测量心肌细胞的快速钙助焊剂

Summary

我们提出了一个方法来隔离在生活细胞利用激光扫描共聚焦显微镜慢通量快速（微秒）钙事件。方法措施，由几百个像素单元格中的记录行扫描荧光强度的钙指标的波动。直方图分析，让我们来隔离不同的钙通量的时间尺度。

Abstract

心肌细胞有多个时间长短不一的Ca ^{2 +}通量，共同努力，优化功能^1,2。钙的变化外代理的活动主要是受这是刺激剂， ^如乙酰胆碱3,4质膜磷脂酶_Cβ-Gαq本地化的途径。最近，我们发现，质膜蛋白质称为小窝^5,6域可以坑害激活_GαQ ^7。这包封的稳定_Gαq激活状态，并在^长期的Ca ^{2 +}信号在心肌细胞和其它类型的^细胞 8作用。我们发现这个令人吃惊的结果，通过规模快速测量动态生活心肌钙反应。简言之，装有一个荧光的^{Ca 2 +}指示剂细胞。在我们的研究中，我们使用的Ca ^{2 +}绿色（Invitrogen公司，在C.）展品钙离子结合后的荧光信号强度的增加。荧光强度，然后记录使用激光扫描共聚焦显微镜扫描模式。此方法允许沿选定的行的像素荧光强度的时间当然的快速采集，生产数百微秒的时间尺度上的时间痕迹。这些痕迹非常快转移到Excel，然后将进行分析Sigmaplot相比，电子噪音，免费染料和其他控制获得的痕迹。解剖的Ca ^{2 +}不同的通量率的反应，我们进行了直方图分析，随着时间的推移，分级像素强度。分级让我们超过500扫描的痕迹和可视化编译的结果在一个单一的情节空间和时间。因此，缓慢的Ca ^{2 +}波难以辨别时，扫描覆盖由于不同的峰的位置和噪声，可不难看出，在分级直方图。在时间尺度的测量速度非常快通量表明在很短的时间，而^较长的Ca 2箱的强度分布^窄 +波显示分级数据与广泛分布在较长的时间箱。这些不同的时间分布，让我们来剖析在细胞内^的Ca 2 +通量的时机，并确定其影响各种细胞活动。

Protocol

1。载入细胞与钙指标

1. 中板35mm玻璃底的MatTek菜细胞（或任何其他的玻璃底部观看商会）。
2. 如果使用前用10μg/ml的层粘连蛋白大衣原发性心肌商会1天。板心肌细胞（成年犬，新生鼠，或其他生物隔离）35 KB缓冲区（K -逆转台氏缓冲mmol / L的HEPES，140 mmol / L的氯化钾，8 mmol / L的KHCO _3，2毫摩尔/ L的MgCl _2的 KH ₂ PO _4，pH值7.5 0.4毫摩尔/ L）和逐步改变M199培养基辅以15％小牛血清和1％streptamycin，0.5％庆大霉素，在37℃孵育° C在5％ _二氧化碳 。
3. 孵育细胞与钙绿色上午（1-5微米;分子探针）或任何所需的钙在室温为30-45分钟。盖用铝箔盘，以避免染料的漂白。
4. 清洗细胞Leibovitz15 14MM EGTA中等（三次如果要执行低钙实验）或任何适当的观看媒体。
5. Leibovitz15中等containing14mM EGTA孵育30-45分钟，。
6. 如果测试抑制剂的影响（即10μMU73122 PLC抑制剂）在第二个孵育。

