Måling Rask Kalsium flukser i cardiomyocytes

Summary

Vi presenterer en metode for å isolere rask (mikrosekund) kalsium hendelser fra tregere flukser i levende celler ved hjelp av laser scanning konfokalmikroskopi. Metoden måler fluorescensintensitet svingninger av kalsium indikatorer ved registrering linje skanninger av flere hundre piksler i en celle. Histogram analyse tillater oss å isolere tidsskalaer på forskjellige kalsium flukser.

Abstract

Cardiomyocytes har flere Ca ^{2 +} flukser av varierende varighet som samarbeider for å optimalisere funksjon ^1,2. Endringer i Ca ^{2 +} aktivitet i respons til ekstracellulær agenter er hovedsakelig regulert av fosfolipase Cβ-Gα _q pathway lokalisert på plasmamembranen som stimuleres av midler som acetylkolin ^3,4. Vi har nylig funnet ut at plasma membran protein domener som kalles caveolae ^5,6 kan lure aktivert Gα _q ^7. Dette entrapment har effekten av å stabilisere aktivert tilstand av Gα _q og resulterer i forlenget Ca ^{2 +} signaler i cardiomyocytes og andre celletyper ^8. Vi avdekket dette overraskende resultatet ved å måle dynamisk kalsium svar på en rask skala i levende cardiomyocytes. Kort fortalt er celler lastet med en fluorescerende Ca ^{2 +} indikator. I våre studier, brukte vi Ca ^{2 +} Green (Invitrogen, Inc.) som viser en økning i fluorescens utslippsintensiteten ved binding av kalsiumioner. Fluorescens intensiteten er da registrert for å bruke en line-scan mode av en laser scanning confocal mikroskop. Denne metoden tillater rask anskaffelse av tiden løpet av fluorescens intensiteten i piksler langs en valgt linje, produsere flere hundre tid spor på mikrosekund tidsskalaen. Disse svært raske spor blir overført til Excel og deretter inn Sigmaplot for analyse, og blir sammenlignet med spor innhentet for elektronisk støy, gratis fargestoff, og andre kontroller. Å dissekere Ca ^{2 +} respons av forskjellige flux priser, utførte vi en histogram analyse som binned pixel intensiteter med tiden. Binning tillater oss å gruppere over 500 spor av skanner og visualisere den kompilerte resultater romlig og tidsmessig på en enkelt tomt. Dermed kan den langsomme Ca ^{2 +} bølger som er vanskelig å skjelne når skanninger kledde på grunn av forskjellige topp plassering og støy, kan lett sees iden binned histogrammer. Veldig rask flukser i tiden omfanget av målingen viser en smal distribusjon av intensiteter i svært kort tid binger mens lenger Ca ^{2 +} bølger show binned data med en bred distribusjon over lengre tid skuffer. Disse ulike tidspunkt distribusjonene tillate oss å dissekere timingen av Ca ^{2 +} flukser i cellene, og bestemme deres innvirkning på ulike cellulære begivenheter.

Protocol

1. Laster celler med kalsium indikatorer

1. Plate celler i 35mm glassbunn Mattek retter (eller andre glassbunn visning kamre).
2. Hvis du bruker primære myocytes pels kamrene 1 dag før med 10μg/ml laminin. Plate hjertemuskelceller (isolert fra voksne hunder, neonatal rotter eller annen organisme) i KB buffer (K-reversering Tyrode buffer 35 mmol / L av HEPES, 140 mmol / L av KCl, 8 mmol / L av ₃ KHCO, 2 mmol / L av MgCl _2, og 0,4 mmol / L av KH _{2 4} PO, pH 7,5) og endre den gradvis til M199 medium supplert med 15% føtal bovint serum og 1% streptamycin og 0,5% gentamicin og inkuber ved 37 ° C i 5% CO _2.
3. Inkuber cellene med kalsium grønn AM (1-5 mM, molekylære prober) eller noen ønsket kalsium indikator i 30-45 minutter ved romtemperatur. Dekk formen med aluminiumsfolie for å unngå fotobleking av fargestoff.
4. Vask cellene tre ganger med Leibovitz15 medium med 14mm EGTA (Hvis du utfører eksperimenter på lav kalsium) eller noen passende visning media.
5. Inkuber i en annen 30-45 minutter i Leibovitz15 medium containing14mM EGTA.
6. Dersom testing effekten av hemmere (dvs. 10μM U73122 PLC-hemmer) legge dem under andre inkubasjon.

2. Microinjecting celler

1. Kultur cardiomyocytes i glassbunn Mattek retter (eller andre visning kamre) for 24 timer.
2. Endre medium til fenol-free Leibovitz-15 med 14 mM EGTA (cardiomyocytes må injiseres i kalsium fritt medium, kan andre celler injiseres i medium som inneholder kalsium).
3. Forbered mikroinjeksjon løsning - våre studier brukt et peptid som eliminerer Gα _q - caveolae interaksjoner. Husk at bare en liten mengde volumet er injisert inn i cellen (~ FL) og så rimelig konsentrerte bestander må brukes. Vi brukte 2 mM av denne peptid, Cav3-stillaset, med DAPI i kalsium-free medium. DAPI er en blue fargestoff som flekker kjernen og tillater identifisering av celler som har blitt microinjected. DAPI ikke forstyrrer fluorescens av mange kalsium indikatorer. Mengden av DAPI er variabel og vi vanligvis bruker nok til å visualisere nucleus (0,5 og 2 mm)
4. Forbered kontroll løsning som inneholder DAPI - fargestoff tracer alene.
5. For microinjections bruke self-trukket eller kommersielt tilgjengelig nåler. Øv med fargestoff injeksjon for å bestemme riktig nål parametere. Vi merker oss at ulike celler kan kreve ulik nål diametre og mikroinjeksjon press.
6. Bruk automatisert mikroinjeksjon system, for eksempel en InjectMan NI2 med FemtoJet pumpe fra Eppendorf. Sett injeksjon trykket P _jeg til 90 hPa, og erstatningen trykket P _c til 45 hPa. Sett injeksjon tiden t til 0,7 s. Juster parametrene for injeksjon som trenger.
7. Utfør microinjections på et invertert mikroskop (f.eks Zeiss Axiovert 200M) utstyrt med lang arbeidsavstand fasekontrast mål (for eksempel luft 40x fase 2 mål).
8. Injisere så mange celler som mulig på en rask måte. Undersøk injiseres celler ved hjelp av fasekontrast å velge levedyktige celler.

3. Co-immunfluorescens studier

1. Vask cellene to ganger med PBS og fikse med 3,7% Paraformaldehyde i 30 minutter. Om nødvendig, kan cellene stimuleres før fiksering.
2. Vask faste celler tre ganger med PBS, og inkuber med 0,2% NP40 i PBS for 5minutes.
3. Blokker med PBS som inneholder 4% geit serum (eller andre passende serum) for 1 time.
4. Inkuber cellene med primær antistoff på passende fortynning med 1% geit serum i PBS for 1hour.
5. Vask cellene tre ganger i 10 minutter med 150 mM NaCl, 25 mM Tris, 7,6 pH etterfulgt av tilsetning av fluorescerende-merket sekundære antistoff, slik som Alexa-Fluor-488 anti-kanin eller Alexa-Fluor-647 anti-mus sekundært antistoff fortynnes til 1: 1000 1% geit serum i PBS (merk at når undersøkelser for to ulike proteiner den primære antistoffer må heves i forskjellige arter og den sekundære skal være mot tilsvarende arter).
6. Inkuber ved 37 ° C i 1 time, vask tre ganger med TBS.
7. Se celler i TBS buffer eller en annen passende visning medium.

Fire. Raske kalsium bildebehandling

1. Bruk laserskanning confocal mikroskop (for eksempel Fluoview 1000 Olympus).
2. Bruk høy numerisk apertur mål.
3. Still oppkjøpet parametere. For kalsium grønne bruk 488 nm eksitasjon og langpasning 515 utslipp filtre.
4. Juster pixel tid - for rask kalsium målinger sette den til 2 μs / pixel.
5. Sett bildet zoom for å oppnå pixel størrelsen på 0,05 til 0,3 mikrometer.
6. Velg en linje fra en celle av valget i en bestemt region.
7. I tiden controller vinduet velger tid oppkjøp for minst 1500 skanner (for å få ønsket tidsramme påresponsen - 1,3 ms / linje vil gi 2 sekunder).
8. Record bakgrunn lesing før stimulering.
9. Stimulere cellene med 5 mM carbachol og umiddelbart starte å registrere data. Hold celler i 1 mL Leibovitz15 medium, forberede 10 mm carbachol i Leibovitz15 og legg forsiktig 1 mL i formen

5. Dataanalyse

1. Pakk ut intensiteter for hver piksel fra bildet. Lagre intensiteten dataene som en tabell med Fluoview 1000 programvare.
2. Import intensitet data til Sigmaplot eller et lignende dataanalyse programmet og bin dataene inn i ~ 90-40 binger. Sammenlign med kontroll eksperimenter og elektronisk støy.

Seks. Representant Resultater:

Vi avbildes celler på laserskanning confocal mikroskop LSM510 (Zeiss, Jena, Tyskland) er utstyrt med multi-line laser eksitasjon og en 40x/1.2 NA apochromat nedsenking i vann mål. I fig. 1 (rød) viser vi distribution av caveolae i hjørnetann voksen ventrikkel cardiomyocytes som har blitt faste og farget med et antistoff til caveolin-3 som er den største strukturelle caveolar protein i disse cellene ^9. Caveolin-3 var immunolabelled med Alexa-647 og begeistret med 633 nm-linje fra en han: Ne laser. Bilder ble registrert med LP650 nm utslipp filter. Fordelingen av caveolin-3 ble sammenlignet med Gα _q som ble immunolabeled med Alexa-488 (grønn). Alexa-488 var spent med 488nm Argon-ion laserlinje og bildet ble tatt opp med BP505-530nm utslipp filter. I disse colocalization målingene ble de to fluorophores glade i en sekvensiell måte ved hjelp av Multi Track oppkjøpet. Denne prosedyren minimerer kanalen krysstale. Dataanalyse for colocalization ble utført ved hjelp av AIM programvaren som fulgte med Zeiss LSM510-Meta. Som man kan se, er de to proteinene colocalized.

Å bestemme hvordan koplingen mellom caveolin-3 og Gα 2 + Green. Vi gleder fargestoff med en 488nm Argon ion laser og samlet bilder gjennom en LP515 utslipp filter. Bilde rammer ble samlet på 500 ms intervaller. Intensity verdier for hver piksel ble ekstrahert med Olympus programvare og ImageJ. Linjen skannemodus ble brukt for kvantitativ analyse av raskere Ca ^{2 +} transienter og Ca ^{2 +} gnister. Den pixel størrelsen som brukes i denne studien var 0,1 til 0,3 mikrometer. Linjen-scan sats var om flere hundre av μs per linje. I fig. 2 viser vi en linje skanning av en Ca ^{2 +} Green-loaded cardiomyocyte hvor pixel dvel tiden var 2 μs, var linjen tiden 142 μs. Bildet er sammensatt på 1200 linjer.

Hver linje på skanningen tilsvarer intensiteten svingninger av Ca ^{2 +} Grønn bestående av 71 poeng tatt over en 142 μs rekkevidde, og kan brukes som en rask lese-out for kalsium svar. For eksempel i fig. 3 viser vi Ca ^{2 +} aktiviteten til en enkelt linje av en individuell cardiomyocyte, målt ved Ca ^{2 +} grønn fluorescens intensiteten som en funksjon av tiden i sekunder før (øverst) og etter (nederst) tillegg av 5 mikrometer carbachol som forbedrer nivået av intracellulære Ca ^{2 +} gjennom Gα _q-PLCβ aktivitet. Når mange linjer er gjennomsnitt, produserer carbachol stimulering en ~ 1,8 ganger økning i Ca ^{2 +} grønn intensitet. På grunn av variasjoner i eksperimentelle forhold (romtemperatur, laser makt, detektor respons, fargestoff distribusjoner, etc), kan denne økningen ikke sees i individuellelinje skanninger. Selv om intensiteten verdiene (y-aksen verdier) er like, er det klart at carbachol-stimulerte tomt på bunnen har mye bredere topper, tilsvarende mer varig kalsium nivåer, enn den smale svingninger toppene sett før stimulering. Denne bredere og relativ økning i intensitet skygger små, langsommere svingninger. Vårt mål er å bedre skille mellom disse ulike tilsynelatende typer kalsium svingninger.

Et annet eksempel på disse raske kalsium svingninger er vist i fig. Fire. Den øverste grafen viser rå linje data for stimulert ventrikkel cardiomyocytes (rød) og et gjennomsnitt på 3 linje spor vises i sort. For å bestemme utstrekning disse kalsium svingninger ble mediert av Gα _q - caveoline3 interaksjoner, microinjected vi et peptid som destabiliserer caveolin-3 - Gα _q interaksjoner (dvs. Cav3 peptid) som eliminerer lenger Ca ^{2 +} strøm og disse dataene er vist i blått(Vi oppmerksom på at vi trekkes 500 fra Cav3 peptid intensiteter slik at de to sporene kan bli bedre discerned).

Vi importert kolonner av rådata fra våre Excel-filer i Sigmaplot (Jandel, Inc.) og foretok en histogram analyse. I denne analysen er antall hendelser gruppert i et likt antall bokser (beholdere) til å produsere et histogram. Bredden på bin representerer en like tidsintervall. Intensiteter er satt inn i annen binder slik at høyden av en bestemt bin representerer antall ganger intensitet forekommer i den aktuelle tidsvinduet. Siden denne typen analyse bare avhengig av å samle inn data på samme scan rate, kan mange spor analyseres samtidig. I tillegg er denne analysen ikke er sensitive til forskjeller i dye nivåer, laser makt osv., og elektroniske og bakgrunnsstøy skjer på tidsskalaer veldig fort og er kun sett i de første 1-2 skuffer.

Tilsvarende histograms av rådata i fig. 4 er vist på bunnen av siden. Histogrammet for kontroll celler er spredt over et stort antall beholdere som tilsvarer en bred tid distribusjon, som vist ved den røde linjen (linjen er for guiding øyet og ingen modellen er antatt). I kontrast er det binger for responsen av celler der Gα _q-Cav3 interaksjon ble forstyrret av peptid begrenset til en smal bin fordeling tyder på at tilstedeværelsen av peptid eliminerer lengre varighet flukser. Mikroinjeksjon av en kontroll peptid som ikke forstyrrer ikke Gα _q-Cav3 produserer et histogram tilsvarende un-injiserte celler ^8.

I fig. 5 vi sammenligner den raske intensiteten svingninger av Ca ^{2 +} Green i voksen canine ventrikkel cardiomyocytes (til venstre) og frisk, unstimulated rotte neonatal cardiomyocytes som mangler caveolae (høyre). Her var de tilsvarende histogrammer av de intensiteter over en 3-minutters periode binned ved 35 for å vise tregere kalsium hendelser. Merk at neonatal cardiomyocytes vise rask svingninger på et flatt baseline viser mangel på tregere Ca ^{2 +} aktivitet mens en mer strukturert baseline blir sett for den voksne celler. Disse forskjellene er klarest frem i histogrammene.

Figur 1. Bilder av hjørnetann voksen ventrikkel cardiomyocytes viser fordelingen av Gα _q immunolabeled med Alexa-488 hvor Alexa-488 var spent med 488nm Argon-ion laserlinje og bildet ble tatt opp med BP505-530nm utslipp filter. Øverst til høyre er det samme bildet ser på lokaliseringen av caveolin-3 immunolabeled med Alexa-647, spent med 633 nm-linje fra en han: Ne laser og spilt inn LP650 nm utslipp filter. Det sammenslåtte bildet der colocalization er sett i oransje er på bunnen igjen med et utvidet bilde til høyre.

"Pdflinebreak">

Figur 2. Kalsium avbildning av en levende hund voksen ventrikkel cardiomyocyte lastet med Ca ^{2 +} Green. Bildet ble tatt på en confocal scanning laser mikroskop system med et 40x objektiv med en 488nm Argon ion laser og en LP515 utslipp filter. Bildet er sammensatt på 1200 linjer, pikselen dvele tiden var 2 μs, og pixel størrelsen var 0,1 mikrometer.

Figur 3. TOP Intensity svingninger på en linje spor fra en levende hund voksen ventrikkel cardiomyocyte lastet med Ca ^{2 +} Green og avbildes som beskrevet, og nederst på samme celle stimuleres ved tilsetning av 5 mikrometer carbachol.

/ 3505fig4.jpg "/>
Figur 4. TOP Et eksempel på linje spor fra en levende hund voksen ventrikkel cardiomyocyte lastet med Ca ^{2 +} Green (rød) tatt over 180 ms, der gjennomsnittet av 3 spor vises som en svart linje, og sammenlignes med en celle som var microinjected med et peptid som forstyrrer Gα _q-caveolin 3 forening (rød), der et gjennomsnitt på tre spor er i svart. Vi merker at vi trekkes 400 intensitet teller fra nedre sett med data for visning formål. Jo lavere paneler er de tilsvarende histogrammer av de binned data som beskrevet i teksten, og hvor bin tallet er vilkårlig og bin telle (eller bare teller) tilsvarer den totale mengden av intensitet i det aktuelle bin. Vi merker oss at linjen røde og blå linjer i kontrollen (venstre) og peptid (høyre) histogrammer er å tillate enklere identifisering og sammenligninger av dataene og ingen modellen er antatt.

files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg "/>
Figur 5. Intensity svingninger av Ca ^{2 +} Green i voksen canine ventrikkel cardiomyocytes (til venstre) og frisk, unstimulated rotte neonatal cardiomyocytes som mangler caveolae (til høyre) og deres tilsvarende histogrammer er vist nedenfor.

Discussion

Vi har utviklet en metode for å vise og isolere rask kalsium signaler i levende cardiomyocytes. Mens eksperimentelle betingelsene i disse målingene har tidligere vært brukt til andre celler systemer ¹⁰ samt cardiomyocytes ^11, tillater bruk av histogrammer og bin analyse av data fra mange Ca ^{2 +} arrangement skal anskaffes. Raskere hendelser kan være lett isolert fra tregere seg og modeller tilpasset for å forstå deres underliggende mekanismer. Dyrking cardiomyocytes, så mange primære cellelinjer, kan være vanskelig. Mens det er allment antatt at målinger bør tas kort tid etter at cellene er ervervet, har vi funnet ut at voksne canine cardiomyocytes vi brukte i denne studien bare begynner å miste sine spesifikke egenskaper etter 3 dager. Dette lengre tidsramme gjør at cellene til fast feste på underlaget forsikre at cellene skal overleve potensielt dødelig behandlinger som mikroinjeksjon. Firm vedlegg er kritiskfor å lykkes med mikroinjeksjon.

Vi bekreftet rollen Gα _q-caveolin 3 forening i kalsium flukser av microinjecting et peptid som forstyrrer deres interaksjon. Vi ønsker å understreke at mikroinjeksjon må gjøres med stor forsiktighet for å minimere skade cellen og lekkasje av cellulære innholdet. Imidlertid må disse risikoene være balansert ved bruk av større diameter nåler som er nødvendig for å levere en tilstrekkelig mengde materiale i den relativt store cardiomyocytes. Inkludering av et fargestoff som DAPI som gjør det mulig å spore hvilke celler har vært mikroinjeksjon er viktig. Som nevnt, er det viktig at for mikroinjeksjon myocytes er badet i kalsium fritt medium, og at løsningene injisert er også fri for kalsium. Tilstrømningen av ekstracellulært kalsium initierer sammentrekninger og påfølgende død av celler

Målingene selv kan tilpasses til andre celletyper, fargestoffer og confocal lasersystemer for å følge andre raske celle arrangementer som insoitol 1,4,5 trisphospate og cAMP flukser, men Ca ^{2 +} flukser er absolutt en av de mest komplekse cellulære budbringere. Man bør være forsiktig med å velge fluorescerende indikatorer som ikke er lett photobleached og har en robust og dynamisk fluorescens respons slik at lav laser krefter kan brukes. Lav laser makt vil også unngå lokal oppvarming som kan gi opphav til uønskede cellulære effekter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234