Summary
En effektiv metode for å få innsikt i å visualisere paracrine-avledet ROS induksjon av endotelial Ca2 + signalering er beskrevet. Denne metoden tar nytte av å måle paracrine avledet ROS utløst Ca2 + mobilisering i vaskulære endotelceller i en co-kultur modell.
Abstract
Oksidativt stress har vært innblandet i en rekke patologiske tilstander, inkludert iskemi / reperfusjon skade og sepsis. Konseptet med oksidativt stress refererer til avvikende dannelse av ROS (reaktive oksygen arter), som inkluderer O 2 • -, H 2 O 2, og hydroksyl radikaler. Reaktive oksygen arter påvirker en rekke cellulære prosesser inkludert signaltransduksjon, celleproliferasjon og celledød 1-6. ROS har potensial til å skade vaskulære og orgel celler direkte, og kan initiere sekundære kjemiske reaksjoner og genetiske endringer som til slutt føre til en forsterkning av den første ROS-mediert vevsskade. En viktig del av forsterkningen kaskade som forverrer irreversibel vevsskade er rekruttering og aktivering av sirkulerende inflammatoriske celler. Under betennelse, inflammatoriske celler produserer cytokiner som tumor necrosis factor-α (TNF-alfa) og IL-1 somaktiverer endotelceller (EF) og epitelceller og ytterligere forsterke den inflammatoriske responsen 7. Vaskulær endotelial dysfunksjon er et etablert trekk ved akutt betennelse. Makrofager bidra til endotelial dysfunksjon ved betennelse ved mekanismer som forblir uklare. Aktivering av makrofager resultater i ekstracellulære utgivelsen av O 2 • - og ulike pro-inflammatoriske cytokiner, som utløser patologisk signalering i tilstøtende celler 8. NADPH oksidase er de viktigste og primære kilde til ROS i de fleste celletyper. Nylig er det vist av oss og andre, 9,10 som ROS produsert av NADPH oksidase indusere mitokondrie ROS produksjonen i mange patofysiologiske forhold. Derfor måle mitokondrienes ROS produksjonen er like viktig i tillegg til å måle cytosoliske ROS. Makrofager produsere ROS av flavoprotein enzymet NADPH oxidase som spiller en primær rolle i betennelse. Når aktivert,phagocytic NADPH oxidase produserer store mengder av O 2 • - som er viktige verten forsvarsmekanisme 11,12. Selv paracrine-avledet O 2 • - spiller en viktig rolle i patogenesen av vaskulære sykdommer, visualisering av paracrine ROS-indusert intracellulær signalering inkludert Ca 2 + mobilisering er fortsatt hypotesen. Vi har utviklet en modell der aktiverte makrofager blir brukt som en kilde til O 2 • - til transduce et signal til tilstøtende endotelceller. Ved hjelp av denne modellen demonstrerer vi at macrophage-avledet O 2 • - fører til kalsium signalisering i tilstøtende endotelceller.
Protocol
Reaktive oksygen arter kan måles i levende celler ved hjelp av oksidasjon sensitive fargestoffer (1 & 2) eller ved hjelp av plasmid sensorer (3 & 4) ved konfokalmikroskopi.
1. Visualisering av cytosoliske ROS i J774 celler
- Grow J774.1 mus monocytt-avledet makrofager (10 6 celler / ml) på glass bunn 35 mm retter (Harvard Apparatus) i 48 h.
- Challenge celler med TLR-agonister (2 mikrogram / ml, Lipo-teichoic syre-TLR2 agonist; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3 agonist, 1 mg / ml LPS-TLR4 agonist) for 6 timer ved 37 ° C.
Merk: Makrofager behandlet under lignende forhold ble brukt for co-kulturen modell Ca 2 + mobilisering. - Legg til oksidasjon-sensitive dye H 2 DCF-DA (Invitrogen) å gi en endelig konsentrasjon på 10 mM i ECM (ekstracellulært medium: 121 mM NaCl, 5 mm 3 NaHCO, 10 mM Na-HEPES, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH 2 4 PO, 1,2 mM MgSO 4, 2 mm 2 CaCl, 10mM glukose og 2,0% dekstran, 7,4 pH, alle hentet fra Sigma) som inneholder 2% BSA til retter og inkuber celler i 20 min før visualisering henhold konfokalmikroskopi.
- Etter fargestoff lasting, visualisere celler plassert på en temperaturstyrt stadium av en passende imaging system. Vi bruker Carl Zeiss LSM 510 Meta confocal imaging system kombinert med Argon ion laser kilde ved en eksitasjon av 488 nm for DCF fluorescens med 40x olje objektiv 13 (Fig. 1A og D).
- Analysere bilder ved hjelp ImageJ programvare (1.44), fritt tilgjengelig programvare fra National Institutes of Health (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).
2. Visualisering av mROS i J774 celler
- Grow J774.1 mus monocytt-avledet makrofager (10 6 celler / ml) på glass bunn 35 mm retter (Harvard Apparatus) i 48 h.
- Challenge cellene med TLR ligander å indusere mROS produksjon (2 mikrogram / ml, Lipo-teichoic syre-TLR2; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) for 6 timer ved 37 ° C.
- Legg mitokondrie superoxide indikator MitoSOX Rød (Invitrogen) å gi en endelig konsentrasjon på 5 mikrometer i ECM som inneholder 2% BSA til retter og inkuber celler i 30 min ved 37 ° C for å tillate lasting av MitoSOX Red.
- Etter fargestoff lasting, visualisere celler i et temperaturkontrollert stadium av en Carl Zeiss LSM 510 Meta confocal imaging system par med Argon ion laser kilde ved en eksitasjon av 561 nm for MitoSOX Red fluorescens med 40x olje objektiv (fig 1B og E).
- For kontroll eksperimenter, etter fargestoff lasting legge PBS eller DMSO (negativ kontroll) eller 2μM Antimycin A (som mitochondrial superoxide generator-positiv kontroll) til celler før image prøven som beskrevet i 2.4 (fig 1C).
- Analyser bilder ved hjelp ImageJ programvare (1.44).
3. Visualizatipå av cytosoliske ROS i stabilt hyper-CYTO MPMVECs
- Vi bruker pHyPer-CYTO (Evrogen) et pattedyr uttrykk vektor koding et fluorescerende sensor HyPer som lokaliserer i cytoplasma og spesielt sansene submicromolar konsentrasjonen av H 2 O 2 14.
- Transfektere murine Pulmonary mikrovaskulære endotelceller (MPMVECs) med pHyPer-CYTO vektor ved hjelp av enten electroporation eller transfeksjon reagenser. Vi bruker 10 x 10 6 celler og transfektere med 10μg av pHyPer-CYTO via electroporation bruker BioRad Gene pulser electroporator system (250V, 500 μF). Kultur MPMVECs i DMEM medium supplert med 10% FBS, unødvendig aminosyrer, endotelial vekst supplement og antibiotika.
Merk: Etter transfeksjon, plate celler ved lav tetthet for å lette koloni vekst. - Bytt medium med fullstendig kultur medium supplert med 500 mikrogram / ml G418, 48 timer etter transfeksjon. Screen for kloner som har høyest prosentandel av H yPer positive celler og passage HyPer positive kloner for å øke antall HyPer positive celler (fig 2).
Merk: Vi bruker seriell fortynning av celler for klonal utvalg av enkeltceller og skjermen for stabile celler svært uttrykker HyPer. - Grow stabil hyper-CYTO MPMVECs på 0,2% gelatin belagt Dekkglass (80% samløpet). Neste dag utfordring celler med TLR ligander (2 mikrogram / ml, Lipoteichoic syre-TLR2; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) for 6 timer ved 37 ° C. Ubehandlet cellene fungerer som kontroll.
- Etter behandling, montere Dekkglass på Attofluor celle kammeret (Invitrogen). Legg til 1 ml av pre varmet Hanks balansert salt-løsning (HBSS) til kammeret og plasser i kammeret på en temperaturstyrt stadium av Carl Zeiss LSM 510 Meta confocal imaging system. Visualiser og bilde fluorescens endre på en eksitasjon av 488 nm med 40x olje objektiv (Fig. 3A og D).
- Analysere bilder ved hjelp ImageJ programvare (1,44) (se pkt. 6).
- Vi bruker pHyPer-dMito (Evrogen) et pattedyr uttrykk vektor koding mitokondrier målrettede HyPer som lokaliserer i mitokondrier og spesielt sansene submicromolar konsentrasjonen av H 2 O 2.
- Transfektere MPMVECs med pHyPer-dMito og generere stabile Hyper-dMito MPMVECs følgende beskrevet i avsnitt 3.2 til 3.3.
- Grow stabil hyper-dMito MPMVECs på 0,2% gelatin belagt Dekkglass (80% samløpet).
- Neste dag utfordring celler med TLR ligander (2 mikrogram / ml, Lipoteichoic syre-TLR2; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) for 6 timer ved 37 ° C. Ubehandlet cellene fungerer som negativ kontroll. Legg 2μM Antimycin A (mitokondrie superoxide induser-positiv kontroll) før visualisere prøven.
- Etter behandling, montere Dekkglass på Attofluor celle kammeret (Invitrogen). Legg til 1 ml forvarmet Hanks balansert salt-løsning (HBSS) til kammeretog plasser i kammeret på en temperaturstyrt stadium av Carl Zeiss LSM 510 Meta confocal imaging system. Visualiser og bilde fluorescens endre på en eksitasjon av 488 nm med 40x olje objektiv (Fig. 3B, C og E).
- Analysere bilder ved hjelp ImageJ programvare (1,44) (se pkt. 6).
5. Co-kulturen modell for visualisering av paracrine-avledet ROS utløst Ca 2 + signalering i endotelceller
For visualisering og måling av [Ca 2 +] i endringene vi bruke en Ca 2 + sensitive fluorescerende fargestoff fluo-4 AM (Invitrogen).
- Grow MPMVECs på 0,2% gelatin belagt 25mm glass Dekkglass (80% samløpet).
- Inkuber cellene dyrket på Dekkglass i romtemperatur i 30 min i ECM som inneholder 2% BSA og 0,003% pluronic syre med 5 mM fluo-4 AM (Invitrogen) endelig konsentrasjon å tillate lasting av fluo-4 AM. Etter lasting, vask celler med eksperimentelle tenkelig løsning (ECM inneholder 0.25% BSA) som inneholder sulfinpyrazon å minimere farge tap.
- Etter lasting fluo-4, mount Dekkglass på Attofluor celle kammeret (Invitrogen). Legg 800μl av pre varmet eksperimentelle tenkelig løsning til kammeret og plassere den på en temperaturstyrt stadium av Carl Zeiss LSM 510 Meta confocal imaging system.
- I en separat tube merke nonactivated eller aktiveres makrofager isolert fra enten vill-type eller gp91 phox-/ - mus (behandlet med LPS for 6 timer) med cell tracker røde CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) i ECM som inneholder 2% BSA og 0,003% pluronic syre. Vask og resuspender celler med 200μl eksperimentelle tenkelig løsning.
- Legg merket makrofager på fluo-4 AM lastet MPMVECs i kammeret forsamlingen.
- Ta den grønne og røde fluorescens hver 3-ere i 10-20 min bruker Carl Zeiss LSM510 Meta confocal imaging system med en Argon ion laser kilde med eksitasjon ved 488 og 561 nm for fluo-4 AM og celle tracker rød fluorescens respectively (Fig.4 AC).
Merk: Alternativt kan J774.1 cellelinje brukes til å lokke fram MPMVECs Ca 2 + mobilisering. - Analyser fluo-4 fluorescensintensitet endringene ved hjelp ImageJ programvare (1,44) (se pkt. 6).
Seks. Dataanalyse med ImageJ programvare
Overfør bildene hentet fra confocal systemet som en. LSM format fil for dataanalyse. ZEN 2009 og ZEN 2010 programvaren som fulgte med LSM 510 Meta confocal mikroskop eller LSM 710 multiphoton confocal mikroskop sparer henholdsvis filer i. LSM format. Vi anbefaler å bruke denne innfødte. LSM-filer for bildeanalyse som original kvalitet er beholdt. Dette filformatet kan være direkte åpnes i bildeanalyse program Bilde J. De følgende trinn gir et eksempel kvantitativ analyse av enkelt bilde. Ingen ekstra plugins er nødvendig for at denne dataanalyse.
- Open. LSM eller. TIFF-fil i Image J program bruker Fil> Åpne
- Klikk på fanen IMAGE> COLOR> SPLIT kanaler og splittet de grønne og DIC kanaler. Bruk bildet fra den grønne kanalen for senere analyse.
- Dobbelklikk og velg 'Elliptical børsten utvalg "fanen og sett pikselverdien til 20.
- For Hyper-CYTO bilder, klikk på en enkelt celle for å definere sirkulært område for måling. Deretter trykker du "M"-tasten for å måle intensiteten på det valgte området. Verdiene er beholdt i et nytt resultater vindu.
- Next ved å holde "Shift"-tasten klikk på en annen celle for å velge et annet område, etterfulgt av å trykke "M"-tasten. Intensiteten er spilt inn i resultatet vinduet. Gjenta trinn 4-5 på 50 forskjellige celler.
- For Hyper d-Mito bilder, still pikselverdien til 10 i Elliptical børsten utvalget. Region av interesse (ROI) må manuelt spores blant annet mitokondriene særlig celler.
- Ved å bruke på frihånd, spore regionen rundt mitokondrier og trykk deretter på "M". Gjenta trinnene 6-7 på 50 forskjellige celler.
- Kopier meg ett verdier fra resultatene vinduet og lime i et Excel-ark eller noe programvare for å plotte resultatene. Vi bruker enten SigmaPlot eller Graphpad PRISM å plotte dataene som grafen.
7. Representant Resultater
Figur 1 viser cytosoliske og mitokondrielle ROS produksjon på utfordringen med TLR ligander. Representant confocal Bildene viser økning av DCF (cytosoliske) og MitoSOX Rød (mitokondrier) fluorescens etter 6 hr stimulering. Fluorescens endringene var normalisert og uttrykt som fold endring.
Figur 2 viser generasjon av stabile hyper-CYTO og Hyper-dMito endotelceller. Mus endotelceller var transfektert med pHyPer-CYTO eller pHyPer-dMito plasmid konstruerer via electroporation. Celler stabilt uttrykke plasmider ble valgt med G418 i to uker. Etter valget ble fortynnet celler seedet i 96 bra plater. Individuelle kolonier ble isolert og avbildes for homogent uttrykk.
e_content "> Figur 3 viser måling av endotelial cytosoliske og mitokondrielle H 2 O 2 nivåer. Representative confocal Bildene viser økning av hyper-CYTO (cytosoliske) og Hyper-dMito (mitokondrier) fluorescens etter 6 hr stimulering. fluorescensintensitet endringer ble normalisert og uttrykt som fold endring.Figur 4 viser vurderingen av macrophage-avledet ROS indusert endotelial cytosoliske Ca 2 + mobilisering. LPS-stimulerte makrofager ble lagt inn på lunge mikrovaskulære endotelceller (PMVEC) som hadde vært tidligere lastet med intracellulære Ca 2 + ([Ca 2 +] i) indikator dye Fluo-4. Påføring av villtype LPS-aktiverte makrofager fremkalt en [Ca 2 +] i økningen i PMVECs som ble dempes med knockout av funksjonelle NADPH oksidase (gp91 phox-/ -).
Figur 1. Visualizatipå av macrophage generert cellular ROS og mitokondrie superoxide. J774.1 celler ble utfordret med TLR2, 3 og 4 ligander (2 mikrogram / ml, Lipoteichoic syre-TLR2; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4). For 6 t ved 37 ° C. Etter behandling celler ble lastet med (A) cellulære ROS indikator (H 2 DCF-DA, grønn fluorescens) eller (B) mitokondrie superoxide indikator (MitoSOX Rød; rød fluorescens). (C) Antimycin A ble brukt som en positiv kontroll for mitochondrial ROS produksjon. Fluorescensintensitet endringer ble vurdert ved hjelp konfokalmikroskopi. (D) og (E) Kvantitering av gjennomsnittlig fluorescens endring.
Figur 2. Skjematisk fremstilling av generere stabile uttrykk for endotelcelle cytosoliske og mitochondrial ROS indikatorer.
Figur 3. V. isualization av endoteliale cytosoliske og mitokondrielle H 2 O 2 nivåer MPMVECs stabilt uttrykker (A) Hyper-CYTO eller (B) Hyper-dMito ble utfordret med TLR2, 3 og 4 ligander (2 mikrogram / ml, Lipoteichoic syre-TLR2; 10μg / ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) for 6 timer ved 37 ° C. (C) Antimycin A ble brukt som en positiv kontroll for mitochondrial ROS produksjon. Etter behandling ble fluorescensintensitet forandringer vurdert ved hjelp konfokalmikroskopi. (D) og (E) Kvantitering av gjennomsnittlig fluorescens endring.
Figur 4. Makrofag-avledet ROS framprovosere nedsatt endotelcelle Ca 2 + mobilisering. (A) Skjematisk fremstilling av endotelceller / macrophage co-kulturen modell studie. (B) Freshly isolert murine makrofager fra både WT og gp91phox null mus (The Jackson Laboratory) ble aktivert med 1 mg / ml LPS for 6 t. Macrophages var merket med celle-tracker Red (rød) og lagt inn på Fluo-4 lastet PMVECs (grønn) for å vurdere paracrine O 2 • -. signalering (C) LPS-aktiverte makrofager isolert fra WT mus utløst stor og rask Ca 2 + mobilisering i PMVECs sammenlignet med makrofager fra gp91phox null mus. Validering av makrofag aktivering er vist tidligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden er beskrevet her tillater rask og kvantitativ måling av reaktive oksygen arter i levende celler bruker oksidering sensitive fargestoffer eller plasmid sensorer. Agonister av TLRs (Toll-like reseptorer) er forbindelser som stimulerer cellene gjennom TLRs tilstede på celleoverflaten og utløse nedstrøms signalveier 15. I protokoll vår, brukte vi tre ulike TLR-agonister viz, Lipo-teichoic syre-TLR2 agonist, Poly (I: C).-TLR3 agonist; LPS-TLR4 agonist som er rapportert å indusere ROS som et modellsystem for å demonstrere ROS måling . Måling av ROS bruke oksidanter sensitive fargestoff er rask og kan brukes til å måle ulike ROS arter. Bruken av plasmid basert sensor HyPer oppdager selektivt H 2 O 2 nivåer. H 2 O 2 er mer stabil oxidant og også bruk av HyPer CYTO og Hyper-dMito i en stabil celle innstilling legger fordel over foto-autooxidation av ROS sensitive fluorescerende fargestoffer.HyPer ikke forårsaker artifactual ROS generasjon og kan brukes for påvisning av raske endringer av H 2 O 2-konsentrasjonen i ulike celle avdelinger under ulike fysiologiske og patologiske tilstander. Celler stabilt uttrykker HyPer sensorene brukes for klonal utvalg av befolkningen som tilbyr mer pålitelige og nøyaktige målinger av H 2 O 2 nivåer. Viktigere, beskriver denne metoden også påvisning og kvantitativ måling av Ca 2 + mobilisering i levende celler utløst av paracrine avledet ROS fra nabocellene slik som medfødte immunceller. Denne eksperimentelle prosedyren kombinert med konfokalmikroskopi kan være svært nyttig for å avdekke viktige spatio-tidsmessige endringer i celle signaltransduksjon hendelser, spesielt i tilfeller der to ulike celletyper er involvert. Skjønt, det representative eksperimentene beskrevet i denne artikkelen er bare ett eksempel på den type samhandling studert, kan denne teknikken være lett endapted å studere cellulære interaksjoner mellom flere live celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health stipend (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) til MM. Vår artikkel er delvis støttet av Carl Zeiss Microimaging LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 | |
| Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate, Millipore | 02-102 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 | |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| H2DCFDA | Invitrogen | D-399 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4516 | |
| LTA | Sigma-Aldrich | L2515 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 | |
| Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 | |
| pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 | |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 | |
| Poly(I:C) | Sigma-Aldrich | P0913 | |
| Prism software 5.0 | GraphPad Software Inc. | ||
| SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | ||
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 | |
| T-25 Flasks | Corning | 430639 | |
| T-75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| 96-well TC micro well plate | BD Biosciences | 353072 | |
| Zen 2009 software | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Madesh, M. Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis. J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 Forthcoming.
- Hawkins, B. J. S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis. J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).
- Madesh, M., Hajnoczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
- Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
- Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. Harmful molecular mechanisms in sepsis. Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).
- Sanlioglu, S. Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa. 276, 30188-30198 (2001).
- Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling. Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).
- Vliet, A. vander NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more. Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).
- Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent. J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).
- Lambeth, J. D. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).
- Mukhopadhyay, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
