הנפתח של calmodulin מחייב חלבונים

Summary

Calmodulin (רמ"א) הנפתח assay היא דרך יעילה לחקור את האינטראקציה של CAM עם חלבונים שונים. שיטה זו משתמשת Cam-sepharose חרוזים לצורך ניתוח יעיל ספציפי של Cam-binding חלבונים. זה מספק כלי חשוב לחקור איתות קאם פונקציה הסלולר.

Abstract

סידן (Ca ^{2 +)} הוא יון חיוני בוויסות תפקוד הסלולר באמצעות מגוון של מנגנונים. הרבה Ca ^{2 +} איתות מתווכת באמצעות חלבון וסידן מחייב המכונה ^1,2 (רמ"א) calmodulin. CAM הוא מעורב במספר רמות כמעט בכל תהליכים תאיים, כולל אפופטוזיס, חילוף החומרים, התכווצות שרירים חלקים, הפלסטיות הסינפטית, צמיחה עצב, דלקת את התגובה החיסונית. מספר חלבונים מסייעים לווסת מסלולים אלו באמצעות האינטראקציה שלהם עם קאם. רבים אינטראקציות אלה תלויים קונפורמציה של CAM, השונה במובהק כאשר חייב Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +-CAM)} בניגוד למצב Ca ^{2 +-free} שלה (ApoCaM) ^3.

בעוד שרוב החלבונים היעד לאגד Ca ^{2 +-CAM,} חלבונים מסוימים רק לאגד ApoCaM. חלק CAM לאגד דרך תחום IQ שלהם, כולל ⁴ neuromodulin, neurogranin (נג) ^5, ו myosins מסוימים 7, פונקציה postsynaptic ^{8, 9} ו - התכווצות שרירים, בהתאמה. יכולתם לקשור ולשחרר CAM בהעדר או נוכחות של Ca ^{2 +} הוא מכריע את תפקידם. לעומת זאת, חלבונים רבים רק לאגד Ca ^{2 +-CAM} ודורשים זה מחייב הפעלה שלהם. דוגמאות כוללות שרירן קינאז שרשרת אור ^10, Ca ^{2 +} / CAM תלויי קינאז (CaMKs) ¹¹ ו phosphatases (למשל calcineurin) ^{12, 13} ו spectrin קינאז, אשר יש מגוון של השפעות ישירות או במורד ^14.

ההשפעות של חלבונים אלה על תפקוד הסלולר הם בדרך כלל תלויה ביכולתם להיקשר CAM באופן ⁺ תלויות Ca ^2. לדוגמה, בדקנו את הרלוונטיות של הכריכה NG-CAM בתפקוד סינפטי וכיצד מוטציות שונות משפיעות זו מחייבת. אנחנו שנוצר קון GFP-tagged נגstruct עם מוטציות ספציפיות בתחום-IQ כי תשנה את יכולתו של נג להיקשר CAM באופן ⁺ תלויות Ca ^2. המחקר של אלה מוטציות שונות נתנו לנו לרדת לעומקה של תהליכים חשובים מעורב בתפקוד סינפטי ^8,15. עם זאת, מחקרים כאלה, חיוני להוכיח כי החלבונים מוטציה יש מחייב שינוי צפוי CAM.

כאן, אנו מציגים שיטה לבדיקת יכולתה של חלבונים להיקשר קאם נוכחות או היעדר של Ca ^{2 +,} באמצעות CaMKII ו נג כדוגמאות. שיטה זו היא סוג של זיקה כרומטוגרפיה המכונה assay CAM הנפתח. היא משתמשת Cam-Sepharose חרוזים לבדוק חלבונים הנקשרים CAM ואת ההשפעה של Ca ^{2 +} על זה מחייב. זה הזמן הרבה יותר יעיל דורש פחות חלבון ביחס כרומטוגרפיה בעמודה מבחני אחרות. בסך הכל, זה מספק כלי רב ערך כדי לחקור Ca ^{2 +} / CAM איתות וחלבונים כיteract עם קאם.

Protocol

עיין באיור 1 עבור סכמטית בסיסית של תחילת ההליך עם homogenate. זמן משוער של הכנת תמציות הסלולר elution של רמ"א הנכנס חלבונים הוא כ 6-7 שעות.