2。显微注射细胞

1. 培养心肌细胞在玻璃底部MatTek菜（或其他观看商会）为24小时。
2. 变化中苯酚 - 莱博维茨- 15 14毫米EGTA（心肌细胞在无钙介质注入，其他细胞可以在培养基中含有钙注射）。
3. 准备显微注射的解决方案-我们的研究中使用的一种肽，消除_Gαq -小窝相互作用。请记住，只有少量的体积注入细胞（FL），所以必须使用合理集中的股票。我们用DAPI使用2微米Cav3支架，这种肽，钙培养基。 DAPI是蓝光Ë染料污渍的核心，并允许确定已显微注射细胞。许多钙指标的荧光的DAPI不会干扰。量的DAPI是可变的，我们一般使用足够的可视化的核（0.5和2μm）
4. 准备控制解决方案，其中包含的DAPI - 单独的染料示踪。
5. microinjections使用自拉或市售的针头。实践与染料注射，以确定适当的针参数。我们注意到，不同的细胞可能需要不同的针的直径和显微注射压力。
6. 使用自动显微注射系统，例如InjectMan NI2 FemtoJet泵从Eppendorf公司。设置注射压力至90 _P I百帕，并赔偿压力 P _C至45百帕。将注射时间 t至0.7秒如需要调整注入的参数。
7. 执行倒置显微镜（例如蔡司Axiove microinjectionsRT 200M）配备长工作距离相衬的目标（例如空气40倍，第2阶段目标）。
8. 注入细胞在快速的方式尽可能多的。检查使用相衬，选择可行的细胞注射的细胞。

3。联合免疫的研究

1. 用PBS洗涤细胞两次，并修复与3.7％多聚甲醛30分钟。如果需要，细胞可以刺激前固定。
2. 洗固定细胞，PBS洗3次，0.2％NP40 PBS孵育5分钟。
3. 座使用PBS包含1小时4％山羊血清（或其他适当的血清）。
4. 1％的PBS山羊1小时血清，孵育适当稀释的初级抗体的细胞。
5. 洗涤细胞三次，除了荧光标记的第二抗体，如Alexa的 - 氟488抗兔或Alexa的氟647抗鼠二抗稀释为150 mM氯化钠，25毫米的Tris，pH值7.6的10分钟到1：1000 1％山羊血清的PBS（请注意，两个不同的蛋白质探测时抗体，必须提出在不同物种和次要必须对相应的物种）。
6. 在37 ° C为1小时，用TBS洗三次。
7. 查看TBS缓冲液，或另一种合适的观看媒介中的细胞。

4。快速钙成像

1. 使用激光扫描共聚焦显微镜（例如Fluoview 1000奥林巴斯）。
2. 使用高数值孔径的目标。
3. 设置采集参数。对于钙的绿色使用488 nm激发，通长515排放过滤器。
4. 调整像素的时间 - 快速钙测量其设置为2微秒/像素。
5. 设置图像的缩放，达到0.05像素尺寸 - 0.3微米。
6. 选择的选择在一个特定的地区的细胞。
7. 在时间控制器“窗口中选择采集时间为至少1500扫描（以获得所需的时间框架响应 - 1.3毫秒/线将产生2秒）。
8. 记录背景阅读之前的刺激。
9. 刺激卡巴5微米的细胞，并立即开始记录数据。保持细胞在1毫升Leibovitz15中等，准备在Leibovitz15卡巴和10μM，轻轻地放入盘中添加1毫升

5。数据分析

1. 录制的图像的每个像素中提取的强度。保存为一个使用Fluoview 1000软件的表的强度数据。
2. 导入到Sigmaplot强度数据或类似的数据分析程序和斌到〜9-40箱的数据。比较对照实验和电子噪音。

6。代表性的成果：

我们细胞成像的激光扫描共聚焦显微镜LSM510（蔡司耶拿，德国）配备多线激光激发和一个40x/1.2无复消色差透镜水浸泡的目的。在图。 1（ 红色 ），我们的distribution的小窝- 3的抗体，这是重大的结构性caveolar蛋白在这些^细胞中9已固定和染色的成年犬心室心肌的小窝。的Caveolin - 3是immunolabelled与Alexa的647和633纳米线从他兴奋：氦氖激光。图像记录使用LP650 nm发射的过滤器。小窝- 3的分布比较_Gαq与Alexa的- 488（ 绿色 ）immunolabeled 。 Alexa的- 488 488nm氩离子激光线很兴奋和图像记录BP505 - 530nm发射滤光片。在这些共定位测量，两个荧光基团被激发，在连续使用多轨收购的方式。此过程，最大限度地减少通道串扰。共定位分析的数据是使用蔡司LSM510 - META提供的AIM软件。可以看出，这两种蛋白质共同定位。

要确定如何小窝- 3和Gα之间的耦合2 +绿。我们兴奋与488nm氩离子激光器，染料和收集的图像通过一个LP515排放过滤器。图像帧，收集了500毫秒的间隔。每个像素的强度值分别提取使用奥林巴斯的软件和ImageJ。行扫描模式用于定量分析更快的Ca ^{2 +}瞬变和Ca ^{2 +}火花。在本研究中使用的像素大小为0.1-0.3微米。行扫描率是约数，每行μS百强。在图。 2我们展示了一个CA ²线扫描⁺绿装心肌其中像素ð以及时间为2μs，该行的时间为142微秒。该图像是由1200线。

扫描的每一行对应的强度波动^的 Ca ² +绿组成的71分，超过142μs范围采取，可以作为钙反应迅速读出。例如，在图。 3中，我们显示的Ca ^{2 +}活动的个人心肌单行，如测得的Ca ^{2 +}绿色荧光强度在几秒钟的时间功能前 （上）和后（下）5微米卡巴从而提高另外细胞内Ca ^{2 +}通过_GαQ -PLCβ活动。当多条线路的平均值，卡巴刺激产生的Ca ^2〜1.8倍⁺绿强度。由于实验条件的变化（室温下，激光功率，探测器响应，染料分布，等），这种增加可能不会被视为个别行扫描。强度值（Y轴值），即使是相似的，很显然，在底部的卡巴刺激的情节，更广泛，相应的更持续的钙离子水平，比刺激前看到狭窄的波动峰，峰。这种强度的扩大和相对上升掩盖小，慢振荡。我们的目标是，以更好地区别这些明显不同类型的钙波动。

这些快速的钙波动的另一个例子是如图。 4。顶部的图形显示刺激心室心肌细胞（红色），平均3线的痕迹，显示为黑色的原始行数据。要确定这些钙波动_Gαq介导的程度- caveoline3相互作用，我们注射一种多肽不稳定小窝- 3 - _Gαq相互作用（即Cav3肽），从而消除^了较长的Ca 2 +电流和这些数据显示为蓝色（我们注意到，我们减去Cav3肽强度，使两条轨迹，可以更好地看到500）。

我们进口的Excel文件到Sigmaplot（Jandel公司）的原始数据的列，并进行了直方图分析。在这种分析中，事件的数量分为箱的数目相等（箱）生产直方图。斌的宽度相等的时间间隔。强度插入绑定到不同的时间，使一个特别斌的高度代表的次数，强度发生在特定的时间窗口。由于这种类型的分析只取决于在同一扫描速度收集数据，许多痕迹，可同时进行分析。此外，这种分析是不敏感的染料水平的差异，激光功率等，以及电子和背景噪音的时间尺度发生速度非常快，仅在第1-2箱。

相应的histograMS图的原始数据。 4显示在页面的底部。为控制细胞的直方图分布在一个大量的红线（线是指导眼睛和没有模型是假设）描绘了广阔的时间分布，相应的箱。相比之下_，GαQ - Cav3互动肽扰乱细胞的反应箱局限于一个狭窄的滨分布，表明肽的存在消除了持续时间较长通量。微量注射控制肽，不破坏_GαQ - Cav3产生一个类似联合国注射^细胞 8直方图。

在图。 5，我们比较快速强度波动的Ca ^{2 +}绿（ 左 ）和成年犬心室心肌新鲜，未刺激大鼠乳鼠心肌细胞缺乏小窝（ 右 ）。在这里，分级的强度超过3分钟的时间内相应的直方图在35查看较慢的​​钙事件。注意，乳鼠心肌细胞上显示一个平面显示慢的Ca ^{2 +}活动缺乏的基线，而一个更有条理的基准是成年细胞的快速波动。这些差异是最容易看到的直方图。

