Summary
Calmodulin (CAM) pull-down-analysen er en effektiv måde at undersøge samspillet mellem Cam med forskellige proteiner. Denne metode bruger CAM-sepharose perler for en effektiv og specifik analyse af CAM-bindende proteiner. Dette giver et vigtigt værktøj til at udforske Cam signalering i cellulære funktion.
Abstract
Calcium (Ca 2 +) er en ion afgørende i reguleringen af cellulære funktion gennem en række forskellige mekanismer. Meget af Ca 2 + signalering er medieret gennem calcium-bindende protein kaldet calmodulin (CAM) 1,2. Cam er involveret på flere niveauer i næsten alle cellulære processer, herunder apoptose, stofskifte, glat muskel sammentrækning, synaptisk plasticitet, nerve vækst, inflammation og immunrespons. En række af proteiner hjælper med at regulere disse veje gennem deres interaktion med CAM. Mange af disse interaktioner afhænger af kropsbygning af Cam, som er markant anderledes, når bundet til Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) i modsætning til sin Ca 2 +-fri tilstand (ApoCaM) 3.
Mens de fleste target-proteiner binder Ca 2 +-Cam, visse proteiner, der kun binder til ApoCaM. Nogle binder Cam gennem deres IQ-domænet, herunder neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, og visse myosins
Virkningerne af disse proteiner på cellefunktion ofte er afhængige af deres evne til at binde sig til Cam i en Ca 2 +-afhængig måde. For eksempel testede vi relevansen af Ng-CAM bindende i synaptic funktion og hvordan forskellige mutationer påvirker denne binding. Vi genererede et GFP-tagget Ng construct med specifikke mutationer i IQ-domæne, der ville ændre evne Ng til at binde Cam i en Ca 2 +-afhængig måde. Undersøgelsen af disse forskellige mutationer gav os stor indsigt i vigtige processer, der er involveret i synaptiske funktion 8,15. Men i sådanne undersøgelser, er det vigtigt at vise, at det muterede proteiner har den forventede ændret binding til CAM.
Her præsenteres en metode til at teste evnen af proteiner til at binde sig til cam i tilstedeværelse eller fravær af Ca 2 +, ved hjælp af CaMKII og Ng som eksempler. Denne metode er en form for affinitetskromatografi omtales som en CAM pull-down assay. Det bruger CAM-Sepharose perler til at teste proteiner, der binder til Cam og indflydelsen af Ca 2 + på denne bindende. Det er betydeligt mere tid effektiv og kræver mindre protein i forhold til søjlekromatografi og andre analyser. Alt i alt, dette giver et værdifuldt redskab til at udforske Ca 2 + / CAM signalering og proteiner, der igende effekter med CAM.
Protocol
Se figur 1 for en grundlæggende skematisk af den procedure, begyndende med homogenatet. Estimeret tid fra udarbejdelse af cellulære ekstrakter til eluering af CAM-bundne proteiner er omkring seks til syv timer.
1. Tissue forberedelse
- Injicér organotypiske hippocampus skiver med en virus, der indeholder en plasmid udtrykke det rekombinante protein af interesse (i dette eksempel, grønne fluorescerende protein (GFP)-mærkede Ng) og tillade væv til at udtrykke proteiner natten over.
- Ca. 12 til 18 timer efter viral injektion (afhængigt af den virale udtryk tid), forberede sig på at indsamle de væv. Tilføj 1ml dissektion buffer (10mm glukose, 4mm KCl, 26mm NaHCO3, 233mM saccharose, 5mm MgCl 2, 1mm CaCl 2 og 0,1% phenol-rød, gasset med 5% CO 2 på 95% O 2) til en petriskål. Transfer kulturperler væv / indsæt til petriskål og tilsættes 2 ml dissektion buffer til indsætte at oversvømme den væv.
- Collect organotypiske hippocampus væv (mellem 5 og 10 skiver) ved forsigtigt at skrabe væv fri af skæret membran ved hjælp af en skalpel. Konkret fjernelse af en bestemt region af interesse (f.eks CA1) er også en mulighed. Overfør det opslæmmede væv til et 1,5 ml mikrocentrifugerør med en omvendt Pasteur pipette.
- Centrifugér prøver at 1.500 RCF i 1 min til at adskille væv fra dissektion buffer. Fjern forsigtigt supernatanten ved aspiration. Sørg for ikke at forstyrre bundfaldet.
