Pull-down da Calmodulina Proteínas de Ligação

Summary

Calmodulina (CaM) ensaio de pull-down é uma maneira eficaz para investigar a interação de CaM com várias proteínas. Este método usa CaM-sepharose contas para análise eficiente e específica do CaM proteínas de ligação. Isto proporciona uma importante ferramenta para explorar sinalização CaM em função celular.

Abstract

Cálcio (Ca ^{2 +)} é um íon vital na regulação da função celular através de uma variedade de mecanismos. Muito do Ca ^{2 +} de sinalização é mediada através da proteína de ligação de cálcio conhecido como calmodulina ^1,2 (CaM). CaM está envolvido em vários níveis em quase todos os processos celulares, incluindo apoptose, o metabolismo, a contração do músculo liso, plasticidade sináptica, o crescimento do nervo, inflamação e da resposta imune. Uma série de proteínas ajudam a regular essas vias através de sua interação com CaM. Muitas dessas interações dependem da conformação da CAM, que é distintamente diferente quando ligado a Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +-CAM)} em oposição à sua Ca ^{2 +} estado livre (ApoCaM) ^3.

Enquanto a maioria das proteínas-alvo bind Ca ^{2 +-CaM,} algumas proteínas só se ligam a ApoCaM. Alguns ligam-se através CaM seu QI de domínio, incluindo neuromodulin ^4, neurogranin (Ng) ^5, e miosinas certos 7, função pós-sinápticos ^8, e ⁹ a contração muscular, respectivamente. Sua capacidade de ligar e liberar CaM na ausência ou presença de Ca ^{2 +} é central na sua função. Em contraste, muitas proteínas se ligam apenas Ca ^{2 +-CaM} e exigem esta ligação para sua ativação. Exemplos incluem a quinase da cadeia leve da miosina ^10, Ca ^{2 +} / CaM quinases dependentes (CaMKs) ¹¹ e fosfatases (por exemplo, da calcineurina) ^12, e espectrina quinase ^13, que tem uma variedade de efeitos diretos e jusante ^14.

Os efeitos destas proteínas em função celular são muitas vezes dependentes de sua capacidade de se ligar a CaM em Ca ^{2 +} forma-dependente. Por exemplo, testamos a relevância da Ng-CaM obrigatório em função sináptica e como diferentes mutações afetam essa ligação. Geramos uma GFP-tagged con Ngstruct com mutações específicas no IQ-domínio que iria mudar a capacidade de Ng para ligar CaM em Ca ^{2 +} forma-dependente. O estudo destas mutações diferentes nos deu grande insight sobre processos importantes envolvidos na função sináptica ^8,15. No entanto, em tais estudos, é essencial para demonstrar que as proteínas mutantes têm a ligação esperada alterado para CaM.

Aqui, apresentamos um método para testar a capacidade de se ligar a proteínas CaM na presença ou ausência de Ca ^{2 +,} usando CaMKII e Ng como exemplos. Este método é uma forma de cromatografia de afinidade referido como um ensaio CaM pull-down. Ele usa CaM-Sepharose contas para testar as proteínas que se ligam ao CaM e à influência de Ca ^{2 +} em essa ligação. É tempo consideravelmente mais eficiente e requer menos proteínas em relação a cromatografia de coluna e outros ensaios. Ao todo, este fornece uma valiosa ferramenta para explorar Ca ^{2 +} / CaM sinalização e proteínas que, emteract com CaM.

Protocol

Consulte a Figura 1 para um esquema básico do início procedimento com o homogeneizado. Tempo estimado desde a preparação de extratos celulares para eluição de Cam-bound proteínas é de cerca de 6-7 horas.

