Summary
一种有效的方法获得可视化的旁分泌衍生活性氧诱导内皮细胞Ca2 +信号的见解的描述。这种方法测量旁分泌衍生活性氧引发共培养模型在血管内皮细胞内Ca2 +动员的优势。
Abstract
氧化应激有牵连的一些包括缺血/再灌注损伤和败血症的病理条件。氧化应激的概念是指异常形成的活性氧（活性氧），其中包括 Ø 2• - ，H 2 O 2，和羟基自由基。活性氧的影响多种细胞过程，包括信号转导，细胞增殖和细胞死亡 1-6 。活性氧有可能直接损伤血管和器官的细胞，并能启动中学的化学反应和遗传变异，最终导致初始ROS介导的组织损伤的放大。放大级联，加剧了不可逆的组织损伤的一个关键组成部分是招募和循环炎性细胞的激活。在炎症，炎性细胞产生细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNFα）和IL - 1，激活内皮细胞（EC）和上皮细胞，并进一步增强炎症反应 7 。血管内皮功能障碍是一种急性炎症的建立功能。巨噬细胞促进血管内皮功能障碍，在炎症的机制仍不清楚。 • -和各种促炎性细胞因子，从而触发在相邻细胞的病理信号 8激活巨噬细胞外释放的O 2的结果。 NADPH氧化酶是ROS的主要的主要来源，在大多数的细胞类型。最近，它是我们和其他9,10所示，由NADPH氧化酶产生的活性氧诱导线粒体ROS在许多病理生理条件的生产。因此，测量线粒体ROS产生同样重要的是，除了测量胞质ROS的。巨噬细胞产生ROS的黄素酶NADPH氧化酶在炎症反应中起着主要作用。一旦被激活，吞噬细胞NADPH氧化酶产生丰富的O 2• - 11,12在宿主防御机制的重要。虽然旁分泌衍生Ø 2• -扮演重要的作用，在血管疾病的发病机制，包括CA 2旁分泌ROS诱导的细胞内信号可视化 +动员仍然是假说。我们已经开发出了激活巨噬细胞作为氧源•使用模型-信号转导的一个相邻的内皮细胞。使用这个模型，我们表明，巨噬细胞源性Ø 2• -在邻近的内皮细胞钙信号。
Protocol
活性氧可测氧化敏感染料（1＆2）使用或使用质粒传感器（3＆4），共聚焦显微镜的活细胞。
1。 J774细胞胞质ROS的可视化
- 生长在玻璃底部35 mm培养皿（哈佛大学仪器），48小时J774.1小鼠单核细胞衍生的巨噬细胞（10 6细胞/ ml）
- 挑战细胞TLR激动剂（2微克/毫升，磷壁酸锂TLR2激动剂;10μg/ml，保利（I：C）- TLR3激动剂; 1微克/ ml的LPS - TLR4的激动剂）为6小时37 ° C
注：类似条件下处理的巨噬细胞共培养模型的Ca 2 +动员。 - 添加氧化敏感的染料H 2 DCF - DA（Invitrogen公司）给ECM终浓度为10μm（外介质：121毫米氯化钠，碳酸氢钠3，5毫米10毫米钠HEPES，氯化钾4.7毫米，1.2毫米的KH 2 PO 4，硫酸镁 1.2毫米，2毫米氯化钙2，10葡萄糖和2.0％右旋糖酐，pH值7.4;取得所有自Sigma）含2％BSA的菜肴和共聚焦显微镜下可视化的前20分钟的孵育细胞。
- 染料加载后，可视化放在一个适当的成像系统上的一个温度控制阶段的细胞。我们使用卡尔蔡司LSM 510 META激光共聚焦成像系统，氩离子激光源加上488 DCF的荧光纳米40X油目标 13（图1A和D）的激发。
- 分析图像使用ImageJ软件（1.44），从国立卫生研究院提供免费软件（Rasband，WS，ImageJ，美国，马里兰州贝塞斯达，美国国家卫生研究院http://rsb.info.nih.gov/ij / 1997-2009）。
2。 J774细胞在可视化mROS
- 生长在玻璃底部35 mm培养皿（哈佛大学仪器），48小时J774.1小鼠单核细胞衍生的巨噬细胞（10 6细胞/ ml）
- 挑战的TLR配体细胞诱导mROS生产（2微克/毫升，锂，磷壁酸- TLR2的10μg/ml，保利（I：C）- TLR3的; 1微克/ ml的LPS - TLR4）的为6 h，在37 °; C。
- 线粒体超氧指标MitoSOX红（Invitrogen公司）给ECM终浓度的5微米，含2％BSA的菜肴和培育细胞30分钟，在37 ° C至允许装载MitoSOX红。
- 染料加载后，可视化细胞上的一个温度控制的卡尔蔡司LSM 510元共聚焦成像系统与氩离子激光器MitoSOX红色荧光，使用40倍的石油目标（图1B和E）的561纳米的激发源夫妇阶段。
- 对于控制实验后，染料加载添加PBS或DMSO（阴性对照）或2μm的抗霉素（线粒体超氧发生器阳性对照）之前向细胞图像样本在2.4（图1C）所述。
- 使用ImageJ软件（1.44），分析图像。
3。 Visualizati胞浆内活性氧在稳定的Hyper - CYTO MPMVECs
- 我们使用pHyPer CYTO（Evrogen）哺乳动物表达载体编码一个荧光传感器超定位在细胞质和专门感官submicromolar浓度的H 2 O 2月 14日 。
- 转染小鼠肺微血管内皮细胞（MPMVECs）pHyPer - CYTO使用或者电击或转染试剂的载体。通过使用BioRad公司基因脉冲electroporator系统（250V; 500μF），电击，我们使用10 × 10 6细胞的pHyPer CYTO10μg染。辅以10％胎牛血清，非必需氨基酸，内皮细胞生长补充和抗生素的DMEM培养基培养MPMVECs。
注意：以下转染细胞，低密度板，以方便菌落生长。 - 用500微克/ ml的G418，转染后的48小时内完成文化培养基介质。屏幕克隆H的比例最高 yPer阳性细胞，并通过超阳性克隆，以增加超阳性细胞（图2）。
注：我们采用连续稀释的细胞，单细胞克隆选择和稳定细胞高表达的Hyper屏幕。 - 生长在0.2％明胶涂层盖玻片（80％汇合）稳定的Hyper - CYTO MPMVECs。第二天挑战细胞的TLR配体（;10μg/ml，保利（2微克/毫升，脂磷壁酸TLR2的：C）- TLR3的; 1μg/ ml的LPS - TLR4的）为6小时，在37 ° C。未经处理的细胞作为控制。
- 治疗后，安装到Attofluor细胞室（Invitrogen公司）的盖玻片。新增预1毫升回暖汉克斯平衡盐溶液（HBSS）总商会和地方商会卡尔蔡司LSM 510 META激光共聚焦成像系统上的一个温度控制阶段。可视化和图像在使用40X的石油目标（图3A和D）的488 nm的激发荧光的变化。
- 分析图像使用ImageJ软件（1.44）（见第6节）。
- 我们使用pHyPer dMito（Evrogen）一个哺乳动物表达载体编码线粒体定位超定位在线粒体和专门感官submicromolar浓度的H 2 O 2。
- 转染与pHyPer dMito MPMVECs和产生稳定的Hyper - dMito MPMVECs 3.2-3.3节所述的步骤。
- 生长在0.2％明胶涂层盖玻片（80％汇合）稳定的Hyper - dMito MPMVECs。
- 第二天挑战细胞的TLR配体（;10μg/ml，保利（2微克/毫升，脂磷壁酸TLR2的：C）- TLR3的; 1μg/ ml的LPS - TLR4的）为6小时，在37 ° C。未经处理的细胞作为阴性对照。添加2μm的抗霉素（线粒体超氧诱导阳性对照）之前，以可视化的一个样本。
- 治疗后，安装到Attofluor细胞室（Invitrogen公司）的盖玻片。新增预热汉克斯平衡盐溶液（HBSS）1ml到室地方室温度卡尔蔡司LSM 510 META激光共聚焦成像系统的控制阶段。可视化和图像使用40倍的石油目标（图3B，C和E）的488 nm的激发荧光的变化。
- 分析图像使用ImageJ软件（1.44）（见第6节）。
5。共培养模型内皮细胞旁分泌衍生活性氧的可视化触发的Ca 2 +信号
对于可视化和测量的[Ca 2 +] i的变化，我们使用的Ca 2 +敏感的荧光染料荧光凌晨4点（Invitrogen公司）
- 生长在0.2％明胶涂层25毫米盖玻片（80％汇合）MPMVECs。
- 盖玻片为30分钟在ECM含有5微米荧光凌晨4点（Invitrogen公司）终浓度为2％BSA和0.003％嵌段酸在室温孵育成长的细胞，让加载荧光凌晨4点。加载后，用细胞实验成像解决方案（ECM的含0。25％BSA），其中包含sulfinpyrazone以最大限度地减少染料损失。
- Attofluor细胞室（Invitrogen公司）搬上荧光4，摩盖玻片后。加入800μl预热预实验成像解决方案，会议厅和卡尔蔡司LSM 510 META激光共聚焦成像系统上的一个温度控制阶段。
- 在一个单独的管标签nonactivated或激活巨噬细胞中分离从野生类型或gp91 PHOX - / -小鼠的细胞跟踪红色CMTPX（500ng/ml）（Invitrogen公司）在ECM中含2％BSA（LPS 6小时处理）和0.003％的嵌段共聚物酸。与实验成像解决方案200μL洗涤和重悬细胞。
- 添加标记巨噬细胞上的荧光凌晨4点加载在商会大会MPMVECs。
- 记录的绿色和红色荧光，每3S为10-20分钟，用氩离子激光源与激励使用卡尔蔡司LSM510 META共焦成像系统在488和561 nm的荧光凌晨4点和细胞跟踪红色荧光respectivelY（图4交流电）。