- For hver skive bruges, tilføje 30 til 60 μL af homogenisering buffer (150mm NaCl, 20mm Tris pH 7,5, 1mm DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antipain, 1μg/mL pepstatin, og 1% Triton X -100) til væv og homogeniseres grundigt med pistil.
- For at fjerne cellulært debris, centrifugeres den resterende homogenatet på 1.100 RCF i 10 min og fjern forsigtigt supernatanten ved aspiration og samtidig undgå forurening fra pellet.
- Tage 10% af supernatanten som en prøve af input (prøve 1). Opbevar resterende Supernatanten på is under forberedelsen af CAM-sepharose perler til brug i trin 3.
Bemærk: væv, der anvendes her er organotypiske hippocampus skiver. Imidlertid kunne man bruge dissocierede neuroner eller enhver anden celle dyrkning system. I et sådant tilfælde, skal du begynde ved trin 1,4 efter indsamling dit væv i passende måde.
2. Udarbejdelse af perler til pull-down
I håndtering af perler, er det vigtigt at redde perler og maksimere effektiviteten af de reaktioner, ved at forhindre perler fra tørring på siderne af glasset. For at gøre dette, er det bedst at rotere dine rør på deres side, så løsningen på vådt perlerne på væggene i røret, umiddelbart før centrifugering.
- For hver pull-down, pipette 400 μL af suspenderet Calmodulin-Sepharose perler ind i en 2 ml mikrocentrifugerør med en forholdsvis flat-bund for at maksimere areal og samspil af dine løsninger med perler under din inkubationer.
- Centrifugér perler på 21.000 RCF i 30 sekunder og fjern forsigtigt supernatanten ved aspiration. Sørg for ikke at forstyrre perlerne.
- At vaske perler, tilsættes 100 μL af de respektive homogenisering buffer indeholdende enten 2 mM CaCl 2 til dem, der bruges til at pull-down Ca 2 +-CAM proteiner og 2 mM EDTA (en kendt Ca 2 + kelator) for perler trække ned ApoCaM bindende proteiner. Bank forsigtigt på røret for at re-suspendere perler og centrifugeres ved 1.500 RCF i 1 min. Fjern forsigtigt supernatanten ved aspiration, og sørg for ikke at forstyrre perlerne.
Bemærk: For alle aspiration trin, anbefales det at bruge en pipette tip, der har en fin åbning (f.eks gel lastning tips) for at muliggøre fjernelse af opløsningen uden at fjerne perler.
3. CAM-sepharose binding af proteiner
- Split din supernatant i to betingelser, som indeholder en tilsvarende mængde. Afhængig af din tilstand, den relevante mængde CaCl 2 eller EDTA tilføje til din supernatanten op til 2 mm koncentration for hver.
- Tilsæt supernatant fra trin 1,7 til perler vasket i tilsvarende homogenisering buffer. Bank forsigtigt på røret for at blande.
- Inkubér prøverne ved 4 ° C i 3 timer på rystebord. Re-suspendere perler hver 30 minut eller deromkring til at øge effektiviteten af bindende.
- Centrifugerør med prøver og perler ved 1.500 RCF i 3 min.
- Tag 50μL af supernatanten som en stikprøve af ubundet protein (prøve 2) og forsigtigt fjerne de resterende supernatanten ved aspiration og kassér.
- Vask perler tre gange, som beskrevet i trin 2.3 Brug 100μL de respektive homogenisering buffer.
4. Eluering
- Tilsæt 50μL af eluering buffer (50mm Tris-HCl pH 7,5, og 150mm NaCl), der indeholder den modsatte tilstand (10 mm CACL 2 eller 10mM EDTA) til perler. For eksempel, + prøver, der blev homogeniseret og bundet i en buffer indeholdende Ca 2 elueres i eluering buffer indeholdende EDTA og vice-versa.
Valgfrit: Warming eluering buffer til 37 ° C, før du tilføjer til perler kan øge udbyttet.
- Inkuber løsning med perler ved stuetemperatur i 30 min på rystebord. Bland perlerne ved forsigtigt at banke røret ca hvert 5 min.
- Centrifugér perler ved 1.500 RCF i 3 min og forsigtigt fjerne 50μL af supernatanten for de bundne protein (prøve 3) ved aspiration. Sørg for ikke at forstyrre perlerne.
- Tilføj protein lastning buffer til alle prøver (dvs. homogenatet, ubundne og bundne protein, såvel som dem der stadig er bundet til perler).
Bemærk: For at maksimere eluering (især i tilfælde af ineffektive eluering), tilsættes 50μL af den tilsvarende eluering buffer (fx tilføjelse af EDTA indeholder BUFFer til perler bundet i CaCl 2) til perlerne, før opvarmning prøver at hjælpe elueres eventuelle resterende proteinbundet og gentag trin, der er beskrevet i punkt 4.3 til at fjerne de resterende er bundet proteiner.
5. SDS-PAGE og Western Blot
Conduct SDS-PAGE og analysere ved hjælp af Western Blot ved at stikke til din protein af interesse og sonde til et protein kendt for at binde CAM i den modsatte tilstand, som en positiv kontrol.
6. Repræsentative resultater
Figur 2B viser et eksempel på en CAM-pull-down assay test af CAM bindingen af GFP-mærkede Ng i forhold til endogene Ng. For at gøre dette, var GFP-Ng overudtrykt i vores organotypiske hippocampus skiver natten og vævet blev homogeniseret. Homogenatet blev inkuberet med CAM-sepharose perler i tilstedeværelse af en Ca 2 + eller EDTA. Homogenatet input viser, at GFP-Ng blev udtrykt i tillæg til endogene Ng og Ca 2 + / CAM-afhængige kinase II(CaMKII). Som forventet er baseret på de kendte binding af endogent Ng (illustreret i fig. 2A), GFP-tagget Ng blev elueret i mangel af Ca 2 + (EDTA bundet protein) og ubundet i overværelse af Ca 2 + (Fig. 2B) . I modsætning hertil var den kontrol, CaMKII, der er elueret kun i overværelse af Ca 2 + (proteinbundet) og blev ubundne i mangel (EDTA). Dette viser, at Cam perlerne fungerede ordentligt, og elutions var effektive. Vigtigst er det, viser dette, at GFP-Ng binder sig til ApoCaM på samme måde som den endogene form, tyder på, at GFP tag ikke ændrede funktion i vores rekombinant protein.
Figur 1. Oversigt over Cam pull-down assay
(A) Tissue Homogenatet spundet ned for at fjerne cellulært debris. Omkring 10% af supernatanten tages som en prøve af input (1). De resterende Supernatanten er fordelt ligeligt på de forskelligeforhold og de nødvendige reagenser (CaCl 2 eller EDTA) er tilsat for at teste bindende i disse betingelser. Hver supernatant (indeholdende enten CaCl 2 eller EDTA) er indlæst i henholdsvis forberedte CAM-sepharose perler og (B) inkuberes at tillade bindende. Ubundet proteiner er fjernet (2) og (C) den bundne proteiner (3) elueres ud af perlerne ved hjælp eluering buffer (EB), der indeholder den modsatte tilstand som bindende. Det protein sammensætning af disse tre protein prøver kan analyseres ved SDS-PAGE og Western Blot-analyse.
Figur 2. A.) Skematisk af Ca 2 +-afhængige Cam bindende og eluering i pull-down assay Der gives eksempler på to typer af protein, som binder Cam i en Ca 2 +-afhængig måde. Neurogranin (Ng) repræsenterer proteiner, der binder apo-CAM og CaMKII repræsenterer proteiner, der binder sig til Ca 2 +-rigeCam. Cam er vist i sin dissocierede tilstand før inkubering med homogenatet proteiner. Når inkuberes under betingelser med høj Ca 2 + koncentrationer (2 mm) eller i tilstedeværelsen af en Ca 2 + kelator, EDTA (2 mm), vil de proteiner binde sig til CAM i overensstemmelse hermed. Ng binder cam i EDTA-tilstand, da der er lidt at ingen Ca 2 + til stede, og vil blive elueret ud af CAM-sepharose perler i overværelse af Ca 2 +. CaMKII vil imidlertid binde sig til cam i tilstedeværelsen af høje mængder af Ca 2 + og ville tage afstand, når Ca 2 + var chelateret.
B.) Resultater fra eksempelvis Cam pull-down assay. Dette tal viser det forventede endelige resultat af en CAM-sepharose trækker ned med prøverne tastede For NG-og CaMKII. Både endogene Ng og GFP-Ng er til stede i de baner af proteiner bundet til CAM ved tilstedeværelse af EDTA. Ingen Ng er bundet, når prøverne inkuberes med cam i tilstedeværelse af Ca 2 +, viser, at Ng kun binder apo-CAM. Vores positive kontrol, CaMKII, på den anden side, binder sig til Cam kun i tilstedeværelse af Ca 2 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den medfølgende protokol anvender Cam-sepharose perler til at undersøge de Ca 2 +-afhængighed af Cam-bindende proteiner. Mange proteiner binder Cam i en Ca 2 +-afhængig måde. Disse interaktioner er af stor betydning i betragtning af antallet af Cam-bindende proteiner og deres kritiske rolle i mange signalveje. I denne protokol, er Cam-sepharose perler bruges til at adskille CAM-bindende proteiner fra væv Homogenatet i tilstedeværelse eller fravær af Ca 2 +. Resultaterne af denne simple metode vil fremme forståelsen af, hvordan proteiner kan interagere med Cam i en Ca 2 +-afhængig måde. Denne fremgangsmåde adskiller sig fra et almindeligt anvendt teknik i proteinbindingen undersøgelser, søjlekromatografi, idet CAM-sepharose perler er i opløsning i stedet fast i en matrix.
Undgå brug af en kolonne er en fordel ved denne fremgangsmåde, for uden den kolonne, protokollen er mindre tidskrævende, da der ikke er need for at faa en kolonne, eller vente på tyngdekraften flow-through. På grund af den kraft af dens effektivitet, CAM pull-down kræver væsentligt mindre væv end søjlekromatografi og forenkler prøveforberedelse, som adskillelse af celleaffald fra protein prøven kræver kun en kort centrifugering for CAM-sepharose pull down beskrevet. Kolonner kræver protein prøver, der er fri for enhver celleaffald, som kan kræve yderligere rensning trin. Denne fremgangsmåde har også fordele frem for andre pull down metoder, såsom co-immunoprecipitation, som kræver et antistof mod agn protein til at indfange dem og eventuelle interagerende proteiner i prøven. Brugen af et antistof til at fange agn protein kan være en begrænsning som dårlig interaktion mellem antistoffet og proteinet under forsøget kan føre til et ineffektivt trække ned. Disse potentielle problemer kan undgås ved brug af de beskrevne CAM-sepharose pull-down.
Men ligesomden fælles immunoprecipitation og søjlekromatografi assays, CAM-sepharose pull-down er begrænset til ex vivo-CAM-bindende. De opnåede resultater afspejler måske ikke in vivo virkelighed Cam interaktioner. For eksempel ofte post-translationelle modifikationer indvirkning protein interaktioner. Dette er tilfældet for neurogranin, hvis samspil med CAM er forhindret af PKC-medieret phosphorylering af sin IQ domæne 5. Homogenisering væv kunne ændre post-translationelle modifikationer for eksempel ved at tillade enzymer såsom kinaser og fosfataser at få adgang til target-proteiner, som normalt ville blive isoleret fra de enzymer i cellen. Forstyrrelse af lokalisering og / eller opdelingen kan også give mulighed for bindende, når de to proteiner, der normalt ikke ville have en chance for at interagere i cellen. For at minimere disse reaktioner, er det vigtigt at gemme samtlige prøver på is mellem forberedelse og pålæsning. Det er også af denne grund, at inkubation med perlerne er Done ved 4 ° C. Phosphatase hæmmere eller andre enzym-hæmmere kan også føjes til homogenisering buffere til at hjælpe med at begrænse deres virkninger.
En positiv kontrol er vigtigt for dette eksperiment for at sikre, at ingen væsentlige fejl opstod under forsøget. Det kan også sikre, at forskelle i forholdene var tilstrækkeligt til at forårsage konformationelle ændringer i Cam, som gør det muligt at binde forskellige proteiner i nærvær og fravær af Ca 2 +. For eksempel, hvis der ikke er noget signal til protein af interesse kan det skyldes, at lastning fejl eller andre potentielle fejl. Sondering for et andet protein kendt for at binde i de øvrige betingelser (som f.eks CaMKII i det medfølgende eksempel) kan hjælpe med at løse potentielle fejl. Lavt Ca 2 + eller Ca 2 + kelator (fx EDTA) koncentrationer kan også forstyrre forventede resultater. EDTA har været anvendt med succes, men andre Ca 2 + kelering (f.eks EGTA) kan være mere effektiv, hvis endnu højere concentrationer er ineffektive. Overdreven CAM-bindende protein kan også føre til uventede resultater, da det kan mætte de tilgængelige CAM-sepharose perler, der forårsager eluering af det protein, når det skal være bundet. Dette ses i det viste eksempel som en forholdsvis lille mængde af GFP-Ng elueres i EDTA-tilstand. Kvantificering af protein, før inkubation med perler kan afhjælpe dette.
