心筋細胞における高速カルシウムフラックスの測定

Summary

我々は、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いた生細胞における遅いフラックスから（マイクロ秒）急激なカルシウムのイベントを分離する方法を提示する。方法は、細胞に数百画素のラインスキャンを記録することによって、カルシウムの指標の蛍光強度の変動を測定する。ヒストグラム解析により、異なるカルシウムフラックスの時間スケールを分離することができます。

Abstract

心筋細胞は、機能の^1,2を最適化するために協働する期間の異なる複数のCa ^{2 +}フラックスを持っている。のCa ²の変化は、細胞外の物質への応答で⁺活動は主にアセチルコリン^3,4のような薬剤によって刺激され、原形質膜に局在化ホスホリパーゼ_Cβ-Gαqの経路によって調節されている。我々は最近、カベオラ^5,6と呼ばれる細胞膜蛋白質のドメインが活性化_Gαqは ^7を捕捉できることを見出した。この巻き込みは_、Gαqの活性化状態を安定させ、心筋細胞や他の細胞型⁸の長期のCa ^{2 +}シグナルの結果の効果があります。我々は生きている心筋細胞内の高速規模で動的なカルシウム応答を測定することにより、この驚くべき結果が明らかに。簡単に言えば、細胞は蛍光灯のCa ^{2 +}インジケーターがロードされます。我々の研究では、我々は、Ca ^{2 +}グリーン（Invitrogen社、で用いカルシウムイオンの結合により蛍光発光強度の増加を示すC.）。蛍光強度は、共焦点顕微鏡を走査型レーザーのラインスキャンモードを使用するために記録されます。このメソッドは、マイクロ秒の時間スケールでの時間トレースの数百を生成する、選択されたラインに沿ってピクセルの蛍光強度の経時変化を迅速に取得することができます。これらの非常に高速のトレースは分析のためにExcelにしてから、SigmaPlotのに転送され、電子ノイズ、フリー染料、および他のコントロールのために取得したトレースと比較されます。 Ca ^{2 +は}別のフラックス速度の応答を分析するために、我々は時間とのピクセルの輝度をビンというのヒストグラム解析を行った。ビニングは、スキャンの500トレース以上のグループに私たちを可能にし、一つのプロット上に空間的かつ時間的にコンパイルされた結果を可視化する。従って、スキャンは、別のピーク位置やノイズによるオーバーレイされるときに識別が困難な、低速のCa ^{2 +波}は容易に見ることができます。ビニングヒストグラム。測定の時間スケールで非常に高速なフラックスが長いのに対し、非常に短い時間ビンの強度の狭い分布を示すのCa ^{2 +}波はより長い時間ビン以上の広い分布を持つビンのデータを示しています。これらの異なる時間の分布は、私達は、Ca ²のタイミング⁺細胞のフラックスを分析する、そして様々な細胞現象に与える影響を判断することができます。

Protocol

1。カルシウムインジケータ付きのロードセル

1. 35ミリメートルのガラスボトムマテック皿のプレートの細胞（またはチャンバーを表示し、他のガラスの底）。
2. 10μg/mlラミニンと前室1泊目の主要な心筋細胞のコートを使用している場合。 KBのバッファ内のプレート心筋細胞（成犬、新生児ラット、または他の生物から単離された）（K -逆転のタイロード緩衝液HEPESの35ミリモル/ L、KClの140ミリモル/ L、KHCO ₃の8ミリモル/ L、2ミリモル/ MgCl ₂のL、および0.4 KH ₂ PO _4、pH7.5のミリモル/ L）、37、15％ウシ胎児血清および1％streptamycinおよび0.5％ゲンタマイシンとインキュベートを添加したM199培地に徐々にそれを変える℃、5％のC CO _2。
3. または室温で30-45分のための任意のカルシウム指示薬、カルシウム緑AM（Molecular Probes社1から5μM）で細胞をインキュベートします。色素の退色を避けるためにアルミ箔で皿に蓋をする。
4. 14mmのEGTAとLeibovitz15培地で細胞を3回洗浄する（低カルシウムで実験を行う場合）または任意の適切な表示媒体。
5. Leibovitz15培地containing14mM EGTAで別の30〜45分インキュベートする。
6. 阻害剤の効果をテストする場合（すなわち10μMU73122 PLC阻害剤）2回目のインキュベーションの間にそれらを追加します。