1. רקמות הכנה

1. הזרק פרוסות בהיפוקמפוס organotypic בווירוס המכיל פלסמיד ביטוי חלבון רקומביננטי של עניין (בדוגמה זו, ירוק ניאון (GFP), מתויג חלבון נג) ולאפשר רקמות לבטא חלבון לילה.
2. כ 12 עד 18 שעות לאחר ההזרקה ויראלי (תלוי בזמן ביטוי ויראלי), להכין לאסוף את הרקמה. הוסף חוצץ לנתיחה 1mL (גלוקוז 10 מ"מ, 4 מ"מ KCl, NaHCO3 26mM, סוכרוז 233mM, MgCl 5mm _2, 1mm CaCl _2, ו - 0.1% פנול אדום, בגז עם 5% CO ₂ 95% O ₂₎ על צלחת פטרי. העברת רקמה להכניס תרבותי / צלחת פטרי ולהוסיף למאגר לנתיחה 2ml להכניס את להטביע את הרקמה.
3. הקולקטיביתלא רקמה בהיפוקמפוס organotypic (בין 5 ל 10 פרוסות) על ידי מגרד בעדינות ברקמה חופשית של הממברנה להכניס באמצעות אזמל. באופן ספציפי בהסרת אזור מסוים של עניין (למשל CA1) היא גם אופציה. העברת רקמה מושעה לצינור microcentrifuge 1.5mL באמצעות הפוכה פיפטה פסטר.
4. צנטריפוגה דגימות RCF 1500 דקות 1 להפריד רקמה למאגר לנתיחה. הסר בזהירות את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה.
5. במשך כל פרוסה בשימוש, להוסיף 30-60 μL של חיץ homogenization (NaCl 150mm, 20mm טריס pH 7.5, 1mm DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antipain, pepstatin 1μg/mL, ו -1% טריטון X -100) לרקמות ו homogenize ביסודיות עם העלי.
6. על מנת להסיר שאריות הסלולר, בצנטריפוגה homogenate הנותרים בבית RCF 1100 עבור 10 דקות ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה, תוך הימנעות מזיהום של גלולה.
7. קחו 10% supernatant כפי מדגם של הקלט (לדוגמה 1). חנות supernatant הנותרים על הקרח במהלך תקופת ההכנה של Cam-sepharose חרוזים לשימוש בשלב 3.

הערה: רקמה משמש כאן פרוסות בהיפוקמפוס organotypic. עם זאת, אפשר להשתמש בנוירונים ניתק או כל מערכת אחרת culturing התא. במקרה כזה, להתחיל בשלב 1.4 לאחר איסוף רקמת שלך באופן הולם.

2. הכנת חרוזי עבור הנפתח

בטיפול חרוזים, חשוב להציל את החרוזים למקסם את היעילות של התגובות ידי מניעת חרוזים מהתייבשות על דפנות הצינור. כדי לעשות זאת, עדיף לסובב הצינורות שלך בצד שלהם, מה שמאפשר פתרון להרטיב את החרוזים על קירות של הצינור, מיד לפני צנטריפוגה.

1. עבור כל הנפתח, פיפטה 400 μL של calmodulin-Sepharose חרוזים מושעה לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל עם יחסית flat-התחתונה על מנת למקסם את שטח הפנים ואת האינטראקציה של פתרונות שלך עם חרוזים במהלך incubations שלך.
2. צנטריפוגה חרוזים ב RCF 21,000 למשך 30 שניות ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע חרוזים.
3. כדי לשטוף את חרוזים, להוסיף 100 μL של למאגר homogenization בהתאמה המכיל גם 2 מ"מ CaCl ₂ לאלה בשימוש הנפתח Ca ^{2 +-CAM} חלבונים מחייב 2 mM EDTA (א chelator ידוע Ca ^{2 +)} עבור חרוזים והורידה ApoCaM חלבונים מחייב. לטפוח בעדינות את הצינור מחדש להשעות חרוזים צנטריפוגות ב RCF 1500 דקות 1. הסר בזהירות את supernatant על ידי שאיפה, מוודא שלא להפריע את החרוזים.

