Hızlı Kalsiyum Dekapanları kardiyomiyositlerde Ölçme

Summary

Konfokal mikroskobi lazer tarama kullanarak canlı hücreler yavaş akıları hızlı (mikrosaniye) kalsiyum olayları izole etmek için bir yöntem sunar. Bu yöntem, bir hücrede birkaç yüz piksel kayıt satırı tarar kalsiyum göstergeler floresan dalgalanmaları ölçer. Histogram analizi, bize farklı kalsiyum akıları zaman ölçeklerinde izole etmek için izin verir.

Abstract

Kardiyomiyositlerde fonksiyonu ^1,2 optimize etmek için birlikte çalışma süresi değişen birden fazla Ca ² + akıları var . Değişiklikler Ca ^{2 +} ekstrasellüler ajanlar yanıt olarak faaliyet ağırlıklı olarak, ^asetilkolin 3,4 gibi ajanlar tarafından uyarılan plazma membran lokalize fosfolipaz Cβ _Gα q yolağı tarafından düzenlenir . Biz son zamanlarda caveolae ^5,6 olarak adlandırılan plazma membran proteini etki alanı _{Gα ^q} 7 aktif tuzağa olduğunu bulduk . Bu tuzak Gα _q aktive devlet istikrar ve uzun süreli Ca ^{2 +} kardiyomiyositlerde ve diğer hücre tipleri ⁸ sinyalleri sonuçlanan bir etkiye sahiptir. Biz yaşam kardiyomiyositlerde hızlı bir ölçekte dinamik kalsiyum tepkileri ölçerek bu şaşırtıcı bir sonuç ortaya çıkardı. Kısaca, hücreler bir floresan Ca ^{2 +} gösterge ile yüklenir. Çalışmalarda, Ca ^{2 +} Yeşil (Invitrogen,kalsiyum iyonlarının bağlanması üzerine floresans emisyon yoğunluğunda bir artış sergileyen c.). Floresan konfokal mikroskop bir lazer tarama bir satır tarama modunu kullanmak için kaydedilir. Bu yöntem, seçilen bir hat boyunca piksel floresan yoğunluğu zaman elbette hızlı veri toplama mikrosaniye zaman ölçeği üzerinde zaman izleri yüzlerce üreten sağlar. Bu çok hızlı izleri excel ve sonra analiz için Sigmaplot içine transfer edilir ve elektronik gürültü, boya, ve diğer kontroller için elde edilen izleri ile karşılaştırıldığında. Ca ² incelemek için farklı akı oranları ⁺ tepkiler, zamanla piksel yoğunlukları binned histogram analizi yapıldı. Binning tarama 500 izlerini üzerinden grup ve tek bir arsa üzerinde mekansal ve zamansal olarak derlenmiş sonuçları görselleştirmek için bize izin verir. Böylece, tarar, farklı pik yerleştirme ve gürültü nedeniyle, üst üste zaman ayırt etmek zor yavaş Ca ^{2 +} dalgalarının kolayca görülmektedir.binned histogramlar. Çok hızlı ölçüm zaman ölçeği tozlar, uzun ^Ca 2 ise çok kısa bir süre kutularına yoğunluğu dar bir dağılım ^gösterir + dalgaları uzun süre kutuları üzerinde geniş bir dağıtım binned verileri göstermektedir . Bu farklı zaman dağılımları, ^{Ca 2} + akıları zamanlaması bize hücreleri incelemek ve çeşitli hücresel olayları üzerindeki etkilerini belirlemek için izin verir .