2。マイクロインジェクション、細胞

1. 24用ガラスボトムマテックの皿（または他の表示チャンバー）の培養心筋細胞。
2. 14mmのEGTA（カルシウムを含まない培地に注入する必要が心筋細胞、他の細胞を含む培地中カルシウムに注入することができる）とフェノールフリーリーボビッツ- 15培養液を交換する。
3. マイクロインジェクションの溶液を準備-私たちの研究は_、Gαqを排除ペプチドを使用する-カベオラの相互作用。ボリュームの唯一の少量の細胞（〜フロリダ州）に注入されるので、合理的に集中して株式を使用する必要があることに留意してください。我々は、カルシウムを含まない培地にDAPIでこのペプチドの、2μM、Cav3 -足場を、使用。 DAPIはブルーレイです。電子染料その染色核とマイクロインジェクションされた細胞の同定が可能になります。 DAPIは、多くのカルシウム指標の蛍光を妨げることはありません。 DAPIの量は可変であり、我々は一般的に（0.5〜2μM）核を可視化するのに十分な使用
4. 単独で色素トレーサー - DAPIを含むコントロール溶液を用意する。
5. microinjectionsための自己引っ張られたり、市販の針を使用してください。適切な針のパラメータを決定するために色素注入で練習。我々は、異なる細胞が異なる針径とマイクロインジェクションの圧力を必要とするかもしれないことに注意してください。
6. InjectMan NI2は、エッペンドルフからFemtoJetポンプで、例えば、自動マイクロインジェクションシステムを使用してください。 _私は 90ヘクトパスカル、および補償圧力P _Cから45 hPaのために射出圧力Pを設定します。 0.7噴射時間tを設定する秒必要性として注入のパラメータを再調整してください。
7. 倒立顕微鏡（例えばツァイスAxioveにmicroinjectionsを実行するRT 200M）は、長作動距離の位相コントラストの目的（例空気40倍フェーズ2の目的のための）を装備。
8. 迅速な方法でできるだけ多くの細胞として注入する。生存細胞を選択するには、位相コントラストを用いて注入された細胞を調べます。

3。共同免疫蛍光研究

1. PBSで2回細胞を洗浄し、30分間3.7％パラホルムアルデヒドで固定してください。必要に応じて、細胞が固定する前に刺激することができる。
2. PBSで固定された細胞を3回洗浄し、5分間のためにPBSに0.2％NP40でインキュベートする。
3. 1時間のためにPBSを含む4％ヤギ血清（または他の適切な血清）を使用してブロックする。
4. 1時間PBS中の1％ヤギ血清で適切な希釈率で一次抗体で細胞をインキュベートします。
5. このようなアレクサ - フルオロ- 488抗ウサギまたはAlexa - フルオロ- 647希釈した抗マウス二次抗体として蛍光標識二次抗体を加え、続いて150mMのNaCl、25mMのトリス、pH 7.6で10分間細胞を3回洗浄1〜：PBSで1000 1％ヤギ​​血清（二つの異なるタンパク質をプローブするときに一次抗体は異なる種で提起されている必要がありますし、二次は対応する種に対してでなければならないことに注意）。
6. 37℃で1時間のために、TBSで3回洗浄。
7. TBSバッファーまたは別の適切な表示培地で細胞を見る。

4。高速のカルシウムイメージング

1. レーザー走査型共焦点顕微鏡を（例Fluoview 1000年オリンパス用）を使用してください。
2. 高開口数対物レンズを使用してください。
3. 買収のパラメータを設定します。カルシウム緑の使用488nmの励起のために、長い515発光フィルターを通過する。
4. ピクセル時間を調整 - 高速カルシウムの測定には2μs/ピクセルに設定します。
5. 0.3μmの - 0.05のピクセルサイズを達成するために画像のズームを設定します。
6. 特定の地域における選択肢のセルから行を選択します。
7. 時間のコントローラ]ウィンドウで時間枠のを希望さに少なくとも1500のスキャン（時間の取得を選択します。レスポンス - 1.3ミリ秒/ライン2秒をもたらすでしょう）。
8. レコードの背景には、刺激前に読んで。
9. 5μMのカルバコールで細胞を刺激し、すぐに録画データを起動します。 Leibovitz15に10μMのカルバコールを準備し、皿に軽く1 mLを加える、Leibovitz15培地1mLに細胞を保持する

5。データ分析

1. 記録された画像から各ピクセルの強度を抽出する。 Fluoview 1000年のソフトウェアを使用してテーブルとして強度のデータを保存します。
2. SigmaPlotのまたは類似のデータ解析プログラムとビンにインポートする強度のデータ〜90から40ビンへのデータ。実験と電子ノイズを制御するために比較する。

6。代表的な結果：

我々は、マルチラインのレーザー励起と40x/1.2 NAアポクロマートの水浸対物レンズを搭載したレーザー走査型共焦点顕微鏡LSM510のセル（ツァイス、イエナ、ドイツ）を撮像。図。我々はdistributioを表示する1（ 赤 ）これらの細胞⁹の主要な構造カベオラ蛋白質であるカベオリン-3に対する抗体を固定し、染色された犬の成人の心室の心筋細胞におけるカベオラのn。カベオリン-3はAlexa - 647とimmunolabelledと彼からの633 - nmの線で励起された：Neレーザー。画像はLP650 nm発光フィルターを用いて記録した。カベオリン-3の分布はAlexa - 488（ 緑 ）で免疫標識した_Gαqを比較した。アレクサ- 488は、488nmのアルゴンイオンレーザーの線で励起され、画像はBP505 - 530nmの発光フィルターを使用して記録した。これらの共局在の測定では、2つの蛍光体は、マルチトラックの取得を使用して連続的に興奮していた。この手順は、チャネルクロストークを最小限に抑えることができます。共局在のためのデータ解析は、ツァイスLSM510 -メタに付属のAIMソフトウェアを使用して行った。見ることができるように、2つのタンパク質が局在している。

判断する方法カベオリン-3とGαとの間のカップリング2 +グリーンを充填した。我々は488nmのアルゴンイオンレーザーで色素を励起し、LP515エミッションフィルタを介して画像を収集した。画像のフレームは500ミリ秒間隔で収集した。各ピクセルの強度値は、オリンパスソフトウェアとImageJを用いて抽出した。ラインスキャンモードは、より高速のCa ^{2 +}過渡電流とCa ^{2 +}スパークの定量的な分析のために使用された。本研究で使用されるピクセルサイズは0.1〜0.3μmであった。ラインスキャンレートは、行ごとにマイクロ秒の数百程度であった。図。 2我々は、Ca ²のラインスキャン⁺グリーンロードされた心筋細胞ピクセルdを示すうまく時間が2μsで、ライン時間は142μsで。画像は1200行で構成されています。

スキャンの各行は、Ca ²の強度の変動に対応する⁺グリーンは、142μsの範囲で撮影した71点で構成される、とカルシウム応答の読み出し急速として使用することができます。例えば、図中3私たちは強化5μMのカルバコールの追加（ 一番下 ）の前（ 上 ）と後などのCa ²によって測定された個々の心筋細胞の単一行^、+秒単位の時間の関数としてのグリーン蛍光強度のCa ^{2 +}活性を示す_Gαqを -PLCβ活動を通じて、細胞内Ca ^{2 +}のレベル。多くの行が平均化されると、カルバコール刺激はCa ²の約​​1.8倍に増加⁺緑の強度を生成します。実験条件の変化（室温、レーザパワー、検出器応答、色素分布、等）のために、この増加は、個々に表示されないことがありますラインスキャン。強度値（y軸の値）が類似しているにもかかわらず、それは底でカルバコール刺激によるプロットが刺激前に見た狭い変動のピークよりも、より持続的なカルシウムのレベルに対応するはるかに広いピークを、持っていることは明らかである。強度のこの拡大と相対的上昇は小さく、遅い振動をあいまいにしています。私たちの目標は、よりよいカルシウムの変動のこれらの異なる見かけの種類を区別することです。

これらの高速なカルシウム変動の別の例を図に示します。 4。上のグラフは、刺激された心室の心筋細胞（赤）と3ライントレースの平均値が黒で表示されているために生のラインのデータを示しています。これらのカルシウムの変動が_Gαqによって媒介されている範囲を決定するために- caveoline3相互作用を、我々は、カベオリン-3を不安定化ペプチドマイクロインジェクション-長いのCa ^2を除去^する _Gαqの相互作用（すなわちCav3ペプチド^）+現在、これらのデータを青色で表示されます（我々は二つのトレースがより識別できるようにCav3ペプチドの強度から500を減算することに注意してください）​​。

私たちは、ExcelファイルSigmaPlotのに（Jandel社）から生データの列をインポートおよびヒストグラム解析を行った。この分析では、イベントの数は、ヒストグラムを生成するボックスの数と同じ数（ビン）に分類されます。ビンの幅は、時間の等しい間隔を表します。強度が異なる時に挿入されている特定のビンの高さは、強度が特定の時間枠で発生する回数を表すように結合する。分析のこのタイプは、同じ走査速度でデータを収集するに依存するため、多くのトレースを同時に分析することができます。さらに、この分析では、レーザパワー、等染料レベルの違いに敏感ではなく、電子とバックグラウンドノイズは非常に速い時間スケールで発生し、最初の1〜2ビンで見られている。

対応するhistogra図の生データのミリ秒。 4ページの一番下に表示されます。コントロール細胞のヒストグラムは、赤線で示されている広範な時間の分布に対応するビンの数が多い、（ラインが目を導くとは、モデルが仮定されていないためです）に分散しています。対照的に_、Gαqを - Cav3の相互作用がペプチドによって破壊された細胞の応答のためのビンは、ペプチドの存在は長い期間のフラックスを除去することを示唆狭いビンのディストリビューションに限定されています。 _Gαqを - Cav3を妨害していない対照ペプチドのマイクロインジェクションは、非注入された細胞⁸と同様のヒストグラムを生成します。

図。私たちは大人犬の心室心筋細胞（ 左 ）とカベオラを（ 右 ）がない、新鮮な、刺激されていないラット新生児心筋細胞でのCa ²の速い強度変動⁺グリーンを比較する5。ここで、3分間にわたって強度の対応するヒストグラムは、選別された 35で遅いカルシウムのイベントを表示する。新生児の心筋細胞はより構造化されたベースラインが大人の細胞に見られるている間に遅いのCa ^{2 +}活性の欠如を示す平坦なベースラインでの高速な変動を表示することに注意してください。これらの違いは、最も簡単にヒストグラムで見られている。

図_1。Gαqの分布を示す犬の成人の心室心筋細胞の画像はAlexa - 488は488nmのアルゴンイオンレーザーの線で励起され、画像がBP505 - 530nmの発光フィルターを用いて記録した。アレクサ- 488で免疫標識NeレーザーとLP650 nmの放射フィルターを使用して、記録：右上のカベオリン-3彼からの633 - nmの線で励起する、アレクサ- 647で免疫標識の局在を見ると同じイメージです。共局在がオレンジ色に見られているマージされた画像は、右に展開したイメージを左下にあります。

"pdflinebreak">

図2：生活犬成人の心室心筋細胞のカルシウムイメージングは、Ca ^{2 +}グリーンでロード。画像は、488nmのアルゴンイオンレーザーとLP515発光フィルターを使用して40倍を目的とした走査型共焦点レーザ顕微鏡システムで撮影されました。画像は1200行で構成され、ピクセルの滞留時間は2μsで、ピクセルサイズは0.1μmであった。

図3。生きた犬成人の心室のCa ^{2 +}グリーンでロードされ、前述のように撮像心筋細胞、および下位5μMのカルバコールを添加することによって刺激された同細胞からのライントレースのTOP強度変動。

/ 3505fig4.jpg"/>
図4のCa ²でロードの生活犬の成人の心室の心筋細胞からライントレースの例TOP 3トレースの平均値が黒い線で示され、そしてマイクロインジェクションした細胞と比較して180ミリ秒を引き継いだ⁺緑（赤）ペプチドとその3つのトレースの平均が黒になっている_GαQ -カベオリン3のアソシエーション（赤）を破壊する。我々は、表示目的のためにデータの下位集合から400強の数を減算することに注意してください。下のパネルは、テキストで説明されているようにビンのデータの対応するヒストグラムであり、ビンの数は任意であり、ビンの数は（または単にカウント）その特定ビンの強度の合計額に相当する場所。我々は、コントロール（左）とペプチド（右）のヒストグラムで描画線の赤と青の線はデータを簡単に識別できるとの比較を可能にするものとしないモデルが仮定されていないことに注意してください。

files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg"/>
カベオラ（ 右 ）とそれに対応するヒストグラムを欠いている図5。強度のCa ²の変動⁺大人犬の心室の心筋細胞におけるグリーン（ 左 ）と新鮮な、刺激ラット新生児心筋細胞を以下に示します。

Discussion

我々は生きている心筋細胞の急激なカルシウムシグナルを表示して分離する手法を開発した。これらの測定の実験条件は、以前に他のセルのシステム¹⁰と同様に心筋細胞¹¹に印加されているが、ヒストグラムとビンの分析の使用は、多くのCa ^{2 +}のイベントが取得されるデータを可能にします。より高速なイベントは、容易にそれらの根拠となるメカニズムを理解するために適応遅いものとモデルから分離することができます。培養心筋細胞は、多くの主要な細胞株として、困難になる可能性があります。それは一般的に細胞が取得された後の測定がすぐに取られるべきであると考えられている一方で、我々は本研究で使用した大人の犬の心筋細胞はわずか3日後に彼らの固有の性質を失い始めることを発見した。この長い時間枠では細胞がしっかりと細胞はそのようなマイクロインジェクションのような潜在的に致命的な治療法を存続することを保証基板上に添付することができます。会社の添付ファイルは非常に重要ですマイクロインジェクションの成功のために。

我々は彼らの相互作用を妨害するペプチドをマイクロインジェクションすることによりカルシウムフラックスの_GαQ -カベオリン3のアソシエーションの役割を検証する。我々は、マイクロインジェクションは細胞と細胞内容物の漏れを損傷最小限に抑えるために細心の注意を払って行わなければならないことを強調したいと思います。しかし、これらのリスクは比較的大きな心筋細胞に物質の適切な量を送達するために必要とされる大径の針の使用によって調整する必要があります。一つのセルにマイクロインジェクションされているかを追跡できるようにするなどDAPIなどの色素を含めることが重要です。前述のとおり、それはマイクロインジェクションの心筋細胞のカルシウムを含まない培地中で、注入されたソリューションはまた、カルシウムがないことを浴びていることが重要です。細胞外カルシウムの流入は、収縮と細胞のその後の死を開始

測定は、自体は他の細胞型、染料および共焦点レーザーに適応することができますinsoitol 1,4,5 trisphospateとcAMPのフラックスなどの他の急速な細胞イベントを追跡するシステム、ものののCa ^{2 +}フラックスは確かに1つ、最も複雑な細胞のメッセンジャーです。一つは、低レーザパワーが使用できるように簡単にphotobleachedと堅牢性とダイナミックな蛍光応答を持っていない蛍光指示薬の選択には注意を払う必要があります。低レーザパワーは、また、不要な細胞効果を生じさせる可能性が局部加熱を避けることができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234