הערה: כל השלבים השאיפה, מומלץ להשתמש קצה פיפטה שיש לו פתיחה נאה (למשל טעינת טיפים ג'ל) כדי לאפשר הסרה של פתרון מבלי להסיר חרוזים.

3. Cam-sepharose מחייב של חלבונים

1. פיצול supernatant שלך לתוך שני תנאים המכיל נפח שווה. בהתאם למצבך, להוסיף את הכמות המתאימה של CaCl ₂ או EDTA עד כדי supernatant שלך ריכוז 2 מ"מ כל אחד.
2. הוסף supernatant משלב 1.7 כדי לרחוץ במאגר חרוזים homogenization המקביל. לטפוח בעדינות את הצינור לערבב.
3. דגירה דגימות 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות על שייקר. Re-להשעות חרוזים כל 30 דקות בערך כדי להגביר את היעילות של הכריכה.
4. צינור צנטריפוגה המכילה דגימות וחרוזים ב RCF 1500 דקות 3.
5. קח 50μL של supernatant כמדגם של חלבון מאוגד (מדגם 2) ו בזהירות להסיר את supernatant הנותרים על ידי שאיפה וזורקים.
6. לשטוף חרוזים שלוש פעמים כמתואר צעד 2.3 באמצעות 100μL של חיץ homogenization בהתאמה.

4. Elution

1. הוסף 50μL של חיץ elution (50mm טריס-HCl pH 7.5, ו 150mm NaCl) המכיל את המצב ההפוך (10mm CACL ₂ או 10mm EDTA) על חרוזים. לדוגמה, דגימות שהיו הומוגני וכרוך במאגר המכיל Ca ^{2 +} הם eluted במאגר elution המכיל EDTA ולהיפך.

אופציונלי: התחממות החיץ elution עד 37 ° C לפני הוספת חרוזים עשוי לשפר את התשואה.

2. דגירה פתרון עם חרוזים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר. מערבבים בעדינות את החרוזים על ידי הקשה על הצינור על כל 5 דקות.
3. צנטריפוגה חרוזים ב RCF 1500 דקות 3 ובזהירות להסיר את 50μL של supernatant לחלבון כבול (מדגם 3) על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע חרוזים.
4. הוסף חוצץ טעינת חלבון לכל דגימות (כלומר, homogenate מאוגד וכרוך חלבון, כמו גם אלה עדיין קשורות עם חרוזים).

הערה: כדי למקסם את elution (במיוחד במקרה של elution לא יעיל), להוסיף 50μL של למאגר elution המתאים (למשל הוספת buf המכיל EDTAfer כדי חרוזים כבול CaCl ₂₎ על חרוזים לפני החימום דגימות כדי לסייע elute כל חלבון חייב הנותרים וחזור על שלבים המתוארים 4.3 להסיר חלבונים מחויב הנותרים.

5. SDS-PAGE ומערב כתם

התנהגות SDS-PAGE ולנתח באמצעות כתם המערבי על ידי חיטוט לחלבון שלך עניין בדיקה של חלבון ידוע להיקשר CAM במצב ההפוך כביקורת חיובית.

6. נציג תוצאות

איור 2B מראה דוגמה של assay-CAM הנפתח בדיקה מחייב CAM של NG-GFP מתויג לעומת נג אנדוגני. כדי לעשות זאת, GFP-נג היה ביטוי יתר של פרוסות בהיפוקמפוס organotypic שלנו לילה ואת רקמת היה הומוגני. Homogenate הודגר עם קאם-sepharose חרוזים בנוכחות או Ca ^{2 +} או EDTA. הקלט Homogenate מראה כי ה-GFP-נג התבטא בנוסף נג אנדוגני Ca ^{2 +} / CAM תלויי קינאז II(CaMKII). כצפוי מבוסס על הכריכה הידועה של נג אנדוגני (מאויר איור 2A)., GFP-tagged נג היה eluted בהעדר Ca ^{2 +} (חלבון EDTA כבול) ו מאוגד בנוכחות Ca ^{2 +} (איור 2B) . לעומת זאת, השליטה, CaMKII, היה eluted רק בנוכחות Ca ^{2 +} (חלבון קשור) היה מאוגד בהעדרה (EDTA). זה מראה את החרוזים CAM תיפקדו כראוי elutions היו יעילים. והכי חשוב, זה מראה כי ה-GFP-נג נקשר ApoCaM באופן דומה לטופס אנדוגני, טוען כי את תג ה-GFP לא לשנות את הפונקציה של חלבון רקומביננטי שלנו.