成年犬心室心肌_Gαq的分布图1。图像与Alexa的- 488 Alexa的- 488 488nm氩离子激光线和图像兴奋immunolabeled录得使用BP505 - 530nm发射滤光片。右上角的是相同的图像，查看immunolabeled小窝- 3 - 647与Alexa的本地化，兴奋与633纳米线从一个他：氦氖激光和记录使用LP650 nm发射滤波器。共定位是橙色的是合并后的图像在扩大图像的权利左下角。

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图2与Ca ^{2 +}绿色生活犬成人心室心肌细胞钙成像加载。共聚焦激光扫描显微镜系统与40X使用488nm氩离子激光器和LP515排放过滤器的目标图像。 1200线组成的图像，像素停留时间为2微秒，像素尺寸为0.1微米。

图3：从加载^与 Ca ^{2 +}绿和成像所述一个生活的成年犬心室心肌，和底部的同一单元格除了卡巴5微米的刺激跟踪的强度波动。

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图4。顶部线痕迹的一个例子，从生活犬成年心室心肌加载^{与Ca 2} +绿（红）超过180毫秒，平均3痕迹显示为一条黑线，和一个显微注射的细胞相比，一种肽，扰乱_GαQ -小窝3协会（红色）平均三个痕迹是黑色。我们注意到，我们减去400强度计数，以便查看数据。较低的面板相应的直方图，文中所述的分级数据和BIN号是任意的bin计数（或简单地计算）对应的强度，特别斌总额。我们注意到，红色和蓝色线在控制（左）和肽（右）直方图绘制的线条，让便于识别和数据进行比较，并没有假设模型。

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图5。强度波动的Ca ^{2 +}绿色成年犬心室心肌（ 左 ）和新鲜，未刺激的大鼠乳鼠心肌细胞缺乏小窝（ 右 ）和其相应的直方图如下所示。

Discussion

我们已经开发出一种方法来查看和隔离生活心肌的快速钙信号。虽然这些测量的实验条件下，曾经被应用到其他细胞^系统10以及心肌^细胞 11，使用直方图和斌分析可以从^很多的Ca ^{2 +}事件被收购的数据。更快的事件，可以很容易地隔离较慢的适应，了解他们的底层机制的模型。培养心肌细胞，许多小学的细胞株，可就难了。虽然人们普遍认为，测量应尽快采取收购后的细胞，我们发现，我们在这项研究中中使用的成年犬心肌细胞后第3天开始失去其特定的属性。这更长的时间框架，使细胞牢固的附着在细胞生存潜在的致命的治疗方法，如显微注射到基板投保。坚定执着是关键显微注射的成功。

我们核实_GαQ - 3小窝协会中的钙通量的作用，通过显微注射一种肽，扰乱了它们的相互作用。我们想强调，显微注射，必须非常谨慎，以尽量减少破坏细胞和细胞内容物泄漏。然而，这些风险必须平衡使用直径较大的针，需要比较大的心肌提供足够量的材料。列入如DAPI荧光染料，允许一个跟踪哪些细胞已被显微注射是很重要的。如前所述，重要的是，显微注射肌沐浴在无钙介质和注入的解决方案，也无钙。细胞外钙离子涌入启动收缩和随后的细胞死亡

自己可以适应其他类型的细胞，染料和共聚焦激光测量系统遵循其他细胞快速的事件，如1,4,5 insoitol trisphospate和营地通量的Ca ^{2 +}通量虽然当然是一个最复杂的细胞信使的。一应谨慎选择那些不容易光漂白和一个强大的和动态荧光反应，使激光功率低，可用于荧光指标。低激光功率也将避免局部加热，这可能会引起不必要的细胞的影响。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234