Protocol

1. Kalsiyum göstergeleri ile yükleme hücrelerle

1. 35mm cam alt Mattek yemekleri Levha hücreleri (veya başka bir cam alt odaları inceleyen).
2. Kullanarak birincil miyositler kat odaları 1 gün önce 10μg/ml laminin. KB tampon Levha (K-ters Tyrode tampon kardiyak miyositler (yetişkin köpekler, yenidoğan sıçan ya da diğer bir organizmayı izole) 35 Hepes mmol / L, 140 mmol / L KCl, 8 _{KHCO 3,} 2 mmol / mmol / L MgCl ₂ L ve 0.4 mmol / L KH ₂ PO _4, pH 7.5) ve 37 az% 15 fetal sığır serumu ve% 1 streptamycin ve% 0.5 gentamisin ve inkübe ile desteklenmiş M199 orta yavaş yavaş değiştirmek ° C% 5 CO _2.
3. Hücreleri veya oda sıcaklığında 30-45 dakika için herhangi bir istenen kalsiyum göstergesi; kalsiyum yeşil AM (Molecular Probes 1-5 mcM) ile inkübe edin. Boya photobleaching önlemek için tabak alüminyum folyo ile örtün.
4. Leibovitz15 14mm EGTA orta (hücreler üç kez yıkayındüşük kalsiyum deneyler) veya herhangi bir uygun görüş medya performans.
5. Leibovitz15 orta containing14mM EGTA bir 30-45 dakika inkübe edin.
6. Inhibitörlerinin etkilerini test ikinci inkübasyon sırasında (yani 10μM U73122 PLC inhibitörü) ekleyebilirsiniz.

2. Microinjecting hücreleri

1. 24 saat için cam alt Mattek yemekleri (ya da diğer izleme odaları) Kültür kardiyomiyositlerde.
2. 14 mM EGTA fenol-Leibovitz-15 orta Değişim (kardiyomiyositlerde kalsiyum serbest ortamda enjekte olması orta içeren kalsiyum, diğer hücreler enjekte edilebilir).
3. Mikroenjeksiyon çözüm hazırlayın çalışmalar Gα _q ortadan kaldıran bir peptid - caveolae etkileşimleri. Hacminin sadece küçük bir miktar (~ fL) hücre içine enjekte edilir ve böylece makul konsantre stoklarını kullanmış olmalıdır aklınızda bulundurun. Bu peptid 2 mcM Cav3-iskele, kalsiyum-serbest ortamda DAPI ile kullandı. DAPI bir blue boya lekeleri çekirdeğin ve microinjected hücrelerin kimlik sağlar. DAPI birçok kalsiyum göstergeler floresan engel değildir. DAPI miktarı değişken ve biz genellikle çekirdeğin görselleştirmek için yeterli kullanmak (0.5 ve 2 mcM)
4. Yalnız boya tracer - DAPI içeren kontrol çözümü hazırlayın.
5. Microinjections kendi kendine çekti ya da piyasada bulunan iğne kullanmak için. Uygun iğne parametrelerini belirlemek için boya enjeksiyonu ile uygulayın. Biz, farklı hücrelerin farklı iğne çapları ve mikroenjeksiyon baskılara gerektirebilir unutmayın.
6. Örneğin bir InjectMan NI2 Eppendorf FemtoJet'te pompa, otomatik mikroenjeksiyon sistemi kullanın. 90 enjeksiyon basıncı P _i hPa ve 45 tazminat basınç P _c hPa ayarlayın. 0.7 enjeksiyon süresi t ayarlayın s Gerek enjeksiyon parametrelerini yeniden ayarlayın.
7. Ters bir mikroskop (örneğin Zeiss Axiove microinjections gerçekleştirinrt 200M) uzun çalışma mesafesi faz kontrast hedefi (örneğin hava 40x faz 2 hedefi için) ile donatılmıştır.
8. Hızlı bir şekilde mümkün olduğu kadar çok hücreler olarak enjekte edilir. Faz kontrast, canlı hücreleri seçmek için kullanarak hücreleri enjekte inceleyin.

