מדידת Fluxes סידן מהיר ב cardiomyocytes

Summary

אנו מציגים שיטה לבודד מהירה (מיקרו) האירועים סידן והנתיבים איטי יותר בתאים חיים באמצעות לייזר מיקרוסקופיית confocal. שיטה מודד תנודות בעוצמת הקרינה של אינדיקטורים סידן על ידי קו סריקות הקלטה מאות פיקסלים מספר בתא. ניתוח היסטוגרמה מאפשר לנו לבודד את הכף זמן של והנתיבים סידן שונים.

Abstract

Cardiomyocytes יש מספר רב של Ca ^{2 +} והנתיבים משתנה משך שפועלים יחד כדי לייעל ^1,2 לתפקד. שינויים Ca ^{2 +} לפעילות בתגובה סוכני תאי מווסת בעיקר על ידי מסלול phospholipase _q Cβ-Gα מקומי על קרום הפלזמה אשר מגורה על ידי הסוכנים כגון אצטילכולין ^3,4. לאחרונה מצאנו כי חלבון הנקרא פלזמה קרום תחומים caveolae ^5,6 יכול ללכוד מופעל Gα _q ^7. מלכודת זו יש אפקט של ייצוב מצב של הפעלת Gα _q וכתוצאה מכך Ca ^{2 +} ממושכת אותות cardiomyocytes סוגי תאים אחרים ^8. חשפנו תוצאה זו מפתיעה על ידי מדידת התגובות סידן דינמי בקנה מידה מהיר cardiomyocytes חיים. בקצרה, תאים נטענים עם אינדיקטור ניאון Ca ^{+ 2.} במחקרים, השתמשנו Ca ^{2 +} ירוק (Invitrogen, בג) אשר מציג עלייה בעוצמת פליטת הקרינה על הכריכה של יוני סידן. עוצמת הקרינה היא רשמה אז לשימוש במצב קו סריקה של קרן לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal. שיטה זו מאפשרת רכישה מהירה של מהלך הזמן של עוצמת הקרינה בפיקסלים לאורך קו נבחר, לייצר כמה מאות עקבות הזמן בסולם זמן המיקרו. עקבות אלה מהר מאוד מועברים לתוך Excel ולאחר מכן לתוך Sigmaplot לניתוח, והם לעומת עקבות שהתקבלו רעש אלקטרוני, לצבוע בחינם, פקדים אחרים. כדי לנתח Ca ^{2 +} התגובות של שיעורי השטף שונות, ביצענו ניתוח ההיסטוגרמה כי זרקת לפח בעוצמות פיקסל עם הזמן. Binning מאפשר לנו קבוצה מעל 500 עקבות של סריקות לחזות את התוצאות שנאספו במרחב ובזמן על מגרש אחד. לפיכך, להאט את גלי Ca ^{2 +} שקשה להבחין כאשר הסריקות הם כיסו בשל מיקום שיא רעש שונים, ניתן לראות בקלותהיסטוגרמות זרקת לפח. והנתיבים מהר מאוד בסולם זמן המדידה להראות הפצה הצר של עוצמות של פחי זמן קצר מאוד כבר בעוד Ca ^{2 +} גלי להראות נתונים זרקת לפח עם הפצה רחבה מעל פחי זמן רב יותר. אלו הפצות זמן שונים מאפשרים לנו לנתח את התזמון של Ca ^{2 +} והנתיבים בתאים, ולקבוע את השפעתם על אירועים הסלולר השונות.