1. באיור המתאר של CAM הנפתח assay
(א) homogenate רקמות הוא הסתובב כלפי מטה כדי להסיר הפסולת התאית. כ -10% supernatant הוא נלקח מדגם של הקלט (1). Supernatant הנותר מתחלק שווה בשווה עבור שונההתנאים ואת ריאגנטים המתאימים (CaCl ₂ או EDTA) מתווספים מבחן מחייב בתנאים אלה. כל supernatant (המכיל גם CaCl ₂ או EDTA) נטען על גבי Cam-sepharose חרוזים מוכן בהתאמה ו (ב) מודגרות לאפשר מחייב. חלבונים מאוגד מוסרים (2) ו - (ג) את החלבונים כבול (3) הם eluted off של חרוזים באמצעות חיץ elution (EB) המכיל את המצב ההפוך כאשר מחייב. הרכב החלבונים של שלושת דגימות חלבון ניתן לנתח באמצעות SDS-PAGE וניתוח המערבי כתם.

2. איור א ') סכמטי של Ca ^{2 +} תלויות מחייב CAM ו elution ב הנפתח דוגמאות assay מקבלים שני סוגי חלבון אשר נקלטות קאם Ca ^{2 +} תלויות בדרך. Neurogranin (נג) מייצג חלבונים הנקשרים apo-CAM ו CaMKII מייצג חלבונים אשר נקלטות על ידי Ca ^{2 +} עשירCAM. CAM מוצג במצב שלה ניתק לפני הדגירה עם חלבונים homogenate. מודגרות לאחר בתנאי גבוה Ca ^{2 +} ריכוזים (2 מ"מ) או בנוכחות Ca ^{2 +} chelator, EDTA (2 מ"מ), חלבונים יהיה לאגד CAM בהתאם. נג נקשר CAM במצב EDTA כפי שיש לא מעט Ca ^{2 +} בהווה, יהיה eluted את Cam-sepharose חרוזים בנוכחות Ca ^{2 +.} CaMKII, לעומת זאת, היה לאגד CAM בנוכחות כמויות גבוהות של Ca ^{2 +} והיה לנתק פעם ^{+ 2} Ca היה chelated.
ב) תוצאות של CAM למשל הנפתח assay. נתון זה מדגים את התוצאה הסופית הצפויה של Cam-sepharose לנתץ עם דגימות נחקר במשך נג ו CaMKII. הן נג אנדוגני ו-GFP נג נמצאים בסמטאות של חלבונים חייב CAM בנוכחות EDTA. נג לא קשור כאשר דגימות מודגרת עם קאם בנוכחות Ca ^{2 +,} הוכחת כי Nגרם בלבד נקשר apo-CAM. בקרה חיובית שלנו, CaMKII, מצד שני, נקשר CAM רק בנוכחות Ca ^{2 +.}

Discussion

פרוטוקול בתנאי מנצל Cam-sepharose חרוזים לחקור את Ca ^{2 +-התלות} של Cam-binding חלבונים. חלבונים רבים לאגד CAM באופן ⁺ תלויות Ca ^2. אינטראקציות אלה הם בעלי חשיבות רבה בהתחשב במספר CAM מחייב חלבונים תפקיד קריטי שלהם מסלולי איתות רבים. בפרוטוקול זה, Cam-sepharose חרוזים משמשים נפרד CAM מחייב חלבונים מן homogenate רקמות נוכחות או היעדר של Ca ^{2 +.} התוצאות של הגישה הזאת פשוט יהיה עוד יותר את ההבנה של איך חלבונים עשויה ליצור אינטראקציה עם קאם בצורה ^{2 +} תלויות Ca. גישה זו שונה בטכניקה נפוץ חלבון מחקרים מחייב, כרומטוגרפיה בעמודה, כי ב-CAM sepharose חרוזים נמצא פתרון במקום קבוע במטריצה.