1. Preparação dos tecidos

1. Injetar organotípicas fatias do hipocampo com um vírus que contém um plasmídeo expressando a proteína recombinante de interesse (neste exemplo, proteína fluorescente verde (GFP) marcadas Ng) e permitir que o tecido que expressam a proteína durante a noite.
2. Cerca de 12 a 18 horas após a injeção viral (dependendo da época expressão viral), prepare-se para coletar o tecido. Adicionar tampão dissecção 1mL (glicose 10mM, KCl 4 mM, NaHCO3 26mm, sacarose 233mM, MgCl 5mM _2, 1 mM CaCl _2, e 0,1% de fenol-vermelho, gaseados com 5% de CO ₂ 95% O ₂₎ a uma placa de Petri. Transferência de tecido cultivado / inserir a placa de Petri e adicionar 2 ml de buffer dissecção para a inserção de submergir o tecido.
3. Coletat organotípicas tecido do hipocampo (entre 5 e 10 fatias) delicadamente raspando o tecido livre da membrana inserção utilizando um bisturi. Especificamente a remoção de uma determinada região de interesse (por exemplo, CA1) também é uma opção. Transferência de suspensão do tecido para um tubo de microcentrífuga 1,5 ml usando uma pipeta Pasteur invertida.
4. Centrifugar amostras em 1500 rcf para 1 min para separar tecido do tampão dissecção. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento.
5. Para cada fatia usada, adicione 30-60 mL de tampão de homogeneização (150mm NaCl, 20mM Tris pH 7.5, 1mM DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL Antipaína, pepstatin 1μg/mL, e 1% Triton X -100) para o tecido e homogeneizar cuidadosamente com o pilão.
6. , A fim de remover os restos celulares, centrifugar o homogeneizado restante em 1100 rcf durante 10 minutos e remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração, evitando a contaminação do sedimento.
7. Ter 10% do sobrenadante como amostra da entrada (amostra 1). Guarde o sobrenadante restante no gelo durante a preparação das contas CaM-sepharose para uso no passo 3.

Nota: O tecido utilizado aqui estão organotípicas fatias do hipocampo. No entanto, pode-se usar os neurônios dissociados ou qualquer sistema de cultura de outras células. Nesse caso, comece com a etapa 1,4 depois de coletar o tecido de maneira apropriada.

2. Preparação de grânulos de pull-down

No manuseio das contas, é importante para salvar as contas e maximizar a eficiência das reações, impedindo as contas de secagem sobre os lados do tubo. Para isso, é melhor para rodar seus tubos do lado deles, permitindo que solução para molhar as contas nas paredes do tubo, imediatamente antes da centrifugação.

1. Para cada pull-down, pipeta de 400 mL suspensão Calmodulina Sepharose-beads em um tubo de microcentrífuga 2 mL com um fla relativamentet-bottom para maximizar a área de superfície e interação de suas soluções com as contas durante a sua incubação.
2. Centrífuga contas a 21.000 rcf durante 30 segundos e remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar as contas.
3. Para lavar as contas, adicionar 100 mL do tampão de homogeneização respectivos contendo um ou dois mM CaCl ₂ para aqueles que estão sendo usados ​​para puxar para baixo Ca ^{2 +-CaM} proteínas de ligação e 2 mM EDTA (um conhecido Ca ^{2 +} quelante) para contas puxando para baixo ApoCaM proteínas de ligação. Bata suavemente o tubo para re-suspender contas e centrifugar a 1500 rcf para 1 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração, certificando-se para não perturbar as contas.

Nota: Para todos os passos de aspiração, é recomendado o uso de uma ponteira que tem uma abertura fina (por exemplo, dicas de carga gel) para permitir a remoção da solução sem remover contas.

3. CaM-sepharose ligação de proteínas

1. Dividir o seu sobrenadante em duas condições que contenham um volume igual. Dependendo da sua condição, adicionar a quantidade apropriada de CaCl ₂ ou EDTA para o sobrenadante até 2 mM para cada concentração.
2. Adicionar sobrenadante do passo de 1,7 a contas lavados em tampão de homogeneização correspondente. Bata suavemente o tubo para misturar.
3. Incubar as amostras a 4 ° C por 3 horas em uma coqueteleira. Re-suspender contas a cada 30 minutos ou mais para aumentar a eficiência da ligação.
4. Tubo de centrífuga contendo amostras e contas de 1500 rcf durante 3 min.
5. Tome 50μL do sobrenadante como amostra de proteína unbound (amostra 2) e remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração e restantes descartar.
6. Lavar contas três vezes como descrito no passo 2,3 utilizando 100μL de tampão de homogeneização respectivos.

4. Eluição

1. Adicionar 50μL de tampão de eluição (50 mM Tris-HCl pH 7.5, NaCl e 150 mm), contendo a condição oposta (10mM CaCl ₂ ou 10mM EDTA) para as contas. Por exemplo, as amostras que foram homogeneizadas e ligado em tampão contendo Ca ^{2 +} são eluídos em tampão de eluição contendo EDTA e vice-versa.

