Het meten van Fast Calcium stromen in cardiomyocyten

Summary

Wij presenteren een methode om snel (microseconde) calcium gebeurtenissen isoleren van trager stromen in levende cellen met behulp van laser scanning confocale microscopie. De methode meet fluorescentie-intensiteit schommelingen van calcium indicatoren door het opnemen van lijn scans van enkele honderden pixels in een cel. Histogram-analyse laat ons toe om te isoleren van de tijdschalen van de verschillende calcium fluxen.

Abstract

Cardiomyocyten meerdere Ca ^{2 +} fluxen van verschillende duur die samenwerken om de functie ^1,2 te optimaliseren. Veranderingen in de Ca ^{2 +-activiteit} in reactie op extracellulaire agenten wordt voornamelijk geregeld door de fosfolipase Cβ-Gα _q pad gelokaliseerd op de plasmamembraan, die wordt gestimuleerd door stoffen zoals acetylcholine ^3,4. We hebben onlangs ontdekt dat plasma-membraan eiwit domeinen genaamd caveolae ^5,6 kan Gα _q ⁷ vangen geactiveerd. Dit entrapment heeft het effect van de stabilisatie van de geactiveerde toestand van Gα _q en resulteert in een verlengde Ca ^{2 +-signalen} in cardiomyocyten en andere celtypes ^8. We ontdekte dit verrassende resultaat door het meten van dynamische calcium antwoorden op een snelle schaal in de levende hartspiercellen. In het kort worden cellen geladen met een fluorescerende Ca ^{2 +-indicator.} In onze studies hebben we gebruik gemaakt Ca ^{2 +} Green (Invitrogen, Inc.), die een toename van de fluorescentie-emissie-intensiteit bij de binding van calciumionen vertoont. De fluorescentie-intensiteit wordt vervolgens opgenomen voor het gebruik van een line-scan modus van een laser scanning confocale microscoop. Deze methode maakt een snelle overname van het tijdsverloop van de fluorescentie-intensiteit in pixels langs een geselecteerde lijn, het produceren van enkele honderden van de tijd sporen op de microseconde tijdschaal. Deze zeer snelle sporen worden overgebracht naar Excel en vervolgens in Sigmaplot voor analyse, en worden vergeleken met sporen verkregen voor elektronische ruis, gratis verf, en andere controles. Te ontleden Ca ^{2 +} reacties van verschillende fluxen, voerden we een histogram analyse die pixel intensiteiten weggegooid met de tijd. Binning laat ons toe om de groep meer dan 500 sporen van scans en visualiseren van de verzamelde resultaten van ruimte en tijd op een perceel. Zo kan de trage Ca ^{2 +} golven die moeilijk te onderscheiden wanneer de scans worden bedekt te wijten aan verschillende piek plaatsing en geluid, gemakkelijk te zien inhet weggegooid histogrammen. Zeer snel fluxen in de tijdschaal van de meting tonen een smalle verdeling van de intensiteiten op de zeer korte tijd bakken terwijl meer Ca ^{2 +} golven tonen weggegooid gegevens met een brede spreiding over langere tijd bakken. Deze verschillende verdelingen tijd kunnen we de timing van Ca ^{2 +} fluxen ontleden in de cellen, en het effect daarvan te bepalen op verschillende cellulaire gebeurtenissen.

Protocol

1. Het laden van cellen met calcium indicatoren

1. Plaat cellen in 35mm met glazen bodem MatTek gerechten (of enige andere met glazen bodem bekijken van kamers).
2. Bij gebruik van primaire myocyten de vacht van de kamers een dag eerder met 10μg/ml laminine. Plaat cardiale myocyten (geïsoleerd van volwassen honden, neonatale ratten of ander organisme) in KB buffer (K-omkering Tyrode buffer 35 mmol / L van HEPES, 140 mmol / L KCl, 8 mmol / L van KHCO _3, 2 mmol / L van MgCl _2, en 0,4 mmol / L van KH ₂ PO _4, pH 7,5) en geleidelijk veranderen in een M199 medium aangevuld met 15% foetaal runderserum en 1% streptamycin en 0,5% gentamicine en incubeer bij 37 ° C in 5% CO _2.
3. Incubeer de cellen met calcium groene AM (1-5 micrometer, Molecular Probes), of elk gewenst calcium indicator voor 30-45 min bij kamertemperatuur. Dek de schaal af met aluminiumfolie om te voorkomen dat fotobleken van de kleurstof.
4. Was de cellen drie keer met Leibovitz15 medium met 14mm EGTA (indien het uitvoeren van experimenten in een laag calcium) of een passende bekijken van media.
5. Incubeer gedurende een 30-45 minuten in Leibovitz15 medium containing14mM EGTA.
6. Als het testen van de effecten-remmers (zoals 10μM U73122 PLC-remmer) toe te voegen tijdens de tweede incubatie.