הימנעות משימוש בטור הוא אחד היתרונות של גישה זו, כי בלי הטור הפרוטוקול הוא פחות זמן רב, כפי שיש לא neעורך לאזן עמודה או לחכות הכבידה זרימה דרך. בשל מכוח היעילות שלה, מצלמת הנפתח דורש רקמות משמעותית פחות כרומטוגרפיה בעמודה ומפשט הכנת המדגם, כמו הפרדת פסולת הסלולר מן המדגם חלבון רק דורש צנטריפוגה קצר עבור CAM-sepharose למשוך המתואר למטה. עמודות דורשים דגימות חלבון הן ללא כל פסולת הסלולר, אשר עשויים לדרוש צעדים טיהור נוספים. גישה זו יש גם יתרונות על פני שיטות למשוך אחרים כלפי מטה, כגון immunoprecipitation משותפת, המחייבת נוגדן נגד החלבון פיתיון כדי ללכוד אותו ואת כל החלבונים אינטראקציה במדגם. השימוש נוגדן כדי ללכוד את החלבון הפיתיון יכול להיות מגבלה של אינטראקציות בין עניים הנוגדן ואת החלבון במהלך הניסוי יכול להוביל למשוך מטה יעיל. בעיות אלה פוטנציאל הן להימנע בשימוש המתואר Cam-sepharose הנפתח.

עם זאת, כמושיתוף immunoprecipitation ו כרומטוגרפיה מבחני טור, רמ"א, sepharose הנפתח מוגבל לשעבר vivo CAM מחייב. התוצאות שהושגו לא יכול לשקף את המציאות vivo של אינטראקציות CAM. לדוגמה, שלאחר translational שינויים לעתים קרובות השפעה אינטראקציות חלבון. זהו המקרה עבור neurogranin, אשר אינטראקציה עם קאם נמנעת על ידי זרחון של PKC בתיווך בתחום שלו IQ ^5. שמאחד רקמות יכול לשנות שלאחר translational שינויים למשל על ידי מתן אנזימים כגון קינאזות או phosphatases לגשת חלבונים היעד אשר בדרך כלל מבודדים את האנזימים בתוך התא. שיבוש של לוקליזציה ו / או מידור יכול גם לאפשר מחייב כאשר שני החלבונים בדרך כלל לא היה סיכוי לאינטראקציה בתא. כדי למזער את התגובות האלה, חשוב לאחסן את כל דגימות על הקרח בין הכנה וטעינה. זוהי גם הסיבה לכך הדגירה עם חרוזים הוא דוןדואר ב 4 ° C. מעכבי phosphatase או מעכבי אנזים אחר יכול להיות גם להוסיף את מאגרי homogenization כדי לעזור להגביל את ההשפעות שלהם.

פקד חיובי חשוב לצורך הניסוי הזה כדי לוודא כי אין טעויות משמעותיות שהתרחשו במהלך הניסוי. זה גם יכול להבטיח כי ההבדלים בתנאי הספיקו כדי לגרום לשינויים קונפורמציה CAM, שמאפשר לו להיקשר חלבונים שונים בנוכחות והיעדר Ca ^{2 +.} לדוגמה, אם אין אות לחלבון של עניין, זה יכול להיות בגלל שגיאה בטעינת או שגיאות פוטנציאליות אחרות. גשוש של חלבון אחר הידוע לאגד בתנאים אחרים (כגון CaMKII בדוגמה סיפקה) יכול לעזור לפתור שגיאות פוטנציאליות. נמוכה Ca ^{2 +} או Ca ^{2 +} chelator (למשל EDTA) בריכוזים יכול גם להפריע התוצאות הצפויות. EDTA שימש בהצלחה אבל אחרים Ca ^{2 +} chelators (למשל EGTA) עשוי להיות יעיל יותר אם concentrat אף גבוה יותריונים אינן יעילות. חלבון מוגזמת CAM מחייב יכול גם להוביל לתוצאות בלתי צפויות כפי שהוא עשוי להרוות את זמין CAM-sepharose חרוזים, גרימת elution של החלבון כאשר הוא צריך להיות מחויב. הדבר בא לידי ביטוי למשל כפי שמוצג כמות קטנה יחסית של ה-GFP-נג הוא eluted במצב EDTA. כימות של חלבון לפני הדגירה עם חרוזים עשויים לעזור לשפר את זה.

