Cardiomyocytes में फास्ट कैल्शियम अपशिष्टों को मापने

Summary

हम रहने वाले confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेसर का उपयोग कर कोशिकाओं में धीमी अपशिष्टों से तेजी microsecond () कैल्शियम की घटनाओं को अलग करने की विधि प्रस्तुत करते हैं. विधि एक सेल में कई सौ पिक्सल के रिकॉर्डिंग लाइन स्कैन द्वारा कैल्शियम संकेतकों के प्रतिदीप्ति तीव्रता उतार चढ़ाव के उपाय. हिस्टोग्राम विश्लेषण हमें अलग कैल्शियम अपशिष्टों के समय तराजू अलग करने के लिए अनुमति देता है.

Protocol

1. कैल्शियम संकेतक के साथ लोड हो रहा है कोशिकाओं

1. प्लेट 35 मिमी गिलास नीचे MatTek बर्तन में कोशिकाओं (या किसी भी अन्य गिलास नीचे कक्षों को देखने).
2. 10μg/ml laminin के साथ पहले प्राथमिक myocytes कोट कक्षों 1 दिन का उपयोग कर यदि. प्लेट KB (कश्मीर उलटा Tyrode बफर बफर में हृदय myocytes (वयस्क कुत्तों, नवजात चूहों, या अन्य जीव से अलग) 35 mmol / HEPES के एल, 140 KCl, 8 mmol / एल KHCO _3, 2 / mmol के mmol / एल ₂ MgCl के एल, और 0.4 mmol / के.एच. _{2 4} पीओ, 7.5 पीएच के एल) और यह धीरे - धीरे बदलने के M199 15% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% streptamycin और 0.5% gentamicin 37 और सेते के साथ पूरक मध्यम ° सी में 5 % सीओ _2.
3. कोशिकाओं के साथ या कमरे के तापमान पर 30-45 मिनट के लिए किसी भी वांछित कैल्शियम सूचक, कैल्शियम हरी (आण्विक जांच 1-5 सुक्ष्ममापी) AM सेते हैं. कवर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ पकवान डाई की photobleaching से बचने के लिए.
4. कोशिकाओं 14mm EGTA साथ Leibovitz15 मध्यम (के साथ तीन बार धोअगर कम कैल्शियम प्रयोगों में) या किसी उपयुक्त देखने के मीडिया प्रदर्शन.
5. Leibovitz15 मध्यम containing14mM EGTA में एक और 30-45 मिनट के लिए सेते हैं.
6. यदि inhibitors के प्रभाव का परीक्षण (यानी 10μM U73122 पीएलसी अवरोध करनेवाला) दूसरा ऊष्मायन के दौरान उन्हें जोड़ने.

2. Microinjecting कोशिकाओं

1. गिलास नीचे MatTek व्यंजन (या अन्य कक्षों को देखने) में संस्कृति 24 घंटों के लिए cardiomyocytes.
2. Phenol के मुक्त लेबोविट्ज़-15 के लिए 14 मिमी EGTA के साथ मध्यम बदलें (cardiomyocytes कैल्शियम मुक्त माध्यम में इंजेक्ट किया, अन्य कोशिकाओं मध्यम युक्त कैल्शियम में इंजेक्ट किया जा सकता है).
3. Microinjection समाधान तैयार - हमारे अध्ययन एक पेप्टाइड है कि _Gα क्ष समाप्त - caveolae बातचीत . ध्यान रखें कि केवल मात्रा की एक छोटी राशि सेल (FL ~) में इंजेक्ट किया है और इतनी उचित ध्यान केंद्रित शेयरों इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हम DAPI के साथ कैल्शियम मुक्त माध्यम में इस पेप्टाइड 2 सुक्ष्ममापी, Cav3 पाड़, इस्तेमाल किया. DAPI एक Blu हैई डाई है कि नाभिक दाग और microinjected किया गया है कि कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है. DAPI कई कैल्शियम संकेतकों के प्रतिदीप्ति के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. DAPI की राशि चर रहा है और हम आम तौर पर पर्याप्त उपयोग के नाभिक कल्पना (0.5 और 2 सुक्ष्ममापी)
4. डाई अकेले दरियाफ्त नियंत्रण DAPI युक्त समाधान तैयार करें.
5. के लिए microinjections स्वयं खींच या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सुइयों का उपयोग. डाई इंजेक्शन के साथ अभ्यास के लिए उचित सुई मापदंडों का निर्धारण. हम ध्यान दें कि विभिन्न कोशिकाओं को अलग सुई व्यास और microinjection दबाव की आवश्यकता हो सकती है.
6. स्वचालित प्रणाली microinjection Eppendorf से FemtoJet पंप के साथ एक InjectMan NI2 उदाहरण के लिए, प्रयोग करें. इंजेक्शन दबाव पी 90 को _मैं एचपीए, और मुआवजा दबाव पी 45 _ग एचपीए सेट. सेट 0.7 से इंजेक्शन समय टी एस आवश्यकता के रूप में इंजेक्शन के मापदंडों का मरम्मत करना.
7. एक औंधा (खुर्दबीन जैसे Zeiss Axiove पर microinjections प्रदर्शनआर टी 200M) लंबे समय तक काम दूरी चरण विपरीत उद्देश्य (हवा 40x चरण उदाहरण 2 उद्देश्य के लिए) के साथ सुसज्जित है.
8. एक तेजी से फैशन में संभव के रूप में कई कोशिकाओं के रूप में इंजेक्षन. इंजेक्शन चरण विपरीत का उपयोग करने के लिए व्यवहार्य कक्षों का चयन कोशिकाओं की जांच.

3. सह - immunofluorescence अध्ययन

1. कोशिकाओं को दो बार पीबीएस के साथ धो लें और 30 मिनट के लिए 3.7% paraformaldehyde के साथ ठीक है. यदि आवश्यक हो, कोशिकाओं निर्धारण से पहले प्रेरित किया जा सकता है.
2. तय कोशिकाओं पीबीएस के साथ तीन बार धो, और 5minutes के लिए 0.2% पीबीएस में NP40 के साथ सेते.
3. पीबीएस 1hour के लिए 4% बकरी सीरम (या अन्य उपयुक्त सीरम) युक्त का उपयोग कर ब्लॉक.
4. उपयुक्त कमजोर पड़ने पर 1% पीबीएस में 1hour लिए बकरी सीरम के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं सेते हैं.
5. कोशिकाओं फ्लोरोसेंट लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के Alexa-Fluor - 488 विरोधी खरगोश या Alexa-Fluor-647 माध्यमिक विरोधी माउस पतला एंटीबॉडी के रूप में इसके अलावा, द्वारा पीछा 150 मिमी NaCl, 25 मिमी Tris, पीएच 7.6 के साथ 10 मिनट के लिए तीन बार धो 1 करने के लिए: 1000 PBS में 1% बकरी सीरम (कृपया ध्यान दें कि जब दो अलग अलग प्रोटीन के लिए जांच प्राथमिक एंटीबॉडी विभिन्न प्रजातियों में उठाया जाना चाहिए और माध्यमिक इसी प्रजातियों के खिलाफ होना चाहिए).
6. 37 में सेते ° 1hour के लिए सी, टीबीएस के साथ तीन बार धो लो.
7. टीबीएस बफर या किसी अन्य उपयुक्त देखने के मध्यम में कोशिकाओं को देखें.

4. फास्ट कैल्शियम इमेजिंग

1. लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग (उदाहरण के लिए FluoView 1000 ओलिंप) का प्रयोग करें.
2. उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य का उपयोग करें.
3. अधिग्रहण पैरामीटर सेट. कैल्शियम हरी उपयोग 488 एनएम उत्तेजना के लिए और लंबे समय तक 515 उत्सर्जन फिल्टर पास.
4. पिक्सेल समय समायोजित - तेजी से कैल्शियम मापन के लिए यह 2 μs / पिक्सेल के लिए सेट.
5. छवि ज़ूम सेट के लिए 0.05 का पिक्सेल आकार को प्राप्त करने - 0.3 सुक्ष्ममापी.
6. पसंद की एक विशेष क्षेत्र में एक सेल से एक पंक्ति का चयन करें.
7. समय नियंत्रक विंडो में कम से कम 1500 (स्कैन करने के लिए समय सीमा के वांछित के लिए समय अधिग्रहण का चयन करेंप्रतिक्रिया - 1.3 एमएस / लाइन उपज 2 सेकंड).
8. रिकॉर्ड पृष्ठभूमि उत्तेजना से पहले पढ़ रहे हैं.
9. 5 सुक्ष्ममापी carbachol के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित और तुरंत रिकॉर्डिंग डेटा शुरू करते हैं. कोशिकाओं Leibovitz15 माध्यम से 1 एमएल में रखें, Leibovitz15 में 10 सुक्ष्ममापी carbachol तैयार और डिश में धीरे 1 एमएल जोड़ने

5. डेटा विश्लेषण

1. दर्ज की छवि से प्रत्येक पिक्सेल के लिए तीव्रता निकालें. FluoView 1000 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कोई तालिका के रूप में तीव्रता डेटा सहेजें.
2. आयात Sigmaplot में तीव्रता डेटा या एक समान डेटा विश्लेषण प्रोग्राम और बिन ~ 9-40 डिब्बे में डेटा. प्रयोगों और इलेक्ट्रॉनिक शोर को नियंत्रित करने के लिए तुलना.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

हम पर कक्षों लेजर confocal सूक्ष्मदर्शी (Zeiss, जेना, जर्मनी) LSM510 बहु - रेखा लेजर उत्तेजना और एक 40x/1.2 एनए apochromat पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ सुसज्जित स्कैनिंग imaged. अंजीर में. 1 (लाल) हम distributio दिखानेn कुत्ते वयस्क निलय cardiomyocytes कि निर्धारित किया गया है और caveolin-3 के लिए एक एंटीबॉडी जो ^इन 9 कोशिकाओं में प्रमुख संरचनात्मक caveolar प्रोटीन के साथ दाग में caveolae की. Caveolin-3 Alexa 647 के साथ immunolabelled किया गया था और एक वह से 633 एनएम के साथ लाइन में उत्साहित: Ne लेजर. छवियाँ LP650 एनएम उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर दर्ज किए गए. caveolin-3 के वितरण Gα _क्ष कि एलेक्सा-488 (हरा) के साथ immunolabeled किया गया था की तुलना में किया गया था. एलेक्सा 488 488nm लेजर आर्गन आयन लाइन के साथ उत्साहित थी और छवि BP505-530nm उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर दर्ज की गई थी. इन colocalization माप में, दो fluorophores एक अनुक्रमिक तरीके का उपयोग मल्टी ट्रैक अधिग्रहण में उत्साहित थे. यह प्रक्रिया चैनल पार बात कम से कम. Colocalization के लिए डेटा विश्लेषण AIM LSM510 - मेटा Zeiss के साथ प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग किया था. के रूप में देखा जा सकता है, दो प्रोटीन colocalized हैं.

कैसे निर्धारित करने के लिए caveolin-3 और Gα के बीच युग्मन 2 Ca ⁺ ग्रीन के साथ भरी हुई थी . हम एक 488nm आर्गन आयन लेजर के साथ डाई उत्साहित और एक LP515 उत्सर्जन फिल्टर के माध्यम से एकत्र की छवियों. छवि फ्रेम 500 एमएस अंतराल पर एकत्र किए गए थे. प्रत्येक पिक्सेल के लिए तीव्रता मूल्यों ओलिंप सॉफ्टवेयर और ImageJ का उपयोग कर निकाले गए थे. स्कैन लाइन मोड तेजी Ca ^{2 +} यात्रियों और सीए ^{2 +} स्पार्क्स के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था . वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त पिक्सेल आकार 0.1-0.3 सुक्ष्ममापी किया गया था. पंक्ति स्कैन दर के बारे में प्रति पंक्ति μs के कई सौ किया गया था. अंजीर में. 2 हम एक ² Ca की एक पंक्ति स्कैन ⁺ ग्रीन लोड cardiomyocyte जहां पिक्सेल घ दिखानेअच्छी तरह से समय 2 μs था, लाइन समय 142 μs था. 1200 लाइनों की छवि बना है.

स्कैन की प्रत्येक पंक्ति ² Ca की तीव्रता अस्थिरता से मेल खाती है ^है + ग्रीन एक 142 μs रेंज पर लिया 71 अंक से मिलकर, और कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के लिए एक तेजी से पढ़ने के बाहर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, छवि में. 3 हम Ca दिखाने ^{2 +} एक व्यक्ति cardiomyocyte की एक एकल लाइन की गतिविधि, के रूप में ^सीए द्वारा ² मापा + सेकंड में समय के एक समारोह के पहले (ऊपर) के रूप में और बाद में ग्रीन प्रतिदीप्ति तीव्रता (नीचे) के अलावा 5 सुक्ष्ममापी carbachol जो बढ़ाता है intracellular Ca ² के स्तर ⁺ Gα _q-PLCβ गतिविधि के माध्यम से. जब कई लाइनों औसत हैं, carbachol उत्तेजना एक ~ ² CA में 1.8 गुना वृद्धि का ^{उत्पादन} + ग्रीन तीव्रता . प्रयोगात्मक शर्तों में बदलाव (कमरे के तापमान, लेजर बिजली, डिटेक्टर प्रतिक्रिया, डाई वितरण, आदि) के कारण व्यक्ति में इस वृद्धि नहीं की जा देखा जा सकतालाइन स्कैन. हालांकि तीव्रता मान (y अक्ष मान) के समान हैं, यह स्पष्ट है कि तल पर carbachol उत्तेजित साजिश बहुत व्यापक चोटियों, संकीर्ण अस्थिरता उत्तेजना से पहले देखा चोटियों से अधिक निरंतर कैल्शियम का स्तर इसी है. तीव्रता में यह व्यापक बनाने और रिश्तेदार वृद्धि छोटे, धीमी दोलनों obscures. हमारा लक्ष्य बेहतर कैल्शियम उतार चढ़ाव के इन विभिन्न स्पष्ट प्रकार के बीच भेदभाव है.

इन तेजी से कैल्शियम उतार चढ़ाव का एक अन्य उदाहरण छवि में दिखाया गया है. 4. शीर्ष ग्राफ उत्तेजित निलय (लाल) cardiomyocytes और पंक्ति 3 के निशान के एक औसत काले रंग में दिखाया गया है के लिए कच्चे लाइन डेटा से पता चलता है. निर्धारित हद तक है कि इन कैल्शियम उतार _{चढ़ाव} Gα क्ष द्वारा मध्यस्थता थे - caveoline3 बातचीत करने के लिए, हम एक पेप्टाइड है कि _caveolin-3 destabilizes microinjected - Gα क्ष ^{बातचीत} (यानी Cav3 ^{पेप्टाइड)} + जो अब Ca 2 समाप्त वर्तमान और इन आंकड़ों नीले में हैं(हम ध्यान दें कि हम Cav3 पेप्टाइड तीव्रता इतनी है कि दो निशान बेहतर discerned किया जा सकता से 500 घटाया).

हम हमारे Sigmaplot में एक्सेल फ़ाइलें (Jandel इंक) से कच्चे डेटा के स्तंभों के आयात और बाहर एक हिस्टोग्राम विश्लेषण किया जाता है. इस विश्लेषण में, घटनाओं की संख्या बक्से की एक समान संख्या (डिब्बे) हिस्टोग्राम उत्पादन में बांटा है. बिन की चौड़ाई समय की एक समान अंतराल का प्रतिनिधित्व करता है. तीव्रता अलग समय में डाला कर रहे हैं तो बांधता है कि एक विशेष बिन की ऊंचाई बार की संख्या कि तीव्रता विशेष समय विंडो में होता है का प्रतिनिधित्व करता है. विश्लेषण के इस प्रकार के बाद से केवल एक ही स्कैन दर पर डेटा इकट्ठा करने पर निर्भर करता है, कई निशान एक साथ विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, इस विश्लेषण डाई स्तर में मतभेद, लेजर बिजली, आदि, और समय पैमाने पर इलेक्ट्रॉनिक और पृष्ठभूमि शोर बहुत तेजी से होता है के प्रति संवेदनशील नहीं है और केवल पहले 1-2 डिब्बे में देखा है.

इसी histograचित्र में कच्चे डेटा के एमएस. 4 पृष्ठ के तल पर दिखाए जाते हैं. हिस्टोग्राम नियंत्रण कक्षों के लिए एक व्यापक समय पर वितरण, के रूप में लाल रेखा (लाइन आँख मार्गदर्शन के लिए है और कोई मॉडल माना जाता है) द्वारा दर्शाया इसी डिब्बे की एक बड़ी संख्या में फैले हुए हैं. इसके विपरीत, जहां Gα बातचीत _क्ष - Cav3 पेप्टाइड द्वारा बाधित किया गया था कोशिकाओं की प्रतिक्रिया के लिए डिब्बे एक संकीर्ण बिन सुझाव है कि पेप्टाइड की उपस्थिति में लंबी अवधि के अपशिष्टों समाप्त वितरण तक ही सीमित हैं. एक नियंत्रण पेप्टाइड है _कि क्ष - Cav3 Gα को बाधित नहीं करता Microinjection एक संयुक्त ^{राष्ट्र} इंजेक्शन 8 कोशिकाओं के लिए इसी तरह की हिस्टोग्राम उत्पादन.

अंजीर में. 5 हम Ca ² के तेजी से तीव्रता उतार चढ़ाव ⁺ वयस्क कुत्ते निलय cardiomyocytes में ग्रीन (बाएं) और ताजा, unstimulated चूहे नवजात cardiomyocytes कि caveolae (दाएं) की कमी की तुलना . यहाँ, एक 3 मिनट की अवधि से अधिक तीव्रता के इसी histograms binned गया 35 पर धीमी कैल्शियम की घटनाओं को देखने के लिए. ध्यान दें कि नवजात cardiomyocytes एक फ्लैट आधारभूत ^धीमी 2 ^Ca + गतिविधि की कमी दिखा रहा है, जबकि एक अधिक संरचित आधारभूत वयस्क कोशिकाओं के लिए देखा है पर तेजी से उतार - चढ़ाव प्रदर्शन. इन मतभेदों को सबसे आसानी से histograms में देखा जाता है.

कुत्ते वयस्क निलय Gα _क्ष के वितरण दिखा cardiomyocytes की छवियाँ चित्रा 1 Alexa-488 जहां Alexa 488 488nm लेजर आर्गन आयन लाइन और छवि के साथ उत्साहित थी के साथ immunolabeled BP505-530nm उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर दर्ज की गई थी. ऊपर दाईं ओर एक ही छवि को देखने caveolin-3 का स्थानीयकरण Alexa-647 के साथ immunolabeled से 633 एनएम लाइन के साथ उत्साहित है वह फंट लेजर और LP650 एनएम उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर दर्ज. मर्ज किए गए छवि जहां colocalization नारंगी में देखा जाता है सही करने के लिए एक विस्तारित छवि के साथ छोड़ दिया तल पर है.

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चित्रा 2 एक जीवित कुत्ते वयस्क निलय cardiomyocyte कैल्शियम इमेजिंग ² Ca ⁺ ग्रीन के साथ भरी हुई है. छवि एक confocal स्कैनिंग लेजर खुर्दबीन प्रणाली पर एक 40x उद्देश्य के साथ 488nm आर्गन आयन लेजर और एक LP515 उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर लिया गया था. 1200 लाइनों की छवि बना है, पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय 2 μs था, और पिक्सेल आकार 0.1 सुक्ष्ममापी किया गया था.

चित्रा 3 एक जीवित कुत्ते वयस्क निलय ² Ca ⁺ ग्रीन के साथ भरी हुई है और imaged के रूप में वर्णित cardiomyocyte, और नीचे एक ही 5 सुक्ष्ममापी carbachol के अलावा द्वारा प्रेरित सेल से एक लाइन ट्रेस के शीर्ष तीव्रता उतार चढ़ाव .

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चित्रा 4 में रहने वाले कुत्ते वयस्क निलय ² Ca के साथ भरी हुई cardiomyocyte से टॉप लाइन निशान का एक उदाहरण ^है. + (लाल) ग्रीन 180 एमएस जहां 3 निशान के औसत एक काला लाइन के रूप में दिखाया गया है, और एक सेल है कि microinjected था की तुलना में अधिक लिया कि एक पेप्टाइड के साथ बाधित _Gα क्ष caveolin 3 (लाल) संघ जहां तीन निशान के एक औसत के काले रंग में है . हम ध्यान दें कि हम देखने के प्रयोजनों के लिए डेटा के निचले सेट से 400 तीव्रता मायने रखता है घटाया. कम पैनल binned डेटा पाठ में वर्णित के रूप में की इसी histograms हैं, और जहां बिन संख्या मनमाना है और बिन गिनती (या बस गिनती के लिए) है कि विशेष रूप से बिन में तीव्रता की कुल राशि से मेल खाती है है. हम ध्यान दें कि लाइन लाल और नीले रंग नियंत्रण (बाएं) और पेप्टाइड histograms (दाएं) में तैयार की लाइनों के लिए आसान पहचान और डेटा की तुलना के लिए अनुमति देते हैं और कोई मॉडल माना जाता है.

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5 चित्रा ² Ca की तीव्रता उतार चढ़ाव ⁺ वयस्क कुत्ते निलय cardiomyocytes में ग्रीन (बाएं) और ताजा, unstimulated चूहे नवजात cardiomyocytes कि caveolae (दाएं) और उनके इसी histograms कमी नीचे दिखाई जाती हैं.

Discussion

हम एक को देखने और रहने वाले cardiomyocytes में तेजी से कैल्शियम संकेतों को अलग विधि विकसित की है. जबकि इन मापों के प्रयोगात्मक शर्तों अन्य सेल ¹⁰ प्रणाली के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ¹¹ cardiomyocytes पहले लागू किया गया है है, histograms और बिन विश्लेषण का उपयोग डेटा से ^{कई Ca} 2 + घटनाओं को हासिल किया जा अनुमति देता है. तेज़ घटनाओं को आसानी से धीमी गति वाले और मॉडल अपनी अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए अनुकूलित से अलग किया जा सकता है. संवर्धन cardiomyocytes, कई प्राथमिक कोशिका लाइनों के रूप में मुश्किल हो सकता है. हालांकि यह आम तौर पर सोचा है कि जल्द ही माप लिया जाना चाहिए के बाद कोशिकाओं प्राप्त कर रहे हैं, हमने पाया है कि वयस्क कुत्ते cardiomyocytes हम इस अध्ययन में इस्तेमाल केवल 3 दिनों के बाद उनकी विशिष्ट गुण खो शुरू. यह लंबे समय सीमा कोशिकाओं को मजबूती से बीमा है कि कोशिकाओं microinjection जैसे संभावित घातक उपचार बच जाएगा सब्सट्रेट पर देते हैं अनुमति देता है. फर्म लगाव महत्वपूर्ण हैmicroinjection की सफलता के लिए.

हम एक पेप्टाइड है कि उनकी बातचीत बाधित microinjecting कैल्शियम अपशिष्टों में _Gα क्ष caveolin 3 संघ की भूमिका सत्यापित . हम तनाव है कि microinjection महान देखभाल के साथ किया जाना चाहिए करने के लिए सेल और सेलुलर सामग्री का रिसाव हानिकारक कम से कम करना चाहते हैं. हालांकि, इन जोखिमों बड़ा व्यास सुई है कि अपेक्षाकृत बड़े cardiomyocytes में सामग्री की एक पर्याप्त राशि देने की जरूरत है के उपयोग के द्वारा संतुलित किया जाना चाहिए. DAPI जैसे एक रंग है कि एक ट्रैक करने के लिए जो कोशिकाओं microinjection किया गया है की अनुमति देता है के शामिल किए जाने के महत्वपूर्ण है. के रूप में उल्लेख किया है, यह महत्वपूर्ण है कि microinjection myocytes के लिए कैल्शियम मुक्त माध्यम में और इंजेक्शन समाधान भी कैल्शियम की मुक्त स्नान कर रहे हैं. कोशिकी कैल्शियम की बाढ़ संकुचन और कोशिकाओं के बाद मृत्यु शुरू

माप खुद को अन्य कोशिका प्रकार, रंग और लेजर confocal के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैसिस्टम अन्य insoitol 1,4,5 trisphospate और शिविर अपशिष्टों के रूप में तेजी से सेल की घटनाओं का पालन करने के ^{लिए, हालांकि} Ca 2 + अपशिष्टों निश्चित रूप से कर रहे हैं एक सबसे जटिल सेलुलर दूत. एक फ्लोरोसेंट संकेतक है कि आसानी से और नहीं photobleached एक मजबूत और गतिशील प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया है ताकि कम लेजर शक्तियों का इस्तेमाल किया जा सकता है चुनने के बारे में सतर्क होना चाहिए. कम लेसर शक्ति भी स्थानीय हीटिंग जो अवांछित सेलुलर प्रभाव को जन्म दे सकता से बचना होगा.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234