3. Co-immunofloresan çalışmalar

1. PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve 30 dakika boyunca% 3,7 paraformaldehid ile düzeltmek. Gerekirse, hücrelerin fiksasyonu önce uyarılır.
2. Sabit hücreler PBS ile üç kez yıkayın ve 5minutes için PBS içinde 0.2% NP40 kuluçkaya yatmaktadır.
3. PBS 1 saat için% 4 keçi serumu (ya da diğer uygun serum) içeren kullanarak engelleyin.
4. 1 saat için PBS içinde% 1 keçi serumu ile uygun dilüsyon hücrelerin primer antikor ile inkübe edin.
5. Alexa-Fluor-488 anti-tavşan veya Alexa-Fluor-647 sulandırılmış anti-fare sekonder antikoru gibi floresan etiketli ikincil antikor Ayrıca, 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7.6 ile 10 dakika hücreler üç kez yıkayın 1: 1000 PBS içinde% 1 keçi serumu (birincil antikorlar iki farklı proteinlerin problama farklı türler ortaya olmalıdır ve ikincil ilgili türlerine karşı olmalıdır dikkat edin).
6. 37 ° ° C'de 1 saat, üç kez TBS ile yıkayın.
7. TBS tampon ya da başka bir uygun görüş orta hücreleri.

4. Hızlı kalsiyum görüntüleme

1. (Örneğin Fluoview 1000 Olympus) konfokal mikroskop lazer tarama kullanın.
2. Yüksek sayısal diyafram objektif kullanın.
3. Satın parametreleri ayarlayın. Kalsiyum yeşil kullanımı 488 nm eksitasyon ve uzun 515 emisyon filtreleri geçmek.
4. 2 μs / piksel piksel saati ayarlayın - hızlı kalsiyum ölçümleri için ayarlayın.
5. 0.05 - 0.3 mikron piksel boyutu ulaşmak için görüntü yakınlaştırma ayarlayın.
6. Belirli bir bölgede tercih edilen bir hücre satırı seçin.
7. Zaman kontrol penceresinde zaman zaman diliminde istenilen almak için en az 1500 taramaları (satın alma seçeneğinitepkisi - 1.3 ms / satır) 2 saniye doğuracak.
8. Kayıt arka plan önceden uyarılması için okuma.
9. 5 mcM karbakol ile hücreleri uyarmak ve kayıt verileri hemen başlayabilirsiniz. Hücreleri Leibovitz15 orta 1 mL tutun Leibovitz15 10 mcM karbakol hazırlamak ve hafifçe çanak içine 1 ml eklemek

5. Veri analizi

1. Kaydedilen görüntü her bir piksel için şiddetleri ayıklayın. Fluoview 1000 yazılımını kullanarak bir tablo olarak yoğunluğu verileri kaydetmek.
2. Sigmaplot al'ı yoğunluğu veri veya benzer bir veri analiz programı ve bin ~ 9-40 bidonları içine veriler. Deneyler ve elektronik gürültü kontrolü ile karşılaştırın.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Biz multi-line lazer uyarma ve 40x/1.2 NA apochromat suya daldırma hedefi ile donatılmış konfokal mikroskop LSM510 (Zeiss Jena, Almanya) lazer tarama hücreleri görüntülenmiş. Şekil. Biz distributio 1 (kırmızı)n, bu ^hücrelerin 9 önemli yapısal caveolar protein kaveolin-3 antikor ile sabit olmuştur ve lekeli köpek yetişkin ventriküler kardiyomiyositlerde caveolae . Kaveolin-3 immunolabelled Alexa-647 ve 633 nm hattı ile bir O heyecanlıydı: Ne lazer. Görüntüler LP650 nm emisyon filtre kullanarak kaydedildi. Alexa-488 (yeşil) ile immunolabeled Gα _q kaveolin-3 dağılımı karşılaştırıldı. Alexa-488 488nm Argon-iyon lazer çizgisi ile heyecanlı ve görüntü BP505-530nm emisyon filtre kullanarak kaydedildi. Bu ko ölçümleri, iki fluorophores Çok Parça satın alma kullanarak sıralı bir şekilde heyecan vardı. Bu prosedür, kanal çapraz-tartışma en aza indirir. Veri analizi için ko-Zeiss LSM510-Meta ile sağlanan AIM yazılımı kullanılarak yapıldı. Görüldüğü gibi, iki protein kolokalize.

Belirlemek için nasıl kaveolin-3 ve Gα arasındaki kaplin Ca 2 + Yeşil ile yüklendi . Biz bir 488nm Argon iyon lazer ile boya heyecanlı ve bir LP515 emisyon filtresi aracılığıyla görüntüleri toplanır. Resim çerçeveleri 500 ms aralıklarla toplanmıştır. Olympus yazılımı ve ImageJ kullanarak, her bir piksel için yoğunluğu değerleri çıkarıldı. Çizgi tarama modu hızlı Ca ^{2 +} transientler ve Ca ^{2 +} kıvılcım kantitatif analiz için kullanılmıştır. Bu çalışmada kullanılan piksel büyüklüğü 0.1-0.3 mikron idi. Line-tarama hızı hakkında birkaç yüz satır başına ms'den oldu. Şekil. 2 biz bir çizgi tarama Ca ^{2 +} Yeşil-yüklenmiş kardiyomiyosit piksel diyi süresi 2 μs 142 μs, hat zaman oldu. 1200 satır görüntü oluşur.

Her tarama hattı Ca ² yoğunluğu dalgalanma karşılık ⁺ Yeşil oluşan 142 μs aralığı üzerinden alınan 71 puan ve hızlı bir kalsiyum yanıtları için salt olarak kullanılabilir. Örneğin, Şekil. 3 Ca ^{2 +} Ca ² ile ölçülen tek bir satır ayrı bir kardiyomiyosit aktivite, önce saniyeler içinde zamanın bir fonksiyonu (üst) ve sonra ⁺ Yeşil floresan (alt) artırır 5 mcM karbakol ek hücre içi Ca ^{2 +} Gα _q-PLCβ aktivite ile. Kadar satır ortalaması alınır, karbakol stimülasyon, ^Ca 2 ~ 1,8 kat artış ^{üretir +} Yeşil yoğunluğu . Deneysel koşullar altında (oda sıcaklığında, lazer gücü, dedektör cevabı, boya dağılımları, vb) farklılıklar nedeniyle, bu artış bireysel görülebilir olmayabilirsatırlarını tarar. Yoğunluk değerleri (y ekseni değerleri) benzer olsa da, altta karbakol ile uyarılmış arsa uyarımı daha önce görülmemiş dar dalgalanma zirveleri çok daha sürekli bir kalsiyum düzeyleri ilgili çok daha geniş zirveleri, sahip olduğu açıktır. Şiddeti Bu genişletilmesi ve göreceli bir artış, küçük, yavaş salınımları gizler. Amacımız daha iyi kalsiyum dalgalanmaların bu farklı görünür türleri arasında ayrımcılık.

Şekil bu hızlı kalsiyum dalgalanmaların Başka bir örnek gösterilmiştir. 4. Üst grafik uyarılmış ventriküler kardiyomiyositlerde (kırmızı) ve ortalama 3 satır izleri siyah gösterilir için ham hat verileri gösterir. Bu kalsiyum dalgalanmalar Gα _q aracılığı ile olduğu ölçüde belirlemek için caveoline3 etkileşimleri, kaveolin-3 aldırır bir peptid microinjected uzun Ca ² ortadan kaldırır Gα _q etkileşimler (yani Cav3 peptid) ⁺ mevcut ve bu veriler mavi ile yazılmıştır.(Biz iki izlerini daha iyi ayırt edilebilir böylece Cav3 peptid yoğunluğu 500 çıkarılır unutmayın).

Excel dosyaları içine Sigmaplot (Jandel, Inc.) Ham veri sütunları ithal ve histogram analizi yapıldı. Bu analizde, olayların sayısının bir histogram kutuları üretmek için eşit sayıda (bidonları) gruplandırılmıştır. Bin genişliği eşit bir zaman aralığını temsil eder. Yoğunlukları farklı zaman eklenir, belirli bir bin yükseklik yoğunluğu belirli bir zaman penceresi oluşur sayısını temsil eder o kadar bağlanır. Bu tür bir analiz, sadece aynı tarama hızında veri toplama bağlı olduğundan, aynı anda birçok izlerini analiz edilebilir. Ayrıca, bu analiz, boya düzeylerinde farklılıklar, lazer gücü, vb, elektronik ve arka plan gürültü zaman ölçeklerinde çok hızlı gerçekleşir duyarlı değildir ve sadece ilk 1-2 kutularına görülür.