Opcional: O aquecimento do tampão de eluição a 37 ° C antes de adicionar contas pode aumentar o rendimento.

2. Incubar solução com contas em temperatura ambiente por 30 min em um agitador. Misture as contas batendo o tubo a cada 5 min.
3. Centrífuga contas em 1500 rcf por 3 min e remova cuidadosamente a 50μL do sobrenadante para a ligação às proteínas (amostra 3) por aspiração. Certifique-se de não perturbar as contas.
4. Adicionar tampão de carregamento de proteína para todas as amostras (ou seja, proteínas unbound homogeneizado, e amarrou bem como aqueles que ainda estão vinculados às esferas).

Nota: Para maximizar a eluição (especialmente no caso de eluição ineficiente), adicionar 50μL do tampão de eluição correspondentes (por exemplo, a adição de EDTA buf contendofer de contas vinculadas em CaCl ₂₎ para as contas antes de aquecer as amostras para ajudar a eluir qualquer proteína ligada restantes e repita os passos descritos no item 4.3 para remover proteínas restantes vinculados.

5. SDS-PAGE e western blot

Conduta SDS-PAGE e analisar usando western blot sondando para a sua proteína de interesse e sonda para uma proteína conhecida por se ligar CaM na condição oposta como controle positivo.

6. Resultados representante

Figura 2B mostra um exemplo de um ensaio de CaM-pull-down testar a ligação da CaM GFP-tagged Ng comparação com Ng endógena. Para isso, GFP-Ng foi overexpressed em nosso organotípicas fatias do hipocampo durante a noite e o tecido foi homogeneizado. O homogenato foi incubado com CaM-sepharose contas na presença de um Ca ^{2 +} ou EDTA. Homogenato de entrada mostra que a GFP-Ng foi expressa, além de Ng endógenos e Ca ^{2 +} / CaM quinase II dependente de(CaMKII). Como era esperado com base na ligação conhecida de Ng endógena (ilustrado na figura. 2A), GFP-tagged Ng foi eluída na ausência de Ca ^{2 +} (EDTA ligação às proteínas) e não ligado, na presença de Ca ^{2 +} (Fig. 2B) . Em contraste, o controle, CaMKII, foi eluído apenas na presença de Ca ^{2 +} (proteínas) e foi unbound na sua ausência (EDTA). Isso mostra que as contas foram CaM funcionando corretamente eo elutions foram eficientes. Mais importante, isso mostra que GFP-Ng se liga a ApoCaM de forma semelhante à forma endógena, sugerindo que a tag GFP não alterou a função da nossa proteína recombinante.

Esboço figura 1. CaM do ensaio de pull-down
(A) homogeneizado de tecido é girado para baixo para remover os restos celulares. Cerca de 10% do sobrenadante é tida como uma amostra da entrada (1). O sobrenadante restante é dividido igualmente para os diferentescondições e os reagentes apropriados (CaCl ₂ ou EDTA) são adicionados ao teste obrigatório em tais condições. Cada sobrenadante (contendo um ou outro CaCl ₂ ou EDTA) é carregado no respectivamente preparado CaM-sepharose contas e (B) incubado para permitir a ligação. Proteínas não ligados são removidos (2) e (C) as proteínas ligados (3) são eluídos fora das esferas usando tampão de eluição (EB), contendo a condição oposta, como a ligação. A composição das proteínas dessas três amostras de proteínas podem ser analisadas utilizando SDS-PAGE e western blot.

Figura 2. A. esquemática) de Ca ^{2 +} dependentes de ligação CaM e eluição em Exemplos de pull-down ensaio são dadas de dois tipos de proteínas que se ligam CaM em Ca ^{2 +} forma-dependente. Neurogranin (Ng) representa proteínas que se ligam apo-CaM e CaMKII representa proteínas que se ligam ao Ca ^{2 +} ricosCaM. CaM é mostrada em seu estado dissociado antes da incubação com as proteínas homogeneizado. Uma vez incubados sob condições de altas concentrações de Ca ^{2 +} (2 mM) ou na presença de um quelante de Ca ^{2 +,} EDTA (2 mM), as proteínas se ligam a CaM em conformidade. Ng liga CaM na condição de EDTA como há pouca ou nenhuma Ca ^{2 +} presente, e seria eluído fora as contas CaM-sepharose na presença de Ca ^{2 +.} CaMKII, porém, se ligariam a CaM na presença de quantidades elevadas de Ca ^{2 +} e que dissociar uma vez que o Ca ^{2 +} foi quelatado.
B.) Os resultados de CaM exemplo pull-down ensaio. Este número demonstra o resultado final esperado de um CaM-sepharose puxar para baixo com as amostras sondado por Ng e CaMKII. Ambos Ng endógeno e GFP-Ng estão presentes nas pistas de proteínas ligados a CaM na presença de EDTA. Ng não é obrigado quando as amostras são incubadas com CaM na presença de Ca ^{2 +,} demonstrando que Ng só liga apo-CaM. Nosso controle positivo, CaMKII, por outro lado, liga-se a CaM apenas na presença de Ca ^{2 +.}