Protocol

1. תאים טוען עם אינדיקטורים סידן

1. פלייט תאים 35mm תחתית זכוכית MatTek מנות (או כל תחתית זכוכית אחרים לתאי הצפייה).
2. אם אתה משתמש העיקרית מעיל myocytes יום 1 לפני לתאי עם 10μg/ml laminin. פלייט myocytes לב (מבודד כלבים בוגרים, חולדות הילוד, או אורגניזם אחר) ב KB חיץ (K-היפוך חיץ Tyrode 35 mmol / L של HEPES, 140 mmol / L של KCl, 8 mmol / L של ₃ KHCO, 2 mmol / L של MgCl _2, ו - 0.4 mmol / L של KH ₂ PO _4, pH 7.5) ולשנות אותה בהדרגה עד בינוני M199 בתוספת סרום 15% שור העובר streptamycin גנטמיצין 1% ו 0.5% ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב -5% CO _2.
3. דגירה תאים עם סידן ירוק בבוקר (1-5 מיקרומטר, בדיקות מולקולריות) או כל אינדיקטור הסידן הרצויה 30-45 דקות בטמפרטורת החדר. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום, כדי למנוע photobleaching של צבע.
4. שוטפים את התאים שלוש פעמים עם המדיום Leibovitz15 עם 14mm EGTA (אם ביצוע ניסויים סידן נמוכה) או כל מדיה הצפייה המתאים.
5. דגירה לעוד 30-45 דקות Leibovitz15 בינוני containing14mM EGTA.
6. אם בדיקת ההשפעות של מעכבי (כלומר 10μM U73122 PLC מעכב) להוסיף אותם במהלך הדגירה השני.

2. Microinjecting תאים

1. תרבות cardiomyocytes בתחתית צלחות זכוכית MatTek (או בתאי הצפייה אחרים) עבור 24h.
2. שינוי בינוני עד פנול ללא ליבוביץ-15 עם 14 מ"מ EGTA (cardiomyocytes צריך להיות מוזרק במדיום סידן בחינם, תאים אחרים יהיה ניתן להזריק בסידן המכיל בינוני).
3. הכן פתרון microinjection - מחקרים שלנו השתמשו פפטיד זה מבטל Gα _q - אינטראקציות caveolae. זכור כי רק כמות קטנה של נפח מוזרק לתוך התא (~ פלורידה) ולכן המניות מרוכז סביר חייב לשמש. השתמשנו 2 מיקרומטר של פפטיד זה, Cav3-הפיגום, עם DAPI ב בינוני סידן חופשי. DAPI הוא Bluדואר צבע הצובע את גרעין ומאפשר זיהוי של תאים שעברו microinjected. DAPI לא להפריע הקרינה של אינדיקטורים סידן רבים. כמות DAPI משתנה ואנו משתמשים בדרך כלל מספיק כדי להמחיש את הגרעין (0.5 ו - 2 מיקרומטר)
4. הכן פתרון בקרת המכיל DAPI - נותב לצבוע לבד.
5. עבור microinjections משתמשים במחטים עצמית או משך זמינים מסחרית. עיסוק עם הזרקת צבע כדי לקבוע פרמטרים מחט תקין. נציין כי תאים שונים עשויים לחייב בקטרים ​​מחט שונים ולחצים microinjection.
6. השתמש במערכת microinjection אוטומטיות, למשל NI2 InjectMan עם משאבה FemtoJet מ Eppendorf. הגדר את הלחץ הזרקת P _i עד 90 hPa, והלחץ פיצוי P _ג עד 45 hPa. הגדר את t זמן הזרקה ל -0.7 ש ' להסתגל הפרמטרים של ההזרקה כפי הצורך.
7. בצע microinjections על מיקרוסקופ הפוכה (למשל Zeiss Axiovert 200 מיליון) מצויד אובייקטיבי עבודה ארוכות שלב לעומת המרחק (למשל השלב אוויר 40X 2 אובייקטיבי).
8. להזריק כמו תאים רבים ככל האפשר בצורה מהירה. בחן את התאים מוזרקים באמצעות הניגוד שלב לבחור תאים קיימא.