Ilgili histograŞekil ham veri ms. 4 sayfanın alt kısmında gösterilmiştir. Kontrol hücreleri için histogram kırmızı hat (çizgi göz rehberlik ve hiçbir modeli kabul edilir) tarafından tasvir gibi geniş bir zaman dağılımı, ilgili kutuları çok sayıda yayılmıştır. Buna karşılık, Gα _q-Cav3 etkileşim peptid tarafından kesintiye uğramıştır hücrelerinin yanıt için kutulara peptidin varlığını uzun süre akıları ortadan kaldırır düşündüren dar bir bin dağıtım sınırlı. Mikroenjeksiyon Gα _q-Cav3 bozmayan bir kontrol peptid un enjekte edilen hücrelerin ⁸ 'e benzer bir histogram üretir.

Şekil. 5 Ca ^{2 +} yetişkin köpek ventriküler kardiyomiyositlerde Yeşil (solda) ve taze hızlı yoğunluk dalgalanmaları, caveolae (sağda) eksikliği unstimulated sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerde karşılaştırın. Burada, 3 dakikalık bir süre içinde şiddetlerinin ilgili histogramlar binned 35 yavaş kalsiyum olayları görüntülemek için. Yenidoğan kardiyomiyositlerde daha yapılandırılmış bir bazal yetişkin hücreler için ise daha yavaş Ca ^{2 +} aktivite eksikliği gösteren düz bir başlangıç ​​hızlı dalgalanmalar gösterir unutmayın. Bu farklılıklar en kolay histogramlar görülmektedir.

Gα _q dağılımını gösteren köpek yetişkin ventriküler kardiyomiyositlerinin Şekil 1. Görüntüleri Alexa-488 488nm Argon-iyon lazer hattı ve görüntü ile heyecanlıydı Alexa-488 ile immunolabeled BP505-530nm emisyon filtre kullanarak kaydedildi. Sağ üst 633-nm hattı ile heyecan Alexa-647 ile immunolabeled kaveolin-3 lokalizasyonu ile ilgilenen aynı görüntüyü O: Ne lazer ve LP650 nm emisyon filtre kullanılarak kaydedilmiş. Genişletilmiş bir görüntü ile sağ sol alt ko-turuncu renkte görülür birleştirilen görüntü.

"Pdflinebreak">

Şekil 2: Kalsiyum görüntüleme yaşayan bir köpek yetişkin ventriküler kardiyomiyosit, ^{Ca 2 +} Yeşil ile yüklenir . Görüntü 40x hedefi ile 488nm Argon iyon lazer ve LP515 emisyon filtre kullanarak bir konfokal lazer tarama mikroskobu sistem üzerinde alınmıştır. 1200 satır görüntü oluşur, piksel süresi 2 μs yaşamak ve piksel boyutu 0.1 mikron idi.

Şekil 3 TOP Yoğunluk dalgalanmalar yaşayan bir köpek yetişkin ventriküler Ca ^{2 +} Yeşil yüklü olarak tarif görüntülü kardiyomiyosit ve ALT 5 mcM karbakol'ün ek tarafından uyarılır aynı hücrede bir çizgi izlemesi.