2. Microinjecting cellen

1. Cultuur cardiomyocyten in glazen bodem MatTek gerechten (of een andere het bekijken van kamers) voor 24 uur.
2. Wijzig de middellange tot fenol-free Leibovitz-15 met 14 mM EGTA (cardiomyocyten moeten worden geïnjecteerd in calcium vrij medium, kunnen andere cellen worden geïnjecteerd in medium dat calcium).
3. Bereid micro-injectie-oplossing - onze studies gebruikten een peptide dat Gα _q elimineert - caveolae interacties. Houd in gedachten dat slechts een kleine hoeveelheid van het volume wordt geïnjecteerd in de cel (~ fL) en zo redelijk geconcentreerde voorraden moeten worden gebruikt. We gebruikten twee uM van dit peptide, Cav3-steiger, met DAPI in calcium-vrij medium. DAPI is een blue kleurstof die vlekken de kern en maakt de identificatie van cellen die zijn gemicroinjecteerd. DAPI interfereert niet met de fluorescentie van veel calcium indicatoren. De hoogte van DAPI is variabel en we over het algemeen genoeg gebruiken om de kern te visualiseren (0,5 en 2 uM)
4. Bereid controle oplossing die DAPI - de kleurstof tracer alleen.
5. Voor micro-injecties gebruik zelf getrokken of in de handel verkrijgbaar naalden. Oefen met kleurstof injectie om de juiste naald parameters te bepalen. Wij merken op dat verschillende cellen kunnen verschillende diameters naald en microinjectie druk vereisen.
6. Gebruik maken van geautomatiseerde micro-injectie systeem, bijvoorbeeld een InjectMan NI2 met een FemtoJet pomp van Eppendorf. Stel de injectiedruk P _i tot 90 hPa, en de vergoeding druk P _c tot 45 hPa. Stel de injectie tijd t tot 0,7 s. Stel de parameters van injectie nodig hebben.
7. Voer micro-injecties op een omgekeerde microscoop (bijvoorbeeld Zeiss Axiovert 200M), uitgerust met lange werkafstand fase-contrast-doelstelling (bijvoorbeeld de lucht 40x fase 2 doelstelling).
8. Injecteer zo veel cellen als mogelijk in een snelle manier. Onderzoek ingespoten cellen met behulp van de fase contrast met levensvatbare cellen te selecteren.

3. Co-immunofluorescentie studies

1. Twee keer wassen cellen met PBS en bevestig met 3,7% paraformaldehyde gedurende 30 minuten. Indien gewenst, kunnen cellen gestimuleerd worden voordat fixatie.
2. Was de vaste cellen drie keer met PBS, en incubeer met 0,2% NP40 in PBS gedurende 5 minuten.
3. Blokkeren met PBS met 4% geit serum (of een andere passende serum) voor een uur.
4. Incubeer de cellen met het primaire antilichaam op de juiste verdunning met 1% geit serum in PBS voor een uur.
5. Was de cellen drie keer 10 minuten met 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,6 gevolgd door toevoeging van fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen, zoals Alexa-Fluor-488 anti-konijn of Alexa-Fluor-647 anti-muis verdund secundair antilichaam tot en met 1: 1000 1% geit serum in PBS (let op dat bij het peilen voor twee verschillende eiwitten de primaire antilichamen moet worden opgewekt in verschillende soorten en de secundaire moeten worden tegen de bijbehorende soorten).
6. Incubeer bij 37 ° C voor een uur, was drie keer met TBS.
7. Bekijk cellen in TBS-buffer of een andere geschikte bekijken medium.

4. Snel calcium imaging

1. Gebruik laser scanning confocale microscoop (bijvoorbeeld Fluoview 1000 Olympus).
2. Gebruik een hoge numerieke apertuur doelstelling.
3. Stel de acquisitie parameters. Voor calcium groen te gebruiken 488 nm excitatie en lange pass 515-emissie filters.
4. Stel de pixel tijd - voor een snelle calcium metingen stel deze in op 2 microseconden / pixel.
5. Stel de afbeelding te vergroten tot pixelgrootte van 0,05 te bereiken - 0.3 micrometer.
6. Selecteer een regel uit een cel van keuze in een bepaalde regio.
7. In de tijd controller venster selecteren tijd aanwinst voor minstens 1500 scans (om de gewenste termijn vande respons - 1.3 ms / lijn zou opleveren 2 seconden).
8. Record achtergrond te lezen voorafgaand aan de stimulatie.
9. Stimuleer cellen met 5 uM carbachol en meteen beginnen met het opnemen van gegevens. Houd de cellen in 1 ml van Leibovitz15 medium, bereiden 10 uM carbachol in Leibovitz15 en voeg voorzichtig 1 ml in de schaal