3. Co-immunofluorescence מחקרים

1. שטפו פעמיים עם תאים PBS ולתקן עם paraformaldehyde 3.7% במשך 30 דקות. במידת הצורך, תאים יכולים להיות מגורה לפני קיבוע.
2. שטפו תאים קבוע שלוש פעמים עם PBS, ו דגירה עם 0.2% NP40 ב PBS עבור 5minutes.
3. חסום באמצעות PBS המכילה סרום עיזים 4% (או הסרום מתאים אחר) עבור 1hour.
4. דגירה תאים עם נוגדן ראשוני בדילול מתאים עם סרום עזים 1% PBS עבור 1hour.
5. שטפו תאים שלוש פעמים במשך 10 דקות עם 150 mM NaCl, 25 מ"מ טריס, pH 7.6 ואחריו תוספת של נוגדנים ניאון שכותרתו משנית, כגון Alexa-פלואוריד-488 נגד ארנב או פלואוריד-Alexa-647 אנטי עכבר נוגדנים משני בדילול ל 1: 1000 1% עזים בסרום PBS (שימו לב שכאשר חיטוט שני חלבונים שונים נוגדנים הראשי חייב להיות וגדל מינים שונים משני חייב להיות כנגד זנים המתאימים).
6. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1hour, לשטוף שלוש פעמים עם כפות.
7. צפה תאים כפות חוצץ או אחר בינוני הצפייה המתאים.

4. סידן מהיר הדמיה

1. השתמש סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal (למשל Fluoview 1000 אולימפוס).
2. השתמש הצמצם גבוה אובייקטיבי מספרית.
3. הגדר את הפרמטרים הרכישה. עבור עירור ירוק סידן להשתמש ננומטר 488 וארוך להעביר 515 מסנני פליטה.
4. התאם את הזמן פיקסל - למדידות סידן מהיר להגדיר את זה 2 μs / פיקסל.
5. הגדר את הזום כדי להשיג תמונה גודל פיקסל של 0.05-0.3 מיקרומטר.
6. בחר קו מתא הבחירה באזור מסוים.
7. בחלון בקר הזמן לבחור רכישת זמן לפחות 1500 סריקות (כדי לקבל הרצוי מסגרת הזמן שלהתגובה - 1.3 ms / קו תניב 2 שניות).
8. רקע שיא קריאה לפני הגירוי.
9. לעורר תאים עם carbachol 5 מיקרומטר ומיד להתחיל נתונים ההקלטה. שמור תאים למ"ל של 1 בינוני Leibovitz15, להכין carbachol 10 מיקרומטר Leibovitz15 ולהוסיף בעדינות 1 מ"ל לתוך התבשיל

5. ניתוח נתונים

1. חלץ את עוצמות עבור כל פיקסל של התמונה נרשם. שמור את הנתונים עוצמת כטבלה Fluoview 1000 באמצעות התוכנה.
2. עוצמת ייבוא ​​נתונים לתוך Sigmaplot או תוכנית נתונים דומים ניתוח סל את הנתונים לתוך פחי ~ 90-40. השווה לשלוט ניסויים רעש אלקטרוני.

6. נציג תוצאות:

אנחנו צילמו תאים סריקת לייזר מיקרוסקופ LSM510 confocal (Zeiss, Jena, גרמניה) מצויד עירור רב קווי לייזר 40x/1.2 מים NA apochromat אובייקטיבי טבילה. באיור. 1 (אדום) אנו להראות את distribution של caveolae ב כלבים חדרית cardiomyocytes מבוגר כי תוקנו ומוכתמת עם נוגדן ל caveolin-3 אשר הוא החלבון העיקרי caveolar מבניים תאים אלה ^9. Caveolin-3 היה immunolabelled עם Alexa-647 ונרגש עם קו 633 ננומטר מן הוא: לייזר Ne. תמונות נרשמו באמצעות LP650 פליטת לסנן ננומטר. חלוקת caveolin-3 היה לעומת Gα _q שהיה immunolabeled עם Alexa-488 (ירוק). אלקסה-488 היה נרגש עם קו 488nm לייזר ארגון יון ואת התמונה נרשם באמצעות מסנן פליטה BP505-530nm. אלה מדידות colocalization, שני fluorophores התרגשו באופן רציף באמצעות רכישת מסלול רב. הליך זה מצמצם ערוץ צולבות לדבר. ניתוח נתונים עבור colocalization בוצעה באמצעות תוכנת AIM מסופק עם Zeiss LSM510-Meta. כפי שניתן לראות, שני החלבונים הם colocalized.