/ 3505fig4.jpg "/>
Şekil 4 Ca ² ile yüklenen yaşayan bir köpek yetişkin ventriküler kardiyomiyosit çizgi izleri bir örnek TOP ortalama 3 izlerinin, siyah bir çizgi olarak gösterilir ve microinjected bir hücre göre 180 ms üzerinden ^{alınan +} Yeşil (kırmızı ) bir peptid ile ortalama üç izleri siyah Gα _q-kaveolin 3 derneği (kırmızı) bozar. Biz alt görüntüleme amaçlı veri kümesinden 400 yoğunluğu sayıları çıkarılır unutmayın. Alt paneller metinde açıklandığı gibi binned verilerin ilgili histogramlar ve bin sayısı isteğe bağlıdır ve bin sayısı (ya da sayısı) o belirli bin yoğunluğu toplam tutarı karşılık. Biz kontrolü (solda) ve peptid (sağ) histogramlar çizilen çizgi, kırmızı ve mavi çizgiler, verilerin kolay bir şekilde belirlenmesine ve karşılaştırmalar için izin vermek ve bir model kabul olduğunu unutmayın.

files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg "/>
Şekil 5 Yoğunluğu dalgalanmalar Ca ^{2 +} yetişkin köpek ventriküler kardiyomiyositlerde Yeşil (solda) ve caveolae (sağda) ve bunlara karşılık gelen histogramlar eksikliği taze, unstimulated sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerde aşağıda gösterilmiştir.

Discussion

Biz yaşam kardiyomiyositlerde hızlı kalsiyum sinyalleri görüntüleyebilir ve izole etmek için bir yöntem geliştirdik. Bu ölçümlerin deneysel koşullar altında, daha önce diğer hücre sistemleri ¹⁰ gibi kardiyomiyositlerde ¹¹ uygulanmış olsa da, histogramlar ve bin analiz birçok Ca ^{2 +} olayları elde edilecek veri sağlar. Daha hızlı olaylar yavaş olanlar ve bunların altında yatan mekanizmaları anlamak için uyarlanmış modelleri kolayca izole edilebilir. Kültürleme kardiyomiyositlerde, çok sayıda birincil hücre hatları gibi zor olabilir. Genellikle hücreler elde edildikten sonra ölçümleri yakında alınması gerektiği düşünülmektedir iken, biz, biz bu çalışmada kullanılan, yetişkin köpek kardiyomiyositlerde sadece 3 gün sonra kendilerine özgü özelliklerini kaybetmeye başlar ki bulduk. Bu uzun zaman diliminde hücreler hücreleri gibi mikroenjeksiyon gibi potansiyel olarak ölümcül tedavileri ayakta kalacak sigortalanması yüzeye sıkıca bağlamak için sağlar. Firma eklenti kritikmikroenjeksiyon başarısını.

Biz bunların etkileşimi bozar peptid microinjecting kalsiyum akıları Gα _q-kaveolin 3 dernek rolü doğrulandı. Biz mikroenjeksiyon hücre ve hücresel içeriği kaçak zarar en aza indirmek için büyük bir titizlikle yapılması gerektiğini vurgulamak istiyorum. Ancak, bu risklerin nispeten büyük kardiyomiyositlerde içine yeterli miktarda malzeme sağlamak için gerekli olan daha geniş çaplı iğnelerin kullanımı ile dengeli olmalıdır. Gibi DAPI gibi bir hücreler mikroenjeksiyon olduğunuz izlemenize olanak sağlayan bir boya dahil edilmesi önemlidir. Belirtildiği gibi, mikroenjeksiyon miyositler için, kalsiyum özgür ortamda ve kalsiyum enjekte edilen çözümler de ücretsiz yıkandığı olduğunu önemlidir. Ekstrasellüler kalsiyum akını kasılmaları ve hücre ölüme başlatır

Kendilerini diğer hücre tipleri, boyalar ve konfokal lazer adapte edilebilir ölçümleriCa ^{2 +} akıları kesinlikle en karmaşık hücresel haberciler olmasına rağmen sistemleri, insoitol 1,4,5 trisphospate ve cAMP akıları gibi diğer hızlı hücre olayları takip etmek. Bir floresan göstergeleri, düşük lazer güçler kullanılacak şekilde kolayca photobleached ve sağlam ve dinamik bir floresan yanıt değildir seçme hakkında dikkatli olmalıdır. Düşük lazer gücü de istenmeyen hücresel etkiler doğurabilecek yerel ısıtma önlemek olacaktır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234