הכנה וטיפול נאות של Cam-sepharose חרוזים לאורך הניסוי חיוני גם להצלחה. חרוזים יכול בקלות ללכת לאיבוד במהלך הניסוי, או להסיר בטעות עם supernatant להיות מושלך או תקוע על הצדדים ועל החלק העליון של הצינור 2.0 מ"ל. זה יכול להימנע על ידי שימוש בזהירות תוך הסרת supernatant והבטחת ערבוב יסודי מיד לפני צנטריפוגה. נסו לא לתת דגימות לשבת בין ערבוב centrifuging שכן היא מאפשרת Cam-sepharose חרוזים להתייבש על דפנות הצינור. כאמצעי זהירות, חרוזים resuspend ו roטייט פתרון סביב הצינור כדי חרוזים רטוב מיד לפני צנטריפוגה. טבילה יסודית של דגימות עם חרוזים במהלך מחייב והן incubations elution חשוב מאוד. ללא ערבוב מתאים המדגם עם החרוזים, מחייב elution צפויה להיות יעילה.

פרוטוקול זה צדדי והוא יכול בקלות להיות מתוקן למטרות אחרות. ביצוע ניסוי זה עם חלבונים קטועה או מוטציה יכולה לחשוף מידע על האזור (ים) ושאריות של החלבון שחשובים CAM מחייב Ca ^{2 +} תלות, אם ציין. במקרה של נג, הצלחנו להראות כי ה-GFP-נג, כמו חלבון אנדוגני, נקשר CAM רק בהיעדרו של Ca ^{2 + 8.} כדי להמשיך לחקור את הפונקציה של זה, מחייב מוטציות שונות של חלבון זה יעזור לשנות את מנת המשכל, בתחום שלו כדי להבין את אופי האינטראקציה של נג עם קאם, כמו גם את הפונקציה של הפוסט translational שינויים, אשר לשנות את זה interaction. בדקנו את החשיבות של NG-CAM מחייב שימוש בשני מוטנטים שונים: aspartate phosphomimic במקום סרין (S36D או NG-SD) ו-IQ פחות נג למנוע מחייב CAM. אנחנו גם יצר מוטציה (NG-SFAW) כי שיפרה מחייב Cam, נשאר כבול אפילו בנוכחות של Ca ^{2 +.} לבסוף, השתמשנו לא phosphorylatable מוטציה (NG-SA) אשר נקשר CAM בצורה ⁺ תלויות Ca ² דומה נג אנדוגני אבל מונע זירחון של חלבון קינאז C (PKC). CAM הנפתח assay עזרו לבדוק את הפונקציונליות של אלה מוטציות שונות ועזר להראות את החשיבות של הכריכה NG-CAM בתפקוד סינפטי ⁸ ואיך זירחון נג מסייע לכוונן את הפלסטיות הסינפטית ^15.

בנוסף, חלבונים הנקשרים CAM מחייב חלבונים יכול להיות eluted. זה יכול לספק יישומים נוספים של assay זה בקביעת חלבונים בעקיפין לאגד CAM. זה מאפשר לימוד של אינטראקציה אלה אחריםהיונים ושאר תופעות במורד הפוטנציאל של CAM והשותפים שלה מחייב.

לסיכום, CAM הנפתח assay מספקת דרך יעילה ואפקטיבית לחקור Ca ^{2 +-CAM} התלות של אינטראקציות חלבון. זה יכול להיות כלי חשוב במחקר CAM אינטראקציות חלבון וכיצד מוטציות שונות או שינויים אלה עשויים להשפיע על יחסי הגומלין. זה יכול להיות בעל ערך לחקור את הרגולציה של Ca ^{2 +} / CAM מסלולי איתות. יתר על כן, אנו יכולים להשתמש בזה כדי לחקור מחלות הנגרמת על ידי הפרעות Ca ^{2 +} / CAM איתות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calmodulin-Sepharose beads	GE Healthcare	17-0529-01
Anti-CamKII alpha	Sigma-Aldrich	C6974
Anti-neurogranin	EMD Millipore	07-425
Gel Loading Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-138	Use for aspiration of supernatants
Microcentrifuge tubes (2.0 mL)	Fisher Scientific	05-408-146	Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads