者的结合和洗脱孵化是非常重要的。如果没有合适的样品与珠混合，结合和洗脱，将有可能是低效的。
该协议是通用的，可以很容易地被用于其他目的的修改。截断或突变的蛋白质执行本实验可以揭示该地区的信息（S）和CAM绑定和Ca 2 +依赖的重要的蛋白质残留，如果观察。在伍的情况下，我们能够证明，如内源性蛋白GFP - NG，结合只有在缺席的Ca 2 + 8 CAM。为了进一步探讨这一约束力，改变其IQ域的CaM以及翻译后修饰的功能，有助于了解吴的相互作用的性质的不同，这种蛋白质的基因突变的功能，改变这种interaction。我们测试的NG - CAM结合使用两种不同的突变体的重要性：phosphomimic天门冬氨酸和丝氨酸（S36D或NG - SD）在一个IQ少吴，以防止有约束力的凸轮。我们也产生了一种突变（NG - SFAW），增强约束力凸轮，下榻的约束，甚至存在的Ca 2 +。最后，我们使用非phosphorylatable突变（NG - SA），其中结合在一个的Ca 2 +依赖的方式类似于内源性吴凸轮但防止蛋白激酶C（PKC）磷酸化。凸轮下拉检测帮助测试这些不同的突变体的功能，并有助于显示NG - CAM在突触功能的8约束力的重要性和吴磷酸化如何帮助微调突触可塑性15。
此外，钙调素结合蛋白的蛋白质结合，可以洗脱。这可能会提供进一步确定蛋白质，间接结合的CaM这个实验中的应用。它允许对这些相互作用的研究离子和其他潜在的CaM和其约束力的合作伙伴的下游影响。
综上所述，CAM下拉实验调查的Ca 2 +依赖钙调蛋白相互作用提供了一个有效的方式。这可以研究钙调蛋白的相互作用，不同的基因突变或修改可能会影响这些相互作用的重要工具。在探索的Ca 2 + / CAM信号通路的调节，这可宝贵的。此外，我们可以使用这种探索在Ca 2 + / CaM的信号中断引起的病症。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢她的帮助下，在优化这个协议蒂芙尼樱桃。这项工作是由国家衰老研究所（AG032320）以及推进健康威斯康星州。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calmodulin-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0529-01 | |
| Anti-CamKII alpha | Sigma-Aldrich | C6974 | |
| Anti-neurogranin | EMD Millipore | 07-425 | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-138 | Use for aspiration of supernatants |
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-146 | Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads |
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