注：另外，J774.1细胞系可用于引出MPMVECs的Ca 2 +动员。 - 分析荧光- 4荧光强度的变化，使用ImageJ软件（1.44）（见第6节）。
6。使用ImageJ软件进行数据分析
转让共聚焦系统的数据分析。LSM格式的文件获得的图像。 2009年和禅ZEN的2010软件与LSM 510元共聚焦显微镜或LSM提供710多光子共聚焦显微镜分别保存。LSM格式的文件。我们建议使用这种原生图像分析LSM文件，为保留原有的品质。这种文件格式可以直接打开图像分析程序中的图像J.以下步骤提供了一个例子单幅图像定量分析。无需额外的插件需要此数据分析。
- 打开“。LSM或TIFF文件中使用”文件“>”打开“程序图像J
- 点击“选项卡图像>二氧化碳LOR>分割渠道和分裂的绿色和DIC渠道。从绿色通道，以供后续分析使用的图像。
- 双击，选择“椭圆刷选择”标签的像素值设置为20。
- 对于超的细胞图像，点击一个单元格定义测量的圆形区域。然后按“M”键来衡量所选区域的强度。值保留在一个窗口中的新成果。
- 通过举办不同的细胞“Shift”键单击以选中的另一个领域，按“M”键下一步。强度记录在结果窗口。重复步骤4-5 50种不同的细胞。
- 对于Hyper D -美图图像，像素值设置至10日在椭圆刷选择。感兴趣区域（ROI）以手动方式追查，包括特定的细胞线粒体。
- 使用FreeHand，跟踪区域周围的线粒体，然后按“M”。重复步骤6-7 50种不同的细胞。
- 复制的我从结果窗口，并粘贴在一个Excel工作表或任何软件绘制的结果值。我们使用要么SigmaPlot或Graphpad棱镜情节作为图形数据。
7。代表性的成果
图1显示胞质和线粒体ROS产生的TLR配体所面临的挑战时。代表共聚焦图像显示DCF（胞浆）和MitoSOX红（线粒体）的刺激后6小时的荧光增加。荧光变化正常化，并表示作为倍的变化。
图2显示了稳定的Hyper -的细胞和内皮细胞超dMito代。小鼠内皮细胞转染与pHyPer CYTO或通过电穿孔pHyPer dMito质粒结构。 G418两个星期的稳定表达质粒的细胞被选中。选择后，稀释后的细胞接种于96孔板。单个菌落进行分离和同质化的表达成像。
e_content“>图3显示了内皮细胞的细胞质和线粒体H 2 O 2水平的测量。代表共聚焦图像显示增加的Hyper -的细胞（胞浆）和Hyper - dMito（线粒体）的刺激后6小时的荧光，荧光强度的变化正常化并表示作为倍改变。图4显示了评估的巨噬细胞源性活性氧诱导的内皮细胞胞浆内的Ca 2 +动员。 LPS刺激的巨噬细胞，分别加入到肺微血管内皮细胞（PMVEC）以前已经加载与细胞内 Ca 2 +（CA 2 +] i的）指示剂荧光4。应用野生型LPS激活巨噬细胞诱发的[Ca 2 +] i的上升在PMVECs功能NADPH氧化酶基因敲除减毒（gp91 PHOX - / - ）。
图1。 Visualizati巨噬细胞产生的细胞活性氧和线粒体超氧。 J774.1细胞TLR2，3和4配体与挑战（2微克/毫升，脂磷壁酸- TLR2的;10μg/ml，保利（I：C）- TLR3的; 1μg/ ml的LPS - TLR4的6 h后）。 37 ° C。 （一）治疗后细胞装入的细胞活性氧指标（H 2 DCF - DA的绿色荧光）或（B）线粒体超氧指标（MitoSOX红色，红色荧光） 。 （三）抗霉素A作为阳性对照线粒体ROS产生。使用共聚焦显微镜，荧光强度的变化进行了评估。 （四）及（E）的平均荧光变化的定量分析。
图2。产生的内皮细胞的胞质和线粒体ROS的指标稳定表达的示意图 。
图3。 V内皮细胞的细胞质和线粒体H 2 O 2水平isualization MPMVECs稳定表达（一）超细胞质或（B）的Hyper - dMito，与TLR2的，3和4配体（2微克/毫升，脂磷壁酸- TLR2的挑战;10μg/毫升，保利（I：C）- TLR3的; 1微克/ ml的LPS - TLR4的）为6小时，在37 ° C。 （三）抗霉素A作为阳性对照线粒体ROS产生。治疗后使用共聚焦显微镜，荧光强度的变化进行了评估。 （四）及（E）的平均荧光变化的定量分析。
图4。巨噬细胞源性活性氧引起内皮细胞受损的Ca 2 +动员。 （一）6小时1μg/ ml的LPS示意图（二）从WT和gp91phox null小鼠（杰克逊实验室）新鲜分离的小鼠巨噬细胞被激活内皮细胞/巨噬细胞共培养模型的研究Macrophages标记细胞跟踪Red（红色）和添加到荧光4加载PMVECs（绿色），以评估旁分泌Ø 2• -的信号（三 ）从WT小鼠中分离出的内毒素激活巨噬细胞，引发大和迅速的Ca 2 +动员从gp91phox null小鼠的巨噬细胞相比PMVECs。巨噬细胞活化的验证先前已被证明。
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Discussion
这里介绍的方法，允许快速和定量测量活性氧，在活细胞使用的氧化敏感的染料或质粒传感器。的Toll样受体激动剂（Toll样受体）的化合物，通过TLRs的细胞表面上的刺激细胞和触发下游信号通路15。在我们的协议中，我们使用三种不同的TLR激动剂，即，锂，磷壁酸TLR2激动剂;聚（I：C）。TLR3激动剂; LPS - TLR4的激动剂据报道，作为一个模型系统诱导ROS证明活性氧测量。使用氧化剂敏感染料的活性氧的测量迅速，可用于测量各种活性氧物种。使用质粒基于传感器超选择性检测H 2 O 2的水平。 H 2 O 2是更稳定的氧化剂和超CYTO和Hyper - dMito在一个稳定的细胞设置的使用也增加了对照片自动氧化活性氧敏感的荧光染料的优势。超不引起artifactual ROS生成，可用于检测各种生理和病理条件下下不同的细胞车厢的H 2 O 2浓度的快速变化。细胞稳定表达的Hyper传感器用于人口的克隆选择的H 2 O 2水平，提供了更为可靠和准确的测量。重要的是，这种方法还介绍了检测和定量测量的Ca 2 +触发从邻近的细胞，如先天免疫细胞通过旁分泌而得的活性氧的活体细胞的动员。这个实验过程中，结合共焦显微镜可能是非常有用的，重要的时空变化，特别是在两个不同类型的细胞都参与的细胞信号转导事件揭示的。虽然，本文详细介绍了有代表性的实验只是一个例子，研究相互作用的类型，这种技术可以很容易地的一个dapted研究多种活细胞类型的细胞之间的相互作用。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持批卫生研究院（R01 HL086699，HL086699 01A2S1，1S10RR027327 - 01）的MM。我们的文章部分是由卡尔蔡司显微成像公司的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 | |
| Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate, Millipore | 02-102 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 | |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| H2DCFDA | Invitrogen | D-399 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4516 | |
| LTA | Sigma-Aldrich | L2515 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 | |
| Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 | |
| pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 | |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 | |
| Poly(I:C) | Sigma-Aldrich | P0913 | |
| Prism software 5.0 | GraphPad Software Inc. | ||
| SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | ||
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 | |
| T-25 Flasks | Corning | 430639 | |
| T-75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| 96-well TC micro well plate | BD Biosciences | 353072 | |
| Zen 2009 software | Carl Zeiss, Inc. |
References
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