Discussion

O protocolo fornecido utiliza CaM-sepharose contas para investigar o Ca ^{2 +} dependência da CaM proteínas de ligação. Muitas proteínas se ligam CaM em uma Ca ^{2 +} forma-dependente. Essas interações são de grande importância dado o número de CaM proteínas de ligação e seu papel crítico em muitas vias de sinalização. Neste protocolo, CaM-sepharose contas são usadas para separar CaM proteínas de ligação a partir de homogeneizado de tecido na presença ou ausência de Ca ^{2 +.} Os resultados desta abordagem simples ainda mais o entendimento de como as proteínas podem interagir com CaM em um ^{2 +} Ca forma-dependente. Esta abordagem difere de uma técnica comumente usada em estudos de proteínas de ligação, cromatografia em coluna, em que as contas CaM-sepharose estão em solução ao invés de fixos em uma matriz.

Evitando o uso de uma coluna é uma vantagem desta abordagem, porque sem a coluna do protocolo é menos demorado, já que não há need para equilibrar uma coluna ou esperar por gravidade por escoamento. Devido à virtude da sua eficiência, a CaM pull-down requer tecido significativamente menor do que a cromatografia em coluna e simplifica a preparação da amostra, como a separação de restos celulares a partir da amostra de proteínas requer apenas uma centrifugação curta para o Cam-sepharose puxar para baixo descrito. Colunas exigir amostras de proteínas que estão livres de quaisquer detritos celulares, que podem exigir etapas de purificação adicional. Essa abordagem também tem vantagens sobre outras puxar os métodos, tais como co-imunoprecipitação, que requer um anticorpo contra a proteína isca para capturá-lo e quaisquer proteínas que interagem na amostra. O uso de um anticorpo para a proteína de captura de isca pode ser uma limitação como interações pobres entre os anticorpos e as proteínas durante o experimento pode levar a uma ineficiente puxar para baixo. Estes potenciais problemas são evitados com o uso do descrito CaM-sepharose pull-down.

No entanto, comoo co-imunoprecipitação e ensaios de cromatografia de coluna, o CAM-sepharose pull-down é limitado a ex vivo CaM vinculativo. Os resultados obtidos podem não refletir a realidade em vivo de interações CaM. Por exemplo, modificações pós-traducionais muitas vezes um impacto interações proteína. Este é o caso de neurogranin, cuja interação com CaM é impedida por PKC-mediada fosforilação do seu domínio QI ^5. Homogeneização do tecido poderia alterar modificações pós-traducionais, por exemplo, permitindo que enzimas como quinases ou fosfatases para acessar as proteínas-alvo que normalmente seria isolado das enzimas dentro da célula. Interrupção de localização e / ou compartimentalização também poderia permitir a ligação, quando as duas proteínas que normalmente não teriam a oportunidade de interagir na célula. Para minimizar essas reações, é importante para armazenar todas as amostras em gelo entre a preparação e carregamento. É também por esta razão que a incubação com as contas é done em 4 ° C. Inibidores da fosfatase ou outros inibidores de enzima podem também ser adicionados aos buffers de homogeneização para ajudar a limitar os seus efeitos.