Korrekt forberedelse og håndtering af CAM-sepharose perler hele eksperimentet er også afgørende for succes. Perler kan nemt gå tabt i løbet af eksperimentet, enten utilsigtet fjernes med supernatanten skal kasseres eller sidder fast på siderne og toppen af 2,0 ml rør. Dette kan undgås ved hjælp af forsigtighed og samtidig fjerne supernatant og sikre grundig blanding umiddelbart før centrifugering. Prøv ikke at lade prøverne sidde mellem blanding og centrifugering, da det giver mulighed for CAM-sepharose perler til tørre på siderne af glasset. Som en forebyggende foranstaltning, resuspender perler og roTate løsning omkring røret for at våde perler umiddelbart før centrifugering. Grundig nedsænkning af prøverne med perler under både bindende og eluering inkubationer er meget vigtigt. Uden passende blanding af prøven med perler, vil bindende og eluering sandsynligvis være ineffektive.
Denne protokol er alsidig og kan nemt ændres til andre formål. Udførelse af dette eksperiment med afkortet eller muterede proteiner kan afsløre oplysninger om regionen (erne) og rester af det protein, der er vigtige for Cam bindende og Ca 2 +-afhængighed, hvis de observeres. I tilfælde af Ng, var vi i stand til at vise, at GFP-Ng, som den endogene protein, binder Cam kun i mangel af Ca 2 + 8. For yderligere at udforske denne funktion af denne binding, forskellige mutationer af dette protein ændre dets IQ-domæne bidrage til at forstå karakteren af Ng samspil med CAM samt funktionen af post-translationelle modifikationer, som ændrer denne vekselvirkningIndsatsen. Vi testede, hvor vigtigt det Ng-CAM bindende ved hjælp af to forskellige mutanter: en phosphomimic aspartat i stedet for en serin (S36D eller NG-SD) og en IQ-mindre Ng at forhindre binding til CAM. Vi har også genereret et mutant (Ng-SFAW), der har forbedret binding til Cam, der opholder sig bundet selv ved tilstedeværelse af Ca 2 +. Endelig har vi brugt en ikke-phosphorylatable mutant (Ng-SA), som binder sig til Cam i en Ca 2 +-afhængige mode ligner endogene Ng, men forhindrer fosforylering fra protein kinase C (PKC). CAM pull-down assay hjulpet med at teste funktionaliteten af disse forskellige mutanter og hjalp viser vigtigheden af Ng-CAM bindende i synaptic funktion 8, og hvordan Ng phosphorylering hjælper finjustere synaptiske plasticitet 15.
Desuden kan proteiner, der binder sig til CAM-bindende proteiner kan elueret. Dette kunne give yderligere ansøgninger af denne analyse ved fastlæggelsen af proteiner, der indirekte binder CAM. Det gør det muligt at studere disse andre interagererioner og andre potentielle nedstrøms effekter af KAB og dets bindende partnere.
Sammenfattende giver Cam pull-down assay en effektiv og effektiv måde at undersøge Ca 2 +-afhængighed af CAM-protein interaktioner. Dette kan være et vigtigt redskab til at studere CAM-protein interaktioner, og hvordan forskellige mutationer eller ændringer kan påvirke disse interaktioner. Dette kan være værdifulde i at udforske regulering af Ca 2 + / CAM signalveje. Desuden kan vi bruge dette til at udforske patologier forårsaget af forstyrrelser i Ca 2 + / CAM signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Tiffany Cherry i hendes hjælp til at optimere denne protokol. Dette arbejde blev finansieret af National Institute of Aging (AG032320) samt fremme en sundere Wisconsin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calmodulin-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0529-01 | |
| Anti-CamKII alpha | Sigma-Aldrich | C6974 | |
| Anti-neurogranin | EMD Millipore | 07-425 | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-138 | Use for aspiration of supernatants |
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-146 | Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads |
References
- Vincenzi, F. F. Calmodulin in the regulation of intracellular calcium. Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).
- Cheung, W. Y. Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation. Science. 207, 19-27 (1980).
- Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin. Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).
- Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein. J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).
- Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain. Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).
- Bahler, M., Rhoads, A. Calmodulin signaling via the IQ motif. FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).
- Routtenberg, A. Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth. Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).
- Needham, D. M. Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction. Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).
- Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).
- Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain. J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).
- Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).
- Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes. Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).
- Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides. Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
