Summary
Calmoduline (CaM) pull-down test est un moyen efficace pour étudier l'interaction de la CAM avec diverses protéines. Cette méthode utilise la CaM-sépharose perles pour une analyse efficace et spécifique des protéines liant la CaM. Cela fournit un outil important d'explorer de signalisation CAM dans la fonction cellulaire.
Abstract
Le calcium (Ca 2 +) est un ion essentiel dans la régulation de la fonction cellulaire à travers une variété de mécanismes. Beaucoup de Ca 2 + de signalisation est médiée par la protéine liant le calcium connu comme la calmoduline (CaM) 1,2. Cam est impliqué à plusieurs niveaux dans presque tous les processus cellulaires, y compris l'apoptose, le métabolisme, la contraction des muscles lisses, la plasticité synaptique, la croissance des nerfs, l'inflammation et la réponse immunitaire. Un certain nombre de protéines aident à réguler ces voies grâce à leur interaction avec la CaM. Beaucoup de ces interactions dépendent de la conformation de came, qui est nettement différente lorsqu'il est lié à Ca 2 + (Ca 2 +-CaM) par opposition à sa Ca 2 + sans état (ApoCaM) 3.
Alors que la plupart des protéines cibles se lient Ca 2 +-CaM, certaines protéines ne se lient à ApoCaM. Certains CaM lient par leur QI-domaine, y compris neuromodulin 4, neurogranine (Ng) 5, et certaines myosines
Les effets de ces protéines sur la fonction cellulaire sont souvent dépendants de leur capacité à se lier à Cam dans un Ca 2 +-dépendante. Par exemple, nous avons testé la pertinence de Ng-CAM obligatoire dans la fonction synaptique et la façon dont les mutations affectent différentes cette liaison. Nous avons généré une con-GFP taggés Ngstruct avec des mutations spécifiques dans le IQ-domaine qui allait changer la capacité de se lier Ng CAM dans une Ca 2 +-dépendante. L'étude de ces différentes mutations nous a donné une grande perspicacité dans les processus importants impliqués dans la fonction synaptique 8,15. Cependant, dans de telles études, il est essentiel de démontrer que les protéines mutées ont altéré la liaison prévue à Cam.
Ici, nous présentons une méthode pour tester la capacité des protéines à se lier à Cam en présence ou en absence de Ca 2 +, en utilisant CaMKII et Ng comme exemples. Cette méthode est une forme de chromatographie d'affinité appelé CaM déroulant dosage. Il utilise la CaM-Sépharose perles de tester les protéines qui se lient à came et l'influence de Ca 2 + sur cette liaison. Il est temps considérablement plus efficace et nécessite moins de protéine par rapport à la chromatographie colonne et d'autres épreuves. Au total, cela donne un outil précieux pour explorer Ca 2 + de signalisation Cam / et de protéines que dansteract avec Cam.
Protocol
Reportez-vous à la Figure 1 pour un schéma de base de la procédure depuis le broyat. Estimation du temps de la préparation d'extraits cellulaires à élution de protéines liées CaM est d'environ six à sept heures.
1. Préparation des tissus
- Injecter organotypiques coupes d'hippocampe par un virus contenant un plasmide exprimant la protéine recombinante d'intérêt (dans cet exemple, la protéine fluorescente verte (GFP)-taggés Ng) et permettent d'exprimer des protéines des tissus pendant la nuit.
- Environ 12 à 18 heures après l'injection virale (selon le temps d'expression viral), se préparent à recueillir les tissus. Ajouter 1ml de tampon de dissection (glucose 10 mM, 4mm KCl, NaHCO3 26mm, 233mm de sucrose, 5 mM MgCl 2, CaCl 2 1mM, et 0,1% de phénol-rouge, gazés avec 5% de CO 2 de 95% O 2) pour une boîte de Pétri. Transfert de cultures de tissus / insert pour boîte de Pétri et ajouter du tampon de dissection 2mL à l'insertion de submerger le tissu.
- Collect organotypiques de tissu hippocampique (entre 5 et 10 tranches) en grattant doucement le tissu libre de la membrane d'insérer à l'aide d'un scalpel. Plus précisément enlever une région d'intérêt particulier (par exemple CA1) est également une option. Transfert des tissus suspendus à un tube à centrifuger de 1,5 ml en utilisant une pipette Pasteur inversé.
- Centrifuger les échantillons à 1.500 rcf pendant 1 min pour séparer les tissus provenant de la mémoire tampon de la dissection. Retirez délicatement le surnageant par aspiration. Veillez à ne pas perturber le culot.
- Pour chaque tranche utilisée, ajouter 30 à 60 uL de tampon d'homogénéisation (150mm de NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 1 mM de DTT, 1μg/mL leupeptine, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antidouleur, pepstatine 1μg/mL, et 1% de Triton X -100) au tissu et homogénéiser soigneusement avec un pilon.
- Afin d'éliminer les débris cellulaires, centrifuger l'homogénat restant à 1100 rcf pendant 10 min et retirez soigneusement le surnageant par aspiration, tout en évitant la contamination par le culot.
- Prenez 10% de surnageant comme un échantillon de l'entrée (échantillon 1). Stocker le surnageant restant sur la glace pendant la préparation des billes de CaM-sépharose pour une utilisation à l'étape 3.
Remarque: Le tissu utilisé ici sont organotypiques coupes d'hippocampe. Toutefois, on pourrait utiliser des neurones dissociés ou toute autre cellule du système de culture. Dans un tel cas, commencer à l'étape 1.4, après la collecte de vos tissus de la manière appropriée.
2. Préparation des billes pour les pull-down
Dans la manipulation des perles, il est important de récupérer les perles et de maximiser l'efficacité des réactions en empêchant les perles de sécher sur les parois du tube. Pour ce faire, il est préférable de faire tourner vos tubes de leur côté, permettant solution pour mouiller les perles sur les parois du tube, immédiatement avant la centrifugation.
- Pour chaque menu déroulant, une pipette 400 pi de suspension calmoduline-sépharose billes dans un microtube de 2 mL avec un fla relativementT-bas pour maximiser la surface et l'interaction de vos solutions avec les perles pendant votre incubations.
- Centrifugeuse à 21000 rcf perles pendant 30 secondes et retirer délicatement le surnageant par aspiration. Assurez-vous de ne pas déranger les perles.
- Pour laver les perles, ajouter 100 ul du tampon d'homogénéisation respectifs contenant soit 2 mM de CaCl2 à ceux qui sont utilisés pour tirer vers le bas Ca 2 +-CaM protéines de liaison et 2 mM d'EDTA (un chélateur connue Ca 2 +) pour les perles tirant vers le bas protéines ApoCaM contraignant. Tapoter légèrement le tube pour remettre en suspension des perles et centrifuger à 1500 rcf pendant 1 min. Retirez délicatement le surnageant par aspiration, en veillant à ne pas perturber les perles.
Note: Pour toutes les étapes d'aspiration, il est recommandé d'utiliser un embout de pipette qui a une ouverture fine (par exemple des conseils de chargement de gel) pour permettre le retrait de la solution sans avoir à retirer des perles.
3. CaM-sépharose liaison des protéines
- Divisez votre surnageant dans deux conditions contenant un volume égal. Selon votre condition, ajouter la quantité appropriée de CaCl 2 ou de l'EDTA à votre surnageant jusqu'à 2 mM de concentration pour chacun.
- Ajouter surnageant de l'étape de 1,7 à billes lavées en tampon d'homogénéisation correspondante. Tapoter légèrement le tube pour mélanger.
- Incuber les échantillons à 4 ° C pendant 3 heures sur un agitateur. Re-suspendre des perles toutes les 30 min environ pour accroître l'efficacité de la liaison.
- Tube à centrifuger contenant des échantillons et des perles à 1.500 rcf pendant 3 min.
- Prenez 50 pl de surnageant comme un échantillon de protéine non liée (échantillon 2) et retirer délicatement le surnageant restant par aspiration et le jeter.
- Lavez perles trois fois comme décrit dans l'étape 2.3 en utilisant 100 pi de tampon d'homogénéisation respectifs.
4. Élution
- Ajouter 50 pl de tampon d'élution (50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl et 150 mm) contenant la condition opposée (10 mM CACL 2 ou 10mm EDTA) aux billes. Par exemple, les échantillons qui ont été homogénéisés et lié dans un tampon contenant Ca 2 + sont élués dans le tampon d'élution contenant de l'EDTA et vice-versa.
En option: le réchauffement du tampon d'élution à 37 ° C avant d'ajouter à billes peuvent améliorer le rendement.
- Incuber solution avec des perles à la température ambiante pendant 30 min sur un agitateur. Mélanger les perles en tapotant délicatement le tube environ toutes les 5 min.
- Centrifuger à 1500 fcr perles pendant 3 min et retirez délicatement le 50 pl de surnageant pour la protéine liée (échantillon 3) par aspiration. Assurez-vous de ne pas déranger les perles.
- Ajouter tampon de chargement de protéines pour tous les échantillons (c.-à homogénat, traitées et non traitées des protéines ainsi que ceux qui sont encore lié aux billes).
Remarque: Afin de maximiser l'élution (en particulier dans le cas d'élution inefficace), ajouter 50 pl du tampon d'élution correspondant (par exemple en ajoutant EDTA buf contenantFer à perles liés au CaCl 2) aux billes avant de chauffer les échantillons pour aider à éluer toutes les protéines restant liés et répétez les étapes décrites à la section 4.3 pour enlever les protéines liées.
5. SDS-PAGE et Western blot
Conduite SDS-PAGE et Western blot en utilisant l'analyse par sondage pour votre protéine d'intérêt et de la sonde pour une protéine connue pour se lier CAM dans la condition opposée comme un contrôle positif.
6. Les résultats représentatifs
La figure 2B représente un exemple d'un dosage de la CaM-pull-down test de la liaison de la CaM de GFP-Ng marqués par rapport à Ng endogène. Pour ce faire, GFP-Ng a été surexprimé dans notre organotypiques coupes d'hippocampe pendant la nuit et le tissu a été homogénéisé. L'homogénat a été incubé avec Cam-sépharose billes en présence soit de Ca 2 + ou de l'EDTA. Entrée homogénat montre que la GFP-Ng a été exprimé, en plus de endogènes Ng et Ca 2 + / CaM-kinase dépendante II(CaMKII). Comme attendu basé sur la liaison connue de Ng endogènes (illustré dans la Fig. 2A), la GFP-tagged Ng a été élue en l'absence de Ca 2 + (EDTA lié aux protéines) et non lié à la présence de Ca 2 + (figure 2B) . En revanche, le contrôle, CaMKII, a été élue uniquement en présence de Ca 2 + (protéines) et a été détaché dans son absence (EDTA). Cela montre que les perles étaient CaM fonctionne correctement et le élutions ont été efficaces. Plus important encore, cela montre que la GFP-Ng se lie à ApoCaM d'une façon similaire à la forme endogène, ce qui suggère que la balise GFP ne modifie pas la fonction de notre protéine recombinante.
Figure 1. Schéma de la CAM pull-down assay
(A) homogénat tissulaire est centrifugé pour enlever les débris cellulaires. Environ 10% du surnageant est pris comme un échantillon de l'entrée (1). Le surnageant restant est divisé de manière égale pour les différentsconditions et les réactifs appropriés (CaCl 2 ou EDTA) sont ajoutés au test de liaison dans ces conditions. Chaque surnageant (contenant soit CaCl 2 ou EDTA) est chargé sur le prêt, respectivement CaM-sépharose perles et (B) incubée pour permettre la liaison. Les protéines non liées sont éliminées (2) et (C) les protéines liées (3) sont élués hors des perles à l'aide du tampon d'élution (EB) contenant la condition opposée comme la liaison. La composition protéique de ces trois échantillons de protéines peuvent être analysées par SDS-PAGE et Western blot.
Figure 2. A.) Schéma de Ca 2 +-dépendante contraignante Cam et élution dans les exemples de dosage déroulant sont donnés des deux types de protéines qui se lient dans une CaM Ca 2 +-dépendante. Neurogranine (Ng) représente protéines qui se lient apo-Cam et CaMKII représente les protéines qui se lient à Ca 2 + richesCaM. Cam est représenté dans son état dissocié avant incubation avec les protéines d'homogénat. Une fois mis en incubation dans des conditions de haute concentration de Ca 2 + (2 mM) ou en présence d'un chélateur de Ca 2 +, l'EDTA (2 mM), les protéines se lient à la CaM conséquence. Ng lie CaM dans l'état de l'EDTA comme il ya peu ou pas de Ca 2 + présent, et serait élué hors les perles CaM-sépharose, en présence de Ca 2 +. CaMKII, cependant, se lierait à Cam, en présence de quantités élevées de Ca 2 + et serait dissocier une fois que le Ca 2 + a été chélaté.
B.) Les résultats de la CaM exemple déroulant dosage. Ce chiffre démontre le résultat final attendu d'une came-sépharose tirer vers le bas avec les échantillons sondé pour Ng et CaMKII. Tant l'Ng endogènes et GFP-Ng sont présents dans les ruelles de protéines liées à la CAM en présence d'EDTA. Pas Ng est lié lorsque les échantillons sont incubés avec Cam, en présence de Ca 2 +, ce qui démontre que Ng ne lie que l'apo-CAM. Notre contrôle positif, CaMKII, d'autre part, se lie à la CaM seulement en présence de Ca 2 +.
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Discussion
Le protocole fourni utilise CaM-sépharose perles pour enquêter sur le Ca 2 +-dépendance de la CaM des protéines de liaison. De nombreuses protéines se lient dans une CaM Ca 2 +-dépendante. Ces interactions sont d'une grande importance étant donné le nombre de CaM des protéines de liaison et leur rôle crucial dans de nombreuses voies de signalisation. Dans ce protocole, Cam-sépharose perles sont utilisées pour séparer des protéines de liaison de la CaM d'homogénat de tissu en présence ou en absence de Ca 2 +. Les résultats de cette approche simple permettra de mieux comprendre comment les protéines peuvent interagir avec Cam dans un Ca 2 +-dépendante. Cette approche diffère d'une technique couramment utilisée dans les études de liaison des protéines, chromatographie sur colonne, en ce que les billes CaM-sépharose sont en solution, plutôt que fixes dans une matrice.
Éviter l'utilisation d'une colonne est un avantage de cette approche, parce que sans la colonne du protocole est moins de temps, car il n'ya pas NEed pour équilibrer une colonne ou d'attendre la gravité accréditives. En raison de la vertu de son efficacité, la came déroulant nécessite des tissus nettement inférieur Chromatographie sur colonne et simplifie la préparation des échantillons, la séparation des débris cellulaires de l'échantillon de protéine nécessite seulement une centrifugation courte pour la CAM-sépharose déroulant décrit. Colonnes nécessitent des échantillons de protéines qui sont libres de tout débris cellulaires, ce qui peut nécessiter des étapes de purification supplémentaires. Cette approche a également des avantages sur les autres tirez des méthodes, telles que la co-immunoprécipitation, ce qui nécessite un anticorps contre la protéine appât pour le capturer et de toutes les protéines qui interagissent dans l'échantillon. L'utilisation d'un anticorps pour capturer la protéine appât peut être une limitation que les interactions entre les pauvres d'anticorps et les protéines lors de l'expérience peut conduire à une inefficacité tirez vers le bas. Ces problèmes potentiels sont évités avec l'utilisation de la CaM-sépharose décrite déroulant.
Cependant, commela co-immunoprécipitation et des dosages Chromatographie sur colonne, la came-sépharose déroulant est limitée à ex vivo CaM-contraignant. Les résultats obtenus peuvent ne pas refléter la réalité dans les interactions in vivo de la CaM. Par exemple, modifications post-traductionnelles ont souvent une incidence interactions entre protéines. C'est le cas pour les neurogranine, dont l'interaction avec CaM est empêchée par la PKC-phosphorylation médiée de son domaine de QI 5. Homogénéisation des tissus pourrait altérer modifications post-traductionnelles par exemple en permettant des enzymes telles que des kinases ou phosphatases d'accéder à des protéines cibles qui devraient normalement être isolés à partir des enzymes dans la cellule. La perturbation de la localisation et / ou la compartimentation pourrait également permettre la liaison lorsque les deux protéines normalement n'auraient pas la chance d'interagir dans la cellule. Afin de minimiser ces réactions, il est important de stocker tous les échantillons sur glace entre la préparation et le chargement. C'est aussi pour cette raison que l'incubation avec les billes est Done à 4 ° C. Inhibiteurs de phosphatase ou d'autres inhibiteurs de l'enzyme peut également être ajoutés aux tampons homogénéisation pour aider à limiter leurs effets.
Un contrôle positif est important pour cette expérience pour s'assurer qu'aucune erreur ne s'est produite significative pendant l'expérience. Il peut également s'assurer que les différences dans les conditions étaient suffisantes pour provoquer des changements de conformation de came, ce qui lui permet de lier différentes protéines en présence et en absence de Ca 2 +. Par exemple, si il n'ya pas de signal pour la protéine d'intérêt, il pourrait être dû à une erreur de chargement ou d'autres erreurs potentielles. Sondage pour une autre protéine connue pour se lier dans les autres conditions (comme CaMKII dans l'exemple fourni) peut aider à résoudre les erreurs potentielles. Faible Ca 2 + ou Ca 2 + chélateur (par exemple EDTA) sur les concentrations peuvent également interférer avec les résultats attendus. L'EDTA a été utilisé avec succès, mais d'autres chélateurs du Ca 2 + (par exemple, EGTA) peut être plus efficace si CONCENTRAT encore plus élevésions sont inefficaces. Excessive CaM-binding protein peut aussi conduire à des résultats inattendus comme il peut saturer les disponibles CaM-sépharose perles, causant d'élution de la protéine quand elle doit être liée. Cela se voit dans l'exemple illustré comme une quantité relativement faible de la GFP-Ng est élue dans la condition d'EDTA. Quantification des protéines avant l'incubation avec des perles peut aider à améliorer cela.
Une bonne préparation et de manipulation des billes de sépharose-CaM long de l'expérience est également essentielle à la réussite. Perles peuvent facilement être perdus lors de l'expérience, soit retiré par inadvertance avec le surnageant d'être jetés ou collés sur les côtés et le haut du tube de 2,0 ml. Ceci peut être évité en utilisant la prudence lors de la suppression surnageant et assurer un mélange intime immédiatement avant la centrifugation. Essayez de ne pas laisser les échantillons se situent entre le mélange et centrifugation, car elle permet de CaM-sépharose perles à sécher sur les côtés du tube. Par mesure de précaution, des perles resuspendre et rosolution de Tate autour du tube à billes humides immédiatement avant la centrifugation. D'immersion approfondie des échantillons avec les perles lors de la fixation et deux incubations élution est très important. Sans mélange adapté de l'échantillon avec les perles, de reliure et d'élution sera probablement inefficace.
Ce protocole est polyvalent et peut facilement être modifié pour d'autres fins. Effectuer cette expérience avec des protéines tronquées ou mutées peuvent révéler des informations sur la région (s) et les résidus de la protéine qui sont importants pour la CaM contraignant et Ca 2 +-dépendance, si elle est observée. Dans le cas de Ng, nous avons pu montrer que la GFP-Ng, comme la protéine endogène, se lie CaM seulement en l'absence de Ca 2 + 8. Pour explorer davantage cette fonction de cette liaison, différentes mutations de cette protéine altérer son QI-domaine aident à comprendre la nature de l'interaction Ng avec CAM ainsi que la fonction de modifications post-traductionnelles, qui altèrent cette interaction. Nous avons testé l'importance de Ng-CAM liaison en utilisant deux mutants différents: un aspartate phosphomimic en place d'une sérine (S36D ou NG-SD) et un QI moins-Ng à empêcher la liaison de la CaM. Nous avons également généré un mutant (Ng-SFAW) qui a renforcé liant à Cam, en restant liés, même en présence de Ca 2 +. Enfin, nous avons utilisé un mutant non phosphorylable (Ng-SA) qui se lie à la CaM dans un Ca 2 +-dépendante de la mode similaire à Ng endogènes, mais empêche la phosphorylation de la protéine kinase C (PKC). Le CAM déroulant test aidé à tester la fonctionnalité de ces différents mutants et a contribué à montrer l'importance de Ng-CAM obligatoire dans la fonction synaptique et la manière dont 8 phosphorylation Ng aide affiner la plasticité synaptique 15.
En outre, les protéines qui se lient à des protéines de liaison de la CaM pourrait être élue. Cela pourrait fournir d'autres applications de ce test dans la détermination des protéines qui se lient indirectement CaM. Il permet l'étude de ces interactions d'autresions et d'autres effets en aval de Cam et ses partenaires de liaison.
En résumé, la came déroulant test fournit un moyen efficace et efficaces pour enquêter Ca 2 +-dépendance de la CaM-protéines. Cela peut être un outil important pour étudier les interactions protéine-CaM et comment différentes mutations ou modifications peuvent affecter ces interactions. Cela peut être utile dans l'exploration de la régulation du Ca 2 + / CaM voies de signalisation. Par ailleurs, nous pouvons l'utiliser pour explorer les pathologies causées par des perturbations de Ca 2 + / CaM signalisation.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Tiffany cerise dans son aide à l'optimisation de ce protocole. Ce travail a été financé par l'Institut national du vieillissement (AG032320) ainsi que l'avancement une meilleure santé du Wisconsin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calmodulin-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0529-01 | |
| Anti-CamKII alpha | Sigma-Aldrich | C6974 | |
| Anti-neurogranin | EMD Millipore | 07-425 | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-138 | Use for aspiration of supernatants |
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-146 | Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads |
References
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