כדי לקבוע כיצד צימוד בין caveolin-3 ו Gα 2 + הירוק. אנו נרגשים לצבוע עם ארגון 488nm לייזר יון, אסף תמונות דרך פילטר LP515 פליטה. מסגרות תמונה נאספו 500 מילישניות במרווחים. ערכים עוצמה עבור כל פיקסל הופקו באמצעות תוכנת Olympus ImageJ. מצב הסריקה קו שימש ניתוח כמותי של יותר Ca ^{2 +} הארעיים ואת Ca ^{2 +} ניצוצות. גודל פיקסל השתמשו במחקר הנוכחי 0.1-0.3 מיקרומטר. שיעור קו הסריקה היה על כמה מאות של μs בכל שורה. באיור. 2 אנו מציגים קו סריקה של Ca ^{2 +} גרין טעון cardiomyocyte שבו הפיקסל דפעם גם היה 2 μs, הפעם היה קו 142 μs. התמונה מורכבת מ 1200 שורות.

כל שורה של הסריקה תואמת את עוצמת תנודת Ca ^{2 +} ירוק המורכב של 71 נקודות השתלטו על מגוון μs 142, והוא יכול לשמש מהיר לקריאה מתוך לתגובות סידן. לדוגמה, באיור. 3 אנו להראות את Ca ^{2 +} פעילות של קו אחד של cardiomyocyte יחיד, כפי שנמדד על ידי Ca ^{2 +} עוצמת הקרינה גרין כפונקציה של הזמן בשניות לפני (למעלה) ואחרי (למטה) תוספת של 5 מיקרומטר carbachol אשר משפר רמת תאיים Ca ^{2 +} דרך פעילות _Q-PLCβ Gα. כאשר קווים רבים בממוצע, גירוי carbachol מייצרת ~ 1.8 להגדיל פי Ca ^{2 +} עוצמת הירוק. בשל שינויים בתנאי הניסוי (בטמפרטורת החדר, כוח לייזר, בתגובה גלאי, הפצות צבע, וכו '), עלייה זו לא ניתן לראות אדםקו סריקות. למרות ערכי עוצמת (ערכי ציר Y) דומים, ברור כי העלילה carbachol-מגורה בתחתית יש שיאים הרבה יותר רחב, המתאים רמות הסידן ממושך יותר, מאשר הפסגות תנודה צר ראיתי לפני הגירוי. עלייה זו הרחבה יחסית בעוצמה מטשטש קטנות, תנודות איטי יותר. המטרה שלנו היא טובה יותר להבחין בין סוגים אלה לכאורה שונים של תנודות סידן.

דוגמה נוספת של תנודות אלה סידן מהירה מוצג באיור. 4. הגרף העליון מציג נתונים קו גלם cardiomyocytes חדרית מגורה (אדום) בממוצע של 3 עקבות קו מוצג שחור. כדי לקבוע את מידת כי תנודות אלה סידן היו בתיווך Gα _q - caveoline3 אינטראקציות, אנו microinjected פפטיד זה מערער caveolin-3 - Gα אינטראקציות _q (כלומר Cav3 פפטיד) אשר מבטלת את זמן Ca ^{2 +} הנוכחי נתונים אלה מוצגים בכחול(נציין, כי אנו מפחיתים 500 מ Cav3 עוצמות פפטיד כך ששני עקבות ניתן להבחין טוב יותר).

אנחנו המיובאים העמודות של נתונים גולמיים קבצי Excel שלנו Sigmaplot (Jandel, Inc) וביצעו ניתוח ההיסטוגרמה. בניתוח זה, במספר האירועים מקובצים מספר שווה של תיבות (הפחים) לייצר היסטוגרמה. רוחבו של סל מייצג מרווח שווה של זמן. עוצמות מוכנסים לתוך זמן שונים נקשר כל כך את גובה סל מסוים מייצג את מספר הפעמים שבהם מתרחשת בעוצמה בחלון זמן מסוים. מכיוון שסוג זה של ניתוח תלוי רק באיסוף נתונים בקצב לסרוק אותו, עקבות רבים ניתן לנתח בו זמנית. בנוסף, ניתוח זה אינו רגיש הבדלים ברמות הצבע, כוח לייזר וכד ', רעש רקע אלקטרוניים מתרחשת בסקלות זמן מהר מאוד נראים רק 1-2 פחי הראשון.

Histogra המקבילms של הנתונים הגולמיים באיור. 4 מוצגות בחלק התחתון של הדף. ההיסטוגרמה עבור התאים לשלוט פרושים על פני מספר גדול של פחי המתאים חלוקת זמן רחב, מתואר על ידי הקו האדום (הקו המנחה את העין ולא מודל ההנחה). לעומת זאת, פחי עבור התגובה של תאים שבו האינטראקציה _Q-Cav3 Gα הופרע על ידי פפטיד מוגבלים הפצה סל צר טוען כי נוכחות של פפטידים מבטלת והנתיבים משך זמן ארוך יותר. Microinjection של פפטיד שליטה שלא לשבש Gα _Q-Cav3 מייצרת ההיסטוגרמה דומה בלתי הזריקו תאים ^8.

באיור. 5 נשווה את עוצמת התנודות מהיר של Ca ^{2 +} גרין מבוגר cardiomyocytes חדרית כלבים (משמאל), טרי, cardiomyocytes עכברוש unstimulated בילוד כי חוסר caveolae (מימין). כאן, היסטוגרמות המקביל לעוצמות במשך 3 דקות היו זרקת לפח? בגיל 35 כדי להציג אירועים הסידן איטית יותר. שים לב cardiomyocytes בילוד להציג תנודות מהיר על בסיס שטוח מראה את חוסר Ca ^{2 +} פעילות איטית בזמן בסיסית יותר מובנה נתפסת של תאים בוגרים. הבדלים אלה נראים הכי בקלות היסטוגרמות.

באיור 1. תמונות של כלבים חדרית cardiomyocytes מבוגר המציג את התפלגות Gα _q immunolabeled עם Alexa-488-488 שם אלכסה היה נרגש עם קו 488nm לייזר ארגון יון ואת התמונה נרשם באמצעות מסנן פליטה BP505-530nm. הזכות העליונה היא אותה תמונה הצגת לוקליזציה של caveolin-3 immunolabeled עם Alexa-647, נרגש עם קו 633 ננומטר מן הוא: Ne לייזר והקליט באמצעות LP650 פליטת ננומטר הסינון. התמונה הממוזגת איפה colocalization נתפסת כתום בפינה השמאלית התחתונה עם תמונה מורחבת ימינה.

"Pdflinebreak">

באיור 2. הדמיה של סידן cardiomyocyte חדרית החיים כלבים בוגרים עמוסה Ca ^{2 +} הירוק. התמונה צולמה על מערכת סריקת לייזר confocal מיקרוסקופ עם מטרה 40X באמצעות ארגון 488nm יון לייזר מסנן LP515 פליטה. התמונה מורכבת מ 1200 שורות, הפיקסל להתעכב זמן היה 2 μs, ואת גודל פיקסל היה 0.1 מיקרומטר.

באיור 3. תנודות אינטנסיביות לראש עקבות שורה cardiomyocyte מבוגרים החיים כלבים חדרית עמוסה Ca ^{2 +} הירוק הדמיה כמתואר, ובתחתית התא אותו מגורה על ידי תוספת של carbachol 5 מיקרומטר.

/ 3505fig4.jpg "/>
איור 4. TOP דוגמה עקבות קו cardiomyocyte מבוגרים החיים כלבים חדרית עמוסה Ca ^{2 +} ירוק (אדום) השתלטו על 180 ms איפה את הממוצע של 3 עקבות מוצג כקו שחור, לעומת תא זה היה microinjected עם פפטיד זה משבש Gα _Q-caveolin 3 העמותה (אדום) שבה בממוצע שלוש עקבות הוא שחור. נציין כי אנו מפחיתים 400 ספירת עוצמת מהמערך התחתון של נתונים למטרות צפייה. לוחות נמוך הם היסטוגרמות המקביל הנתונים זרקת לפח כמתואר הטקסט, שבו מספר בן היא שרירותית את ספירת סל (או פשוט לספור) מתאים הסכום הכולל של עוצמת לפח המסוים הזה. יש לציין כי קווי קו אדום וכחול נמשך בשליטה (משמאל) פפטיד (מימין) היסטוגרמות הן כדי לאפשר זיהוי קל יותר השוואות של הנתונים ולא מודל ההנחה.

files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg "/>
איור 5. תנודות העוצמה של Ca ^{2 +} גרין מבוגר cardiomyocytes חדרית כלבים (משמאל), טרי, cardiomyocytes עכברוש unstimulated בילוד כי חוסר caveolae (מימין) היסטוגרמות המתאימים מוצגים להלן.

Discussion

פיתחנו שיטה להציג לבודד אותות סידן המהירה cardiomyocytes חיים. בעוד תנאי הניסוי של מדידות אלה בעבר ליישם מערכות תאים אחרים, כמו גם ¹⁰ cardiomyocytes ^11, השימוש היסטוגרמות וניתוח סל מאפשרת נתונים רבים Ca ^{2 +} אירועים להירכש. אירועי מהר ניתן לבודד בקלות מאלו ומודלים איטי מותאם להבין המנגנונים שלהם. Cardiomyocytes culturing, כמו הרבה שורות תאים ראשוניים, יכול להיות קשה. למרות שמקובל לחשוב כי המדידות יש לנקוט זמן קצר לאחר התאים נרכשים, מצאנו כי cardiomyocytes כלבים בוגרים השתמשנו במחקר זה רק מתחיל לאבד את המאפיינים הספציפיים שלהם לאחר 3 ימים. זו מסגרת זמן ארוך יותר מאפשר לתאים לצרף בתוקף על המצע לבטח כי התאים ישרדו הטיפולים פוטנציאל קטלני כמו microinjection. התקשרות המשרד הוא קריטילהצלחת microinjection.

אנו לאמת את התפקיד של Gα _Q-caveolin 3 העמותה והנתיבים סידן ידי microinjecting פפטיד זה משבש את האינטראקציה שלהם. ברצוננו להדגיש כי microinjection חייב להיעשות בזהירות רבה כדי למזער פגיעה התא דליפה של תוכן סלולרי. עם זאת, סיכונים אלה חייבת להיות מאוזנת על ידי שימוש במחטים בקוטר גדול יותר כי יש צורך לספק כמות מספקת של חומר לתוך cardiomyocytes גדול יחסית. הכללתו של צבע כגון DAPI המאפשר אחד כדי לעקוב אחר תאים אשר כבר microinjection חשוב. כאמור, חשוב כי עבור myocytes microinjection שטופים בינוני סידן חופשי כי הפתרונות מוזרק גם ללא סידן. זרם של סידן תאיים יוזם התכווצויות ומוות עוקבות של תאים

המדידות עצמן ניתן להתאים סוגי תאים, צבעים אחרים לייזר confocalמערכות כדי לעקוב אחר אירועים כגון תאים מהירה trisphospate 1,4,5 insoitol והנתיבים המחנה, למרות ² Ca ⁺ והנתיבים הם בהחלט אחד השליחים הסלולר המורכבים ביותר. אחד צריך להיות זהיר לגבי בחירת האינדיקטורים פלורסנט שאינן photobleached בקלות ויש להם תגובה הקרינה החזקה ודינמי כך סמכויות לייזר נמוך יכול לשמש. כוח לייזר נמוך יהיה גם למנוע חימום מקומי אשר יכול להצמיח תופעות הסלולר רצויות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234