5. Data-analyse

1. Extract van de intensiteiten voor elke pixel van de opgenomen beeld. Sla de intensiteit van gegevens als een tabel met behulp van Fluoview 1000 software.
2. Importeren intensiteit gegevens in Sigmaplot of een soortgelijke data-analyse-programma en bin de gegevens in ~ 90-40 bakken. Te vergelijken met experimenten en elektronische ruis controle.

6. Representatieve resultaten:

We afgebeeld cellen op laser scanning confocale microscoop LSM510 (Zeiss, Jena, Duitsland), uitgerust met een multi-line laser excitatie en een 40x/1.2 NA apochromat water immersie objectief. In Fig. 1 (rood) tonen we de distribution van caveolae in honden volwassen ventriculaire hartspiercellen die zijn gefixeerd en gekleurd met een antilichaam tegen caveoline-3, die is de grote structurele caveolar eiwit in deze cellen ^9. Caveoline-3 was immunolabelled met Alexa-647 en blij met de 633-nm lijn van een Hij: Ne laser. Beelden werden opgenomen met behulp van LP650 nm emissie filter. De verdeling van caveoline-3 werd vergeleken met Gα _q die was immunolabeled met Alexa-488 (groen). Alexa-488 was blij met 488nm Argon-ion laser lijn en het beeld is opgenomen met BP505 530nm-emissie filter. In deze colocalization metingen, werden de twee fluoroforen opgewonden op een sequentiële wijze met behulp van Multi Track overname. Deze procedure minimaliseert kanaal cross-talk. Data-analyse voor colocalization werd uitgevoerd met behulp van AIM-software voorzien van Zeiss LSM510-Meta. Zoals te zien is, zijn de twee eiwitten colocalized.

Om te bepalen hoe de koppeling tussen caveoline-3 en Gα 2 + Green. We enthousiast de kleurstof met een 488nm Argon-ion laser en verzameld beelden door een LP515-emissie filter. Beeldframes werden verzameld bij 500 ms intervallen. Intensiteit waarden voor elke pixel werden geëxtraheerd met behulp van Olympus-software en ImageJ. De lijn scanmodus werd gebruikt voor de kwantitatieve analyse van snellere Ca ^{2 +} transiënten en Ca ^{2 +} vonken. De pixelgrootte gebruikt in de huidige studie 0,1-0,3 micrometer. De line-scan lag over enkele honderden microseconden per regel. In Fig. 2 laten we zien een lijn scan van een Ca ^{2 +} Green-geladen cardiomyocyte waar de pixel dgoed moment was 2 microseconden, de lijn tijd was 142 microseconden. Het beeld is opgebouwd uit 1200 lijnen.

Elke regel van de scan komt overeen met de intensiteit fluctuatie van Ca ^{2 +} Green die bestaat uit 71 punten genomen over een 142 ps bereik, en kan gebruikt worden als een snelle uitlezing voor calcium reacties worden. Bijvoorbeeld, in Fig. 3 laten we zien de Ca ^{2 +-activiteit} van een enkele lijn van een individuele cardiomyocyten, zoals gemeten door Ca ^{2 +} Green fluorescentie-intensiteit als functie van de tijd in seconden voor (boven) en na (onder) de toevoeging van 5 uM carbachol die verbetert het niveau van de intracellulaire Ca ^{2 +} door middel van Gα _q-PLCβ activiteit. Als er veel lijnen zijn gemiddeld, carbachol stimulatie produceert een ~ 1.8-voudige toename in Ca ^{2 +} Green intensiteit. Als gevolg van variaties in de experimentele omstandigheden (kamertemperatuur, laservermogen, detector respons, kleurstof distributies, enz.), kan deze stijging niet te zien in de individuelelijn scans. Hoewel de intensiteit van waarden (y-as-waarden) zijn vergelijkbaar, is het duidelijk dat de carbachol-gestimuleerde plot aan de onderkant veel bredere pieken, wat overeenkomt met meer duurzame calcium niveaus, dan de smalle fluctuatie pieken eerder gezien stimulatie heeft. Deze verbreding en de relatieve toename in intensiteit verduistert kleine, langzamere trillingen. Ons doel is om beter onderscheid te maken tussen deze verschillende schijnbaar types van calcium schommelingen.

Een ander voorbeeld van deze snelle schommelingen calcium wordt getoond in Fig. 4. De bovenste grafiek toont ruwe gegevens voor lijn gestimuleerd ventriculaire cardiomyocyten (rood) en een gemiddelde van 3 lijn sporen is te zien in zwart. Voor het bepalen van de mate dat deze calcium fluctuaties waren bemiddeld door Gα _q - caveoline3 interacties, we gemicroinjecteerd een peptide dat caveoline-3 destabiliseert - Gα _q interacties (dat wil zeggen Cav3 peptide), die voorkomt op de langere Ca ^{2 +} actuele en deze gegevens worden weergegeven in het blauw(Merken we op dat we 500 afgetrokken van de Cav3 peptide intensiteiten, zodat de twee sporen kan beter onderscheiden).

We hebben de kolommen van de ruwe data geïmporteerd uit onze Excel-bestanden naar Sigmaplot (Jandel, Inc) en voerde een histogram-analyse. In deze analyse wordt het aantal gebeurtenissen gegroepeerd in een gelijk aantal dozen (bakken) om een ​​histogram te maken. De breedte van bin vertegenwoordigt een gelijk interval van tijd. De intensiteiten worden ingevoegd in de andere tijd bindt, zodat de hoogte van een bepaalde bak het aantal keren dat de intensiteit voorkomt in de bepaalde tijd window representeerd. Aangezien dit type van analyse alleen afhankelijk is van het verzamelen van gegevens op dezelfde scan rate, kunnen veel sporen tegelijk worden geanalyseerd. Bovendien, deze analyse is niet gevoelig voor verschillen in dye niveaus, laservermogen, enz., en elektronische en achtergrondgeluiden vindt plaats op tijdschalen zeer snel en zijn alleen te zien in de eerste 1-2 bakken.

De bijbehorende histograms van de ruwe gegevens in Fig. 4 worden getoond op de onderkant van de pagina. Het histogram voor de controle cellen zijn verspreid over een groot aantal bakken dat overeenkomt met een brede tijd verdeling, zoals weergegeven door de rode lijn (de lijn is voor het begeleiden van het oog en geen model wordt verondersteld). In tegenstelling, zijn de bakken voor de respons van cellen waar de Gα _q-Cav3 interactie werd verstoord door peptide beperkt tot een smalle bin verdeling suggereert dat de aanwezigheid van peptide langere duur fluxen elimineert. Micro-injectie van een controle peptide dat niet te verstoren Gα _q-Cav3 produceert een histogram lijkt op niet-geïnjecteerde cellen ^8.

In Fig. 5 vergelijken we de snelle fluctuaties intensiteit van Ca ^{2 +} Green bij volwassen honden ventriculaire cardiomyocyten (links) en verse, niet-gestimuleerde rat neonatale cardiomyocyten dat caveolae (rechts) ontbreekt. Hier zijn de bijbehorende histogrammen van de intensiteiten over een periode van drie minuten weggegooid op 35 langzamer te calcium gebeurtenissen te bekijken. Merk op dat de neonatale cardiomyocyten snelle fluctuaties weer te geven op een vlakke basislijn met het ontbreken van een tragere Ca ^{2 +-activiteit,} terwijl een meer gestructureerde baseline is waargenomen voor de volwassen cellen. Deze verschillen zijn het meest gemakkelijk te zien in de histogrammen.

Figuur 1. Beelden van Canine Adult ventriculaire hartspiercellen toont de verdeling van Gα _q immunolabeled met Alexa-488 waar de Alexa-488 was blij met 488nm Argon-ion laser lijn en het beeld is opgenomen met BP505 530nm-emissie filter. Rechts boven is hetzelfde beeld het bekijken van de lokalisatie van caveoline-3 immunolabeled met Alexa-647, opgewonden met het 633-nm lijn van een Hij: Ne laser en geregistreerd met behulp van LP650 nm emissie filter. De gefuseerde beeld waar colocalization wordt gezien in het oranje is op de bodem links met een uitgebreid afbeelding aan de rechterkant.

"Pdflinebreak">

Figuur 2. Calcium beeldvorming van een levende hond volwassen ventriculaire cardiomyocyte geladen met Ca ^{2 +} Green. Het beeld is genomen op een confocale laser scanning microscoop systeem met een 40x objectief met behulp van een 488nm Argon-ion laser en een LP515 emissie filter. Het beeld is opgebouwd uit 1200 lijnen, de pixelverblijftijd was 2 microseconden, en de pixelgrootte was 0,1 urn.

Figuur 3. TOP Intensiteit fluctuaties van een lijn trace van een levende hond volwassen ventriculaire cardiomyocyte geladen met Ca ^{2 +} Groen en afgebeeld zoals beschreven, en BOTTOM dezelfde cel gestimuleerd door de toevoeging van 5 uM carbachol.

/ 3505fig4.jpg "/>
Figuur 4. TOP Een voorbeeld van een lijn sporen van een levend Canine Adult ventriculaire cardiomyocyte geladen met Ca ^{2 +} Green (rood) die meer dan 180 ms, waar het gemiddelde van de drie sporen wordt weergegeven als een zwarte lijn, en vergeleken met een cel die was gemicroinjecteerd met een peptide dat verstoort Gα _q-caveoline 3 vereniging (rood), waar een gemiddelde van drie sporen wordt in het zwart. Wij merken op dat we 400 intensiteit telt afgetrokken van de onderste set van gegevens voor het bekijken doeleinden. De onderste panelen zijn de bijbehorende histogrammen van de weggegooid gegevens zoals beschreven in de tekst, en waar de bak nummer is arbitrair en de bin tellen (of simpelweg tellen) komt overeen met het totale bedrag van de intensiteit in de betreffende bak. We merken op dat de lijn rode en blauwe lijnen getrokken in de controlegroep (links) en peptide (rechts) histogrammen zijn om snellere identificatie en vergelijkingen van de gegevens en er geen model is verondersteld.

files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg "/>
Figuur 5. Intensiteit schommelingen van Ca ^{2 +} Green bij volwassen honden ventriculaire cardiomyocyten (links) en verse, niet-gestimuleerde rat neonatale cardiomyocyten dat caveolae (rechts) en de bijbehorende histogrammen gebrek worden hieronder getoond.

Discussion

We hebben een methode ontwikkeld om te bekijken en te snelle calcium-signalen te isoleren in levende hartspiercellen. Terwijl de experimentele omstandigheden van deze metingen zijn eerder toegepast op andere celsystemen ¹⁰ en cardiomyocyten ^11, het gebruik van histogrammen en bin-analyse maakt het mogelijk gegevens uit vele Ca ^{2 +} evenementen aan te schaffen. Sneller gebeurtenissen kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit langzamere en modellen aangepast aan hun onderliggende mechanismen te begrijpen. Het kweken van cardiomyocyten, zoals veel primaire cellijnen, kan moeilijk zijn. Hoewel het over het algemeen gedacht dat de metingen moet binnenkort worden genomen na de cellen worden verworven, hebben we geconstateerd dat de volwassen honden cardiomyocyten gebruikten we in deze studie alleen beginnen hun specifieke eigenschappen verliezen, na 3 dagen. Deze langere termijn kan de cellen stevig aan hechten aan de ondergrond verzekeren dat de cellen potentieel dodelijke behandelingen, zoals micro-injectie overleven. Stevige bevestiging is van cruciaal belangvoor het succes van micro-injectie.

We controleren de rol van Gα _q-caveoline 3 vereniging in calcium fluxen door microinjecting een peptide dat hun interactie verstoort. We willen graag benadrukken dat micro-injectie moet met grote zorgvuldigheid te minimaliseren beschadiging van de cel en lekkage van cellulaire inhoud. Nochtans, moeten deze risico's worden afgewogen tegen het gebruik van grotere diameter naalden die nodig zijn om een ​​voldoende hoeveelheid materiaal te leveren in de relatief grote cardiomyocyten. De opname van een kleurstof, zoals DAPI die het mogelijk maakt een op te sporen die cellen zijn micro-injectie is belangrijk. Zoals gezegd, is het belangrijk dat voor de micro-injectie myocyten, badend in het calcium vrij medium is en dat ingespoten de oplossingen is ook vrij van calcium. Instroom van extracellulair calcium initieert de weeën en de daaropvolgende dood van cellen

De metingen zelf kunnen worden aangepast aan andere soorten cellen, kleurstoffen en confocale lasersystemen om andere snelle cel evenementen, zoals insoitol 1,4,5 trisphospate en cAMP fluxen te volgen, hoewel de Ca ^{2 +} fluxen zijn zeker een van de meest complexe cellulaire boodschappers. Men moet voorzichtig zijn met het kiezen van fluorescerende indicatoren die niet gemakkelijk zijn photobleached en hebben een robuuste en dynamische fluorescentie respons, zodat een lage laser bevoegdheden kunnen worden gebruikt. Lage laservermogen wordt ook voorkomen dat lokale verwarming die aanleiding kunnen geven tot ongewenste cellulaire effecten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234