Um controle positivo é importante para esta experiência para se certificar de que nenhum erro significativo ocorreu durante o experimento. Também pode assegurar que as diferenças nas condições foram suficientes para causar mudanças conformacionais na CaM, permitindo que ele se ligam proteínas diferentes na presença e na ausência de Ca ^{2 +.} Por exemplo, se não há nenhum sinal para a proteína de interesse, poderia ser devido a um erro de carregamento ou de outros possíveis erros. Sondagem para uma outra proteína conhecida por se ligar em outras condições (como CaMKII no exemplo fornecido) pode ajudar a resolver possíveis erros. Baixo Ca ^{2 +} ou Ca ^{2 +} quelante (ex. EDTA) concentrações também podem interferir com os resultados esperados. EDTA tem sido utilizado com êxito, mas outros quelantes de Ca ^{2 +} (por exemplo, EGTA) pode ser mais eficaz se concentrando ainda maisíons são ineficazes. Proteína CaM-binding excessivo também pode levar a resultados inesperados, uma vez que pode saturar os disponíveis CaM sepharose-beads, causando eluição da proteína, quando deveria ser vinculado. Isto é visto no exemplo mostrado como uma quantidade relativamente pequena de GFP-Ng é eluída na condição de EDTA. Quantificação de proteínas antes da incubação com contas pode ajudar a melhorar isso.

Preparação e manipulação das contas CaM-sepharose durante todo o experimento também é essencial para o sucesso. Contas podem ser facilmente perdidos durante o experimento, ou inadvertidamente removidas com sobrenadante de ser descartados ou presos para os lados ea parte superior do tubo de 2,0 mL. Isto pode ser evitado usando cuidado ao remover o sobrenadante e assegurar uma mistura completa imediatamente antes da centrifugação. Tente não deixar amostras de sentar-se entre mistura e centrifugação, pois permite CaM-sepharose contas para secar sobre os lados do tubo. Como medida de precaução, miçangas e ressuspender rotate solução em torno do tubo de contas molhado imediatamente antes da centrifugação. Imersão completa das amostras com as contas durante ambos vinculativos e incubações de eluição é muito importante. Sem mistura adequada da amostra com as contas, obrigatória e eluição provavelmente será ineficaz.

Este protocolo é versátil e pode ser facilmente alterada para outros fins. Executar este experimento com proteínas truncadas ou mutado pode revelar informações sobre a região (s) e resíduos da proteína que são importantes para CaM vinculativo e Ca ^{2 +-dependência,} se observados. No caso de Ng, fomos capazes de mostrar que GFP-Ng, como a proteína endógena, liga-se CaM apenas na ausência de Ca ^{2 + 8.} Para explorar ainda mais esta função desta ligação, diferentes mutações desta proteína alterando a sua ajuda IQ-domínio para compreender a natureza da interação com CaM Ng, bem como a função de modificações pós-traducionais, que alteram esse Interaction. Nós testamos a importância de Ng-CaM ligação usando dois mutantes diferentes: um aspartato phosphomimic no lugar de uma serina (S36D ou Ng-SD) e um QI menos Ng para evitar ligação com CaM. Também gerou um mutante (Ng-SFAW), que tem maior ligação com CaM, permanecendo preso até mesmo na presença de Ca ^{2 +.} Finalmente, nós usamos um mutante não fosforilável (Ng-SA), que liga a CaM em Ca ^{2 +} dependentes de forma semelhante ao Ng endógena, mas impede a fosforilação da proteína quinase C (PKC). A CaM ensaio pull-down ajudou a testar a funcionalidade desses mutantes diferentes e ajudou a mostrar a importância da Ng-CaM obrigatório em função sináptica ⁸ e como fosforilação Ng ajuda a ajustar a plasticidade sináptica ^15.

Além disso, as proteínas que se ligam a proteínas de ligação CaM podia ser eluída. Isto poderia fornecer novas aplicações deste ensaio na determinação proteínas que se ligam indiretamente CaM. Ele permite que o estudo dessas interagem outrosíons e outros potenciais efeitos a jusante do CaM e seus parceiros de ligação.

Em resumo, a CaM ensaio de pull-down fornece uma maneira eficiente e eficaz para investigar Ca ^{2 +} dependência da proteína CaM interações. Isto pode ser uma importante ferramenta para o estudo da proteína CaM-interações e como as mutações diferentes ou modificações podem afetar essas interações. Isto pode ser valioso em explorar a regulação do Ca ^{2 +} / CaM caminhos de sinalização. Além disso, podemos usar isso para explorar patologias causadas por interrupções no Ca ^{2 +} / CaM sinalização.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calmodulin-Sepharose beads	GE Healthcare	17-0529-01
Anti-CamKII alpha	Sigma-Aldrich	C6974
Anti-neurogranin	EMD Millipore	07-425
Gel Loading Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-138	Use for aspiration of supernatants
Microcentrifuge tubes (2.0 mL)	Fisher Scientific	05-408-146	Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads