Summary
Calmodulin (CAM) pull-down-analysen er en effektiv måte å undersøke samspillet av Cam med ulike proteiner. Denne metoden bruker CAM-sepharose perler for effektiv og spesifikk analyse av CAM-bindende proteiner. Dette gir et viktig verktøy for å utforske Cam signalering i cellulære funksjon.
Abstract
Kalsium (Ca 2 +) er et ion viktig i regulering cellular funksjon gjennom en rekke mekanismer. Mye av Ca 2 + signalering er formidlet gjennom kalsium-bindende protein kalt calmodulin (CAM) 1,2. Cam er involvert på flere nivåer i nesten alle cellulære prosesser, herunder apoptose, metabolisme, glatt muskel sammentrekning, synaptisk plastisitet, nerve vekst, betennelse og immunrespons. En rekke proteiner bidra til å regulere disse banene gjennom deres interaksjon med Cam. Mange av disse interaksjonene avhengig av konformasjon av Cam, som er tydelig forskjellig når bundet til Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) i motsetning til sin Ca 2 +-Free State (ApoCaM) 3.
Mens de fleste target proteiner binde Ca 2 +-Cam, visse proteiner bare binder seg til ApoCaM. Noen binder CAM gjennom sine IQ-domene, inkludert 4 neuromodulin, neurogranin (Ng) 5, og visse myosins
Effektene av disse proteinene på cellular funksjon er ofte avhengig av deres evne til å binde seg til Cam i en Ca 2 +-avhengig måte. For eksempel, testet vi relevansen av Ng-CAM bindende i synaptiske funksjon og hvordan ulike mutasjoner påvirker dette bindende. Vi genererte en GFP-merket Ng construct med spesifikke mutasjoner i IQ-domene som ville endre evne til Ng å binde Cam i en Ca 2 +-avhengig måte. Studiet av disse ulike mutasjoner ga oss god innsikt i viktige prosesser involvert i synaptic funksjon 8,15. Men i slike studier, er det viktig å vise at de muterte proteinene har forventet endret binding til Cam.
Her presenterer vi en metode for testing evne til proteiner til å binde til CAM i nærvær eller fravær av Ca 2 +, med CaMKII og Ng som eksempler. Denne metoden er en form for tilhørighet kromatografi referert til som en CAM pull-down analysen. Den bruker CAM-Sepharose perler å teste proteiner som binder seg til CAM og påvirkning av Ca 2 + på denne bindingen. Det er betydelig mer tidseffektiv og krever mindre protein i forhold til kolonne kromatografi og andre analyser. Samlet gir dette et verdifullt verktøy for å utforske Ca 2 + / CAM signalering og proteiner som iteract med Cam.
Protocol
Se figur 1 for en grunnleggende skjematisk av prosedyren begynner med homogenate. Beregnet tid fra forberedelse av mobilnettet ekstrakter til eluering av CAM-bundet proteiner er rundt seks til syv timer.
1. Tissue forberedelse
- Injiser organotypic hippocampus skiver med et virus som inneholder et plasmid uttrykker rekombinant protein av interesse (i dette eksempelet, grønt fluorescerende protein (GFP)-merket Ng) og la vevet å uttrykke protein over natten.
- Omtrent 12 til 18 timer etter viral injeksjon (avhengig av viral uttrykk tid), forberede seg til å samle vev. Legg til 1 ml disseksjon buffer (10mm glukose, 4mm KCl, 26mm NaHCO3, 233mM sukrose, 5mm MgCl 2, 1mm CaCl 2, og 0,1% fenol-rød, gasset med 5% CO 2 95% O 2) til en petriskål. Transfer dyrkede vevet / inn til petriskål og tilsett 2ml disseksjon buffer til innsatsen å senke vev.
- Innsamlingt organotypic hippocampus vev (mellom 5 og 10 skiver) ved å forsiktig skrape vevet fri for innsatsen membranen ved hjelp av en skalpell. Spesielt å fjerne en bestemt region av interesse (f.eks CA1) er også et alternativ. Overfør suspendert vevet til en 1.5mL mikrosentrifuge tube bruker en invertert Pasteur pipette.
- Sentrifuger prøver ved 1500 RCF for 1 min å skille vev fra disseksjon buffer. Fjern forsiktig supernatanten ved aspirasjon. Pass på ikke å forstyrre pelleten.
- For hver skive brukes, legge 30-60 mL av homogenisering buffer (150mm NaCl, 20 mm Tris 7,5 pH, 1mm DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antipain, 1μg/mL pepstatin, og 1% Triton X -100) til vev og homogenisere grundig med stampe.
- For å fjerne mobilnettet rusk, sentrifuger de resterende homogenate 1100 RCF i 10 min og forsiktig fjerne supernatanten ved aspirasjon mens unngå forurensning fra pellet.
- Ta 10% av supernatanten som et eksempel på inngang (utvalg 1). Oppbevar den gjenværende supernatanten på is under forberedelse av CAM-sepharose perler til bruk i trinn 3.
Merk: vev som brukes her er organotypic hippocampus skiver. Men man kunne bruke dissosiert nevroner eller andre celledyrking system. I et slikt tilfelle, begynner du med trinn 1.4 etter samle vev på hensiktsmessig måte.
2. Utarbeidelse av perler for pull-down
I håndtering av perler, er det viktig å berge perler og maksimere effektiviteten av reaksjonene ved å hindre perler fra tørking på sidene av røret. For å gjøre dette, er det best å rotere rørene på sin side, slik løsning våt perlene på veggene av røret, umiddelbart før sentrifugering.
- For hver pull-down, pipette 400 mL av suspenderte calmodulin-Sepharose perler i en 2 mL mikrosentrifuge tube med en relativt FLAt-bunn for å maksimere areal og samhandling av dine løsninger med perlene under inkubasjoner.
- Sentrifuger perler på 21 000 RCF i 30 sekunder og forsiktig fjerne supernatanten ved aspirasjon. Sørg for ikke å forstyrre perlene.
- Å vaske perlene, tilsett 100 mL av de respektive homogenisering buffer som inneholder enten 2 mM CaCl 2 til de som blir brukt til å trekke ned Ca 2 +-Cam bindende proteiner og 2 mM EDTA (en kjent Ca 2 + chelator) for perler trekke ned ApoCaM bindende proteiner. Forsiktig på røret for å re-suspendere perler og sentrifuger ved 1500 RCF for 1 min. Fjern forsiktig supernatanten ved aspirasjon, og pass på ikke å forstyrre perlene.
Merk: For alle aspirasjon trinn, er det anbefalt å bruke en pipette tips som har en fin åpning (f.eks gel lasting tips) å tillate fjerning av løsningen uten å fjerne perler.
3. CAM-sepharose binding av proteiner
- Split din supernatanten i to forholdene som inneholder et likt volum. Avhengig av din tilstand, legger passende mengde CaCl 2 eller EDTA til supernatanten opptil 2 mM konsentrasjon for hver.
- Legg supernatant fra trinn 1,7 til perler vasket i tilsvarende homogenisering buffer. Forsiktig på røret for å blande.
- Inkuber prøver ved 4 ° C i 3 timer på en shaker. Re-suspendere perler hvert 30 min eller så å øke effektiviteten av bindende.
- Sentrifugerøret inneholder samples og perler på 1500 RCF for 3 min.
- Ta 50μL av supernatant som prøve av ubundet protein (prøve 2) og forsiktig fjerne de gjenværende supernatanten ved aspirasjon og kast.
- Vask perler tre ganger, som beskrevet i punkt 2.3 bruker 100μL av respektive homogenisering buffer.
Fire. Eluering
- Legg 50μL av eluering buffer (50mm Tris-HCl 7,5 pH, og 150mm NaCl) som inneholder det motsatte tilstanden (10mm CACL 2 eller 10mm EDTA) til perler. For eksempel prøver som ble homogenisert og bundet i buffer som inneholder Ca 2 + er elueres i eluering buffer som inneholder EDTA og vice-versa.
Valgfritt: Varmer de elueringsmiddel buffer til 37 ° C før du legger til perler kan øke avkastningen.
- Inkuber løsning med perler i romtemperatur i 30 min på en shaker. Bland perlene ved å forsiktig banke røret ca hvert 5 min.
- Sentrifuger perler på 1500 RCF for 3 min og fjern forsiktig 50μL av supernatanten for bundet protein (prøve 3) ved aspirasjon. Sørg for ikke å forstyrre perlene.
- Legg til protein lasting buffer til alle prøvene (dvs. homogenate, ubundet og bundet protein samt de fortsatt bundet til perler).
Merk: For å maksimere eluering (spesielt i tilfelle av ineffektive eluering), legger 50μL av tilsvarende elueringsmiddel buffer (f.eks legge EDTA som inneholder buffer til perler bundet i CaCl 2) til perlene før oppvarmingen prøver å hjelpe Eluer eventuelle gjenværende bundet protein og gjenta trinnene som er beskrevet i 4.3 for å fjerne gjenværende bundet proteiner.
5. SDS-PAGE og Western blot
Conduct SDS-PAGE og analysere bruk av western blot ved sondering for protein av interesse og probe for et protein kjent for å binde CAM i motsatt tilstand som en positiv kontroll.
Seks. Representant Resultater
Figur 2B viser et eksempel på en CAM-pull-down analysen teste CAM bindingen av GFP-merket Ng sammenlignet med endogen Ng. For å gjøre dette, var GFP-Ng overexpressed i vår organotypic hippocampus skiver natten og vevet var homogenisert. Den homogenate ble inkubert med CAM-sepharose perler i nærvær av enten Ca 2 + eller EDTA. Homogenate innspill viser at GFP-Ng ble uttrykt i tillegg til endogene Ng og Ca 2 + / CAM-avhengig kinase II(CaMKII). Som forventet basert på den kjente binding av endogene Ng (illustrert i fig. 2A), GFP-merket Ng var elueres i fravær av Ca 2 + (EDTA bundet protein) og ubundet i nærvær av Ca 2 + (Fig. 2B) . I kontrast, ble kontroll, CaMKII, elueres bare i nærvær av Ca 2 + (bundet protein) og var ubundet i sitt fravær (EDTA). Dette viser at CAM perler ble fungerer som den skal, og elutions var effektive. Viktigst, dette viser at GFP-Ng binder seg til ApoCaM på en lignende måte til endogene form, noe som antyder at GFP tag ikke endre funksjonen av våre rekombinant protein.
Figur 1. Omriss av CAM pull-down analysen
(A) Tissue homogenate er spunnet ned for å fjerne mobilnettet rusk. Omtrent 10% av supernatanten blir tatt som et eksempel på inngang (1). Den gjenværende supernatanten deles likt for de ulikeforhold og den aktuelle reagenser (CaCl 2 eller EDTA) er lagt for å teste bindende i disse betingelsene. Hver supernatanten (inneholder enten CaCl 2 eller EDTA) er lastet inn på henholdsvis forberedt CAM-sepharose perler og (B) inkubert å tillate binding. Ubundne proteiner er fjernet (2) og (C) bundet proteiner (3) er elueres ut av perlene bruke elueringsmiddel buffer (EB) som inneholder det motsatte tilstanden som bindende. Protein sammensetningen av disse tre protein prøver kan analyseres ved hjelp av SDS-PAGE og Western blot analyse.
Figur 2. A.) Skjematisk fremstilling av Ca 2 +-avhengige Cam bindende og eluering i pull-down analysen Eksempler er gitt av to typer proteiner som binder Cam i en Ca 2 +-avhengig måte. Neurogranin (Ng) representerer proteiner som binder apo-Cam og CaMKII representerer proteiner som binder seg til Ca 2 +-rikeCam. Cam er vist i sin dissosiert tilstand før inkubering med homogenate proteiner. Når inkubert under forhold med høy Ca 2 + konsentrasjon (2 mm) eller i nærvær av en Ca 2 + chelator, EDTA (2 mm), vil proteinene binde seg til Cam tilsvarende. Ng binder cam i EDTA stand som det er lite eller ingen Ca 2 + tilstede, og ville bli elueres av CAM-sepharose perler i nærvær av Ca 2 +. CaMKII, derimot, ville binde seg til CAM i nærvær av store mengder av Ca 2 + og ville distansere gang Ca 2 + var chelated.
B.) Resultater fra eksempel CAM pull-down analysen. Dette tallet viser det forventede sluttresultatet av en CAM-sepharose trekke ned med prøvene analysert for Ng og CaMKII. Både endogene Ng og GFP-Ng er til stede i de baner av proteiner bundet til CAM i nærvær av EDTA. Ingen Ng er bundet av når prøvene blir inkubert med Cam i nærvær av Ca 2 +, som viser at Ng binder bare apo-Cam. Vårt positive kontroll, CaMKII, derimot, binder seg til CAM bare i nærvær av Ca 2 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den leveres Protokollen benytter CAM-sepharose perler å undersøke Ca 2 +-avhengighet av CAM-bindende proteiner. Mange proteiner binder Cam i en Ca 2 +-avhengig måte. Disse interaksjonene er av stor betydning gitt antall CAM-bindende proteiner og deres kritiske rolle i mange signalveier. I denne protokollen, er CAM-sepharose perler brukes til å skille CAM-bindende proteiner fra vev homogenate i nærvær eller fravær av Ca 2 +. Resultatene av denne enkle tilnærming vil videre forståelsen av hvordan proteiner kan interagere med Cam i en Ca 2 +-avhengig måte. Denne tilnærmingen er forskjellig fra en vanlig teknikk i proteinbinding studier, kolonne kromatografi, ved at CAM-sepharose perler er i løsning fremfor fast i en matrise.
Unngå bruk av en kolonne er en fordel med denne tilnærmingen, fordi uten kolonnen protokollen er mindre tidkrevende, ettersom det ikke er need til stabilisering en kolonne eller vente på tyngdekraften gjennomstrømning. På grunn av den kraft av sin effektivitet, krever CAM pull-down betydelig mindre vev enn kolonnen kromatografi og forenkler prøveopparbeidelse, som separasjon av mobilnettet rusk fra protein prøven krever bare en kort sentrifugering for CAM-sepharose trekke ned beskrevet. Kolonner krever protein prøver som er fri for enhver cellulær rusk, som kan kreve ytterligere rensing trinn. Denne tilnærmingen har også fordeler fremfor andre pull down metoder, slik som co-immunoprecipitation, som krever et antistoff mot agnet protein å fange den og eventuelle samspill proteiner i prøven. Bruken av et antistoff for å fange agnet protein kan være en begrensning som dårlig samhandling mellom antistoffet og protein under forsøket kan føre til en ineffektiv trekke ned. Disse potensielle problemer blir unngått med bruk av den beskrevne CAM-sepharose pull-down.
Men, somco-immunoprecipitation og kolonne kromatografi analyser, CAM-sepharose pull-down er begrenset til ex vivo CAM-binding. Resultatene gjenspeiler ikke nødvendigvis de in vivo virkelighet Cam interaksjoner. For eksempel posttranslasjonelle modifikasjoner ofte innvirkning protein interaksjoner. Dette er tilfellet for neurogranin, der interaksjon med CAM hindres av PKC-mediert fosforylering av sin IQ domenenavn 5. Homogenisere vev kan endre posttranslasjonelle modifikasjoner for eksempel ved at enzymer som kinaser og fosfataser å få tilgang til target proteiner som normalt ville bli isolert fra de enzymene i cellen. Forstyrrelse av lokalisering og / eller compartmentalization kan også tillate bindende når to proteiner som normalt ikke ville ha en sjanse til å samhandle i cellen. For å minimalisere disse reaksjonene, er det viktig å oppbevare alle prøvene på is mellom forberedelse og lasting. Det er også av denne grunn at inkubasjon med perlene er done ved 4 ° C. Fosfatase-hemmere eller andre hemmere kan også legges til homogenisering buffere for å begrense deres effekter.
En positiv kontroll er viktig for dette eksperimentet for å kontrollere at ingen betydelige feil oppstod under forsøket. Det kan også sørge for at forskjeller i forholdene var tilstrekkelig til å forårsake bygningsmessige endringer i CAM, slik at det å binde forskjellige proteiner i nærvær og fravær av Ca 2 +. For eksempel, hvis det ikke er signal for protein av interesse, kan det være grunn til lasting feil eller andre potensielle feil. Undersøkelser for et annet protein kjent for å binde i andre forhold (som CaMKII i eksempelet forutsatt) kan bidra til å løse potensielle feil. Lav Ca 2 + eller Ca 2 + chelator (f.eks EDTA) konsentrasjoner kan også forstyrre forventede resultater. EDTA har vært brukt med hell, men andre Ca 2 + kelater (f.eks EGTA) kan være mer effektive hvis de enda høyere concentrationer er ineffektiv. Overdreven CAM-bindende protein kan også føre til uventede resultater som det kan mette de tilgjengelige CAM-sepharose perler, forårsaker eluering av protein når den skal være bundet. Dette er sett i vist eksempel som en relativt liten mengde av GFP-Ng er elueres i EDTA tilstand. Kvantifisering av protein før inkubasjon med perler kan hjelpe forbedre dette.
Riktig forberedelse og håndtering av CAM-sepharose perler hele eksperimentet er også viktig for å lykkes. Perler kan lett gå tapt under forsøket, enten utilsiktet fjernet med supernatanten skal kastes eller fast på sidene og toppen av 2,0 ml tube. Dette kan unngås ved forsiktighet mens du fjerner supernatanten og sikre grundig blanding umiddelbart før sentrifugering. Prøv å ikke la prøvene sitte mellom miksing og sentrifugering som det lar CAM-sepharose perler til tørk på sidene av røret. Som et forebyggende tiltak, resuspender perler og roTate løsning rundt røret for å våte perler umiddelbart før sentrifugering. Grundig nedsenking av prøvene med perler både under bindende og elueringsmiddel inkubasjoner er svært viktig. Uten passende blanding av prøven med perler, vil bindende og eluering trolig være ineffektiv.
Denne protokollen er allsidig og kan enkelt endres til andre formål. Utføre dette eksperimentet med avkortet eller muterte proteiner kan avsløre informasjon om regionen (e) og rester av proteinet som er viktige for Cam binding og Ca 2 +-avhengighet, hvis observert. I tilfelle av Ng, kunne vi vise at GFP-Ng, som endogene proteinet binder Cam bare i fraværet av Ca 2 + 8. For ytterligere å utforske denne funksjonen av denne bindingen, forskjellige mutasjoner av dette proteinet endre sin IQ-domene hjelp til å forstå arten av Ng interaksjon med Cam samt funksjon av posttranslasjonelle modifikasjoner, som endrer denne interaDette skjer. Vi testet viktigheten av Ng-CAM binding med to forskjellige mutanter: en phosphomimic aspartat i stedet for en serine (S36D eller Ng-SD) og en IQ-mindre Ng å hindre binding til Cam. Vi har også generert en mutant (Ng-SFAW) som har forbedret binding til Cam, bor bundet selv i nærvær av Ca 2 +. Til slutt brukte vi en ikke-phosphorylatable mutant (Ng-SA) som binder seg til Cam i en Ca 2 +-avhengig mote lik endogene Ng men hindrer fosforylering fra protein kinase C (PKC). CAM pull-down analysen hjalp teste funksjonaliteten til disse forskjellige mutanter og hjalp viser viktigheten av Ng-CAM binding i synaptiske funksjon 8 og hvordan Ng fosforylering hjelper finjustere synaptisk plastisitet 15.
I tillegg kan proteiner som binder seg til CAM-bindende proteiner være elueres. Dette kan gi ytterligere anvendelser av denne analysen i å bestemme proteiner som indirekte binder Cam. Det gjør studiet av disse andre samhandleioner og andre potensielle nedstrøms effekter av Cam og dets binding partnere.
Oppsummert gir CAM pull-down analysen en effektiv måte å undersøke Ca 2 +-avhengighet av CAM-protein interaksjoner. Dette kan være et viktig verktøy for å studere CAM-protein interaksjoner og hvordan ulike mutasjoner eller modifikasjoner som kan påvirke disse interaksjonene. Dette kan være verdifulle i å utforske regulering av Ca 2 + / CAM signalveier. Videre kan vi bruke dette til å utforske sykdommer som skyldes forstyrrelser i Ca 2 + / CAM signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Tiffany Cherry i hjelpe henne i å optimalisere denne protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of Aging (AG032320) samt Advancing et sunnere Wisconsin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calmodulin-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0529-01 | |
| Anti-CamKII alpha | Sigma-Aldrich | C6974 | |
| Anti-neurogranin | EMD Millipore | 07-425 | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-138 | Use for aspiration of supernatants |
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-146 | Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads |
References
- Vincenzi, F. F. Calmodulin in the regulation of intracellular calcium. Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).
- Cheung, W. Y. Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation. Science. 207, 19-27 (1980).
- Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin. Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).
- Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein. J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).
- Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain. Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).
- Bahler, M., Rhoads, A. Calmodulin signaling via the IQ motif. FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).
- Routtenberg, A. Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth. Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).
- Needham, D. M. Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction. Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).
- Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).
- Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain. J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).
- Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).
- Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes. Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).
- Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides. Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
