Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

संवहनी Ca के विज़ुअलाइज़ेशन 2 + संकेतन Paracrine व्युत्पन्न ROS द्वारा ट्रिगर

doi: 10.3791/3511 Published: December 21, 2011

Summary

Paracrine व्युत्पन्न endothelial सीए 2 + संकेत के ROS प्रेरण visualizing में अंतर्दृष्टि लाभ के लिए एक कुशल विधि वर्णित है. इस विधि paracrine व्युत्पन्न ROS मापने संवहनी endothelial कोशिकाओं में एक सह संस्कृति मॉडल में सीए 2 + जुटाना ट्रिगर का लाभ लेता है.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों रहते ऑक्सीकरण संवेदनशील रंजक (1 और 2) का उपयोग कर या confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा प्लाज्मिड सेंसर (3 एवं 4) का उपयोग कोशिकाओं में मापा जा सकता है है.

1. साइटोसोलिक ROS के J774 कोशिकाओं में विज़ुअलाइज़ेशन

  1. गिलास 35 मिमी व्यंजन (हार्वर्ड उपकरण) नीचे पर J774.1 monocyte व्युत्पन्न माउस मैक्रोफेज (10 6 कोशिकाओं / एमएल) 48 एच. के लिए आगे बढ़ें
  2. 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस: TLR agonists (; सी) TLR3 agonist 1 μg / मिलीलीटर LPS TLR4 agonist 10μg/ml, पाली (मैं 2 μg / एमएल, Lipo-teichoic एसिड TLR2 agonist) के साथ चैलेंज कोशिकाओं
    नोट: इसी तरह की शर्तों के तहत इलाज मैक्रोफेज सह संस्कृति मॉडल 2 + जुटाना Ca के लिए इस्तेमाल किया गया .
  3. जोड़ें ऑक्सीकरण डाई एच डीसीएफ डीए 2 (Invitrogen) ईसीएम में 10 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता (कोशिकी मध्यम देने के लिए संवेदनशील: 121 मिमी NaCl, 5 मिमी 3 NaHCO, 10 ना HEPES मिमी, 4.7 मिमी KCl, 1.2 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 1.2 मिमी MgSO 4, 2 मिमी 2 CaCl, 10ग्लूकोज मिमी और 2.0% dextran, पीएच 7.4, सिग्मा से प्राप्त सभी) और confocal माइक्रोस्कोपी के तहत दृश्य से पहले 20 मिनट के लिए व्यंजन सेते कोशिकाओं के लिए 2% BSA युक्त.
  4. डाई लोड करने के बाद, एक उपयुक्त इमेजिंग प्रणाली के तापमान नियंत्रित मंच पर रखा कोशिकाओं कल्पना. हम कार्ल Zeiss LSM 510 मेटा इमेजिंग confocal 40x तेल 13 उद्देश्य (छवि 1 ए और डी) का उपयोग डीसीएफ प्रतिदीप्ति के लिए 488 एनएम के एक उत्तेजना में आर्गन आयन लेजर स्रोत के साथ मिलकर प्रणाली का उपयोग करें .
  5. छवियों का उपयोग ImageJ सॉफ्टवेयर (1.44), स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से आज़ादी से उपलब्ध सॉफ्टवेयर (Rasband, था, ImageJ, स्वास्थ्य, बेथेस्डा, मेरीलैंड, संयुक्त राज्य अमेरिका, अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों विश्लेषण http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).

2. MROS के J774 कोशिकाओं में विज़ुअलाइज़ेशन

  1. गिलास 35 मिमी व्यंजन (हार्वर्ड उपकरण) नीचे पर J774.1 monocyte व्युत्पन्न माउस मैक्रोफेज (10 6 कोशिकाओं / एमएल) 48 एच. के लिए आगे बढ़ें
  2. चुनौती TLR ligands के साथ कोशिकाओं mROS उत्पादन (2 / μg मिलीलीटर, Lipo-teichoic एसिड TLR2 प्रेरित; 10μg/ml, पाली (मैं: सी) - TLR3, 1 μg / मिलीलीटर LPS-TLR4) 37 से कम 6 घंटे के लिए ° सी.
  3. Mitochondrial superoxide सूचक MitoSOX लाल (Invitrogen) जोड़ें ईसीएम में 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता और 37 पर 30 मिनट के लिए व्यंजन सेते कोशिकाओं के लिए 2% BSA युक्त डिग्री सेल्सियस की अनुमति देने के लिए दे MitoSOX लाल के लोड हो रहा है.
  4. डाई लोड करने के बाद, कार्ल Zeiss LSM 510 मेटा MitoSOX लाल प्रतिदीप्ति के लिए 561 एनएम 40x तेल उद्देश्य (चित्र 1 बी और ई) का उपयोग कर के एक उत्तेजना में आर्गन आयन लेजर स्रोत के साथ confocal इमेजिंग प्रणाली जोड़े के एक तापमान नियंत्रित मंच पर कोशिकाओं कल्पना.
  5. नियंत्रण प्रयोगों के लिए, डाई लोड हो रहा है जोड़ने के पीबीएस या DMSO (नकारात्मक नियंत्रण) या 2μM Antimycin के बाद एक (mitochondrial superoxide के रूप में जनरेटर सकारात्मक नियंत्रण) कोशिकाओं को पहले 2.4 (चित्र 1C) में वर्णित के रूप में नमूना छवि के लिए.
  6. ImageJ सॉफ्टवेयर (1.44) का उपयोग करते हुए छवियों का विश्लेषण.

3. Visualizatiस्थिर अति cyto MPMVECs में साइटोसोलिक ROS पर

  1. हम (Evrogen) एक स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर एन्कोडिंग pHyPer - cyto एक फ्लोरोसेंट सेंसर हाइपर है कि cytoplasm और एच 2 2 हे 14 के विशेष रूप से होश submicromolar एकाग्रता में localizes का उपयोग करें.
  2. Transfect murine फेफड़े pHyPer cyto या तो electroporation या अभिकर्मक अभिकर्मकों का उपयोग वेक्टर के साथ Microvascular Endothelial कोशिकाओं (MPMVECs). Electroporation BioRad जीन pulser electroporator प्रणाली (, 500 μF 250V) का उपयोग कर के माध्यम से हम x 10 10 6 pHyPer cyto के 10μg के साथ और कोशिकाओं transfect का उपयोग करें. DMEM माध्यम से संस्कृति MPMVECs 10% FBS, nonessential अमीनो एसिड, endothelial वृद्धि पूरक और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक.
    नोट: के बाद अभिकर्मक, कम घनत्व पर थाली कोशिकाओं को कॉलोनी के विकास की सुविधा.
  3. पूरी संस्कृति 500 ​​μg / एमएल G418, अभिकर्मक के बाद 48 घंटे के साथ पूरक माध्यम से मध्यम बदलें. क्लोन है कि एच के सर्वोच्च प्रतिशत है के लिए स्क्रीन yPer सकारात्मक कोशिकाओं और बीतने के अति सकारात्मक क्लोन करने के लिए अति सकारात्मक कोशिकाओं (छवि 2) की संख्या में वृद्धि.
    नोट: हम कोशिकाओं एकल स्थिर अत्यधिक हाइपर व्यक्त की कोशिकाओं के लिए और स्क्रीन के clonal चयन के लिए धारावाहिक कोशिकाओं के कमजोर पड़ने का उपयोग करें.
  4. 0.2% जिलेटिन लेपित coverslips (80% संगम) पर स्थिर अति cyto MPMVECs हो जाओ. पर 37 घंटे 6 डिग्री सेल्सियस: अगले दिन TLR ligands (1 μg / मिलीलीटर LPS-TLR4; सी) - TLR3 10μg/ml, पाली (मैं 2 μg / एमएल, Lipoteichoic एसिड - TLR2) के साथ चुनौती कोशिकाओं इलाज कोशिकाओं नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं.
  5. उपचार के बाद, Attofluor सेल कक्ष (Invitrogen) पर coverslips माउंट. पूर्व की 1ml जोड़ें चैम्बर के लिए गरम हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS) और कार्ल Zeiss LSM 510 मेटा confocal इमेजिंग प्रणाली के तापमान नियंत्रित मंच पर चैम्बर जगह. कल्पना और छवि 40x तेल उद्देश्य (छवि 3 ए और डी) का उपयोग कर 488 एनएम के एक उत्तेजना प्रतिदीप्ति परिवर्तन.
  6. ImageJ (1.44) सॉफ्टवेयर (अनुभाग 6 को देखें) का उपयोग करते हुए छवियों का विश्लेषण.
> itle "स्थिर अति dMito MPMVECs में 4 mitochondrial ROS के विज़ुअलाइज़ेशन

  1. हम pHyPer - dMito (Evrogen) एक स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर एन्कोडिंग अति mitochondria - लक्षित है कि एच 2 हे 2 mitochondria और विशेष रूप से होश submicromolar एकाग्रता में localizes का उपयोग करें.
  2. PHyPer dMito साथ transfect MPMVECs और 3.2-3.3 खंड में वर्णित चरणों का पालन स्थिर अति dMito MPMVECs उत्पन्न.
  3. 0.2% जिलेटिन लेपित coverslips (80% संगम) पर स्थिर अति dMito MPMVECs हो जाओ.
  4. पर 37 घंटे 6 डिग्री सेल्सियस: अगले दिन TLR ligands (1 μg / मिलीलीटर LPS-TLR4; सी) - TLR3 10μg/ml, पाली (मैं 2 μg / एमएल, Lipoteichoic एसिड - TLR2) के साथ चुनौती कोशिकाओं इलाज कोशिकाओं नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं. 2μM एक नमूना (mitochondrial superoxide inducer सकारात्मक नियंत्रण) पहले visualizing Antimycin जोड़ें.
  5. उपचार के बाद, Attofluor सेल कक्ष (Invitrogen) पर coverslips माउंट. चैम्बर के लिए पूर्व गर्म हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 1ml जोड़ेंऔर कार्ल Zeiss LSM 510 मेटा confocal इमेजिंग प्रणाली के तापमान नियंत्रित मंच पर चैम्बर जगह है. कल्पना और छवि 40x तेल उद्देश्य (छवि 3 बी, सी और ई) का उपयोग कर 488 एनएम के एक उत्तेजना प्रतिदीप्ति परिवर्तन.
  6. ImageJ (1.44) सॉफ्टवेयर (अनुभाग 6 को देखें) का उपयोग करते हुए छवियों का विश्लेषण.

5. 2 Ca ट्रिगर paracrine व्युत्पन्न ROS के दृश्य के लिए सह संस्कृति मॉडल + endothelial कोशिकाओं में संकेत

के दृश्य के माप के लिए [2 Ca +] मैं परिवर्तन हम एक 2 Ca का उपयोग करें + संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई fluo 4-AM ( Invitrogen).

  1. 0.2% जिलेटिन लेपित 25mm कांच coverslips (80% संगम) पर MPMVECs हो जाओ.
  2. ECM 5 सुक्ष्ममापी fluo 4-AM (Invitrogen) अंतिम एकाग्रता के साथ 2% BSA और 0.003% pluronic एसिड युक्त में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर coverslips पर विकसित कोशिकाओं को सेते AM fluo-4 के लदान की अनुमति. लोड करने के बाद, प्रयोगात्मक इमेजिंग समाधान के साथ कोशिकाओं धोने (ईसीएम 0 युक्त.25% BSA) sulfinpyrazone युक्त डाई नुकसान को कम.
  3. Attofluor सेल कक्ष (Invitrogen) पर fluo-4, माउंट coverslips लोड करने के बाद. पूर्व 800μl जोड़ें चैम्बर के लिए प्रयोगात्मक इमेजिंग समाधान गर्म और कार्ल Zeiss LSM 510 मेटा confocal इमेजिंग प्रणाली के तापमान नियंत्रित मंच पर जगह है.
  4. चूहों (6 घंटा लिए LPS के साथ इलाज) सेल ट्रैकर लाल (500ng/ml) ईसीएम में (Invitrogen) CMTPX के साथ 2% BSA युक्त एक अलग ट्यूब लेबल में nonactivated या सक्रिय मैक्रोफेज या तो जंगली प्रकार या phox / gp91 से अलग और 0.003% pluronic एसिड. धो और प्रयोगात्मक इमेजिंग समाधान के 200μl के साथ कोशिकाओं resuspend.
  5. चैम्बर विधानसभा में fluo-4 लोड AM MPMVECs पर लेबल मैक्रोफेज जोड़ें.
  6. हरे और लाल प्रतिदीप्ति fluo चार AM और सेल ट्रैकर लाल प्रतिदीप्ति respectivel के लिए 488 और 561 एनएम पर उत्तेजना के साथ आर्गन आयन लेजर स्रोत के साथ कार्ल Zeiss LSM510 मेटा confocal इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर 10-20 मिनट के लिए हर 3s कीर्तिमानy (Fig.4 एसी).
    नोट: वैकल्पिक रूप से, J774.1 सेल लाइन MPMVECs 2 Ca + जुटाना प्रकाश में लाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  7. विश्लेषण fluo 4 प्रतिदीप्ति तीव्रता ImageJ (1.44) सॉफ्टवेयर (अनुभाग 6 को देखें) का उपयोग परिवर्तन.

6. डेटा विश्लेषण का उपयोग ImageJ सॉफ्टवेयर

LSM. डेटा विश्लेषण के लिए प्रारूप फ़ाइल के रूप में confocal प्रणाली से प्राप्त छवियों स्थानांतरण. 2009 ज़ेन और ज़ेन 2010 LSM 510 मेटा confocal खुर्दबीन या LSM के साथ प्रदान की सॉफ्टवेयर 710 multiphoton confocal खुर्दबीन क्रमशः. LSM प्रारूप में फ़ाइलों को बचाता है. हम इस देशी का उपयोग कर छवि विश्लेषण के लिए सुझाव LSM फ़ाइलों के रूप में मूल गुणवत्ता बनाए रखा है. यह फ़ाइल स्वरूप सीधे छवि विश्लेषण कार्यक्रम छवि जे में खोला जा सकता है निम्नलिखित चरणों का एक उदाहरण एकल छवि के मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करते हैं. कोई अतिरिक्त plugins इस डेटा विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं.

  1. ओपन LSM या छवि जम्मू> फ़ाइल खुली का उपयोग कर कार्यक्रम में TIFF फ़ाइल
  2. टैब छवि पर क्लिक करें> सीओLOR> विभाजन चैनलों और हरे और डीआईसी चैनलों विभाजित. बाद के विश्लेषण के लिए ग्रीन चैनल से छवि का प्रयोग करें.
  3. डबल क्लिक करें और 'अण्डाकार ब्रश चयन "टैब का चयन करें और 20 पिक्सेल मूल्य सेट.
  4. हाइपर-cyto छवियों के लिए, माप के परिपत्र क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए एक एकल कक्ष पर क्लिक करें. फिर "एम" कुंजी प्रेस करने के लिए चयनित क्षेत्र की तीव्रता को मापने. मानों एक नया परिणाम विंडो में रखा जाता है.
  5. एक अलग सेल पर "Shift" कुंजी को क्लिक करें रखने के लिए एक अन्य क्षेत्र है, "एम" कुंजी दबाकर बाद का चयन करें अगला. तीव्रता परिणाम विंडो में दर्ज है. 50 विभिन्न कोशिकाओं पर 4-5 चरणों को दोहराएँ.
  6. हाइपर घ मिटो छवियों के लिए, अंडाकार ब्रश चयन में 10 पिक्सेल मान सेट. ब्याज की क्षेत्र (आरओआई) को मैन्युअल रूप से विशेष रूप से कोशिकाओं के mitochondria सहित पता लगाया जा है.
  7. मुक्तहस्त का उपयोग, के क्षेत्र का पता लगाने mitochondria और फिर प्रेस "एम" के आसपास. 50 विभिन्न कोशिकाओं पर 6-7 चरणों को दोहराएँ.
  8. मुझे प्रतिलिपि बनाएँ परिणाम और एक Excel पत्रक या किसी भी परिणाम साजिश सॉफ्टवेयर विंडो में पेस्ट से एक मान. हम या तो SigmaPlot या Graphpad चश्मे ग्राफ के रूप में डेटा प्लॉट का उपयोग करें.

7. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1 साइटोसोलिक और mitochondrial TLR ligands के साथ चुनौती पर ROS उत्पादन से पता चलता है. प्रतिनिधि confocal छवियों (साइटोसोलिक) DCF और MitoSOX (mitochondria) उत्तेजना के 6 घंटे के बाद प्रतिदीप्ति लाल की वृद्धि दिखा. प्रतिदीप्ति परिवर्तन सामान्यीकृत और गुना परिवर्तन के रूप में व्यक्त किया गया.

चित्रा 2 स्थिर अति cyto और अति dMito endothelial कोशिकाओं की पीढ़ी से पता चलता है. माउस endothelial कोशिकाओं pHyPer cyto या electroporation के माध्यम से pHyPer dMito प्लाज्मिड constructs साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे. कक्ष stably व्यक्त plasmids G418 के साथ दो सप्ताह के लिए चुना गया. चयन के बाद, पतला कोशिकाओं में 96 अच्छी तरह प्लेटें वरीयता प्राप्त थे. व्यक्तिगत कालोनियों अलग और सजातीय अभिव्यक्ति के लिए imaged थे.

e_content "> चित्रा 3 endothelial साइटोसोलिक और mitochondrial एच 2 हे 2 स्तर की माप से पता चलता है कि प्रतिनिधि confocal छवियों (साइटोसोलिक) हाइपर cyto और अति dMito (mitochondria) उत्तेजना के 6 घंटे के बाद प्रतिदीप्ति की वृद्धि दिखा. प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन सामान्यीकृत किया गया और गुना को बदलने के रूप में व्यक्त की है.

चित्रा 4 बृहतभक्षककोशिका व्युत्पन्न ROS प्रेरित endothelial साइटोसोलिक 2 + जुटाना Ca के आकलन से पता चलता है. LPS-उत्तेजित मैक्रोफेज फेफड़े microvascular endothelial कोशिकाओं (PMVEC) कि पहले से intracellular Ca 2 के साथ लोड किया गया था पर जोड़ा गया था + [Ca (2 +] मैं) सूचक डाई Fluo 4. जंगली प्रकार LPS सक्रिय मैक्रोफेज के आवेदन एक [2 Ca +] पैदा मैं PMVECs कि कार्यात्मक NADPH oxidase की पीटकर द्वारा तनु था में वृद्धि (gp91 phox / -).

चित्रा 1
चित्रा 1. Visualizatiबृहतभक्षककोशिका के सेलुलर ROS और mitochondrial superoxide उत्पन्न. J774.1 कोशिकाओं TLR2, 3 और 4 ligands के साथ चुनौती दी थी (2 μg / मिलीलीटर, Lipoteichoic एसिड TLR2, 10μg/ml, पाली (मैं: 1 μg / मिलीलीटर LPS-TLR4 सी) TLR3) 6 घंटे के लिए . 37 डिग्री सेल्सियस उपचार के बाद कोशिकाओं के साथ भरी हुई थी (ए) सेलुलर ROS सूचक (एच 2 DCF - डीए, हरी प्रतिदीप्ति) या (बी) mitochondrial superoxide सूचक (MitoSOX लाल, लाल प्रतिदीप्ति ). (सी) Antimycin एक mitochondrial ROS उत्पादन के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग मूल्यांकन किया गया. (डी) और (ई) मतलब प्रतिदीप्ति परिवर्तन के quantitation.

चित्रा 2
चित्रा 2. Endothelial सेल साइटोसोलिक और mitochondrial ROS संकेतकों के स्थिर अभिव्यक्ति पैदा करने की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.

चित्रा 3
चित्रा 3. वीendothelial साइटोसोलिक और mitochondrial एच 2 हे 2 स्तर के isualization stably (ए) अति cyto व्यक्त MPMVECs या (ख) अति dMito TLR2, 3 और 4 ligands (2 μg / मिलीलीटर, Lipoteichoic एसिड TLR2 साथ चुनौती दी थी, 10μg / मिलीलीटर, (मैं: सी) पाली TLR3, 1 μg / मिलीलीटर LPS-TLR4 6 घंटे के लिए) 37 डिग्री सेल्सियस (सी) Antimycin एक mitochondrial ROS उत्पादन के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. उपचार के बाद, प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग मूल्यांकन किया गया. (डी) और (ई) मतलब प्रतिदीप्ति परिवर्तन के quantitation.

चित्रा 4
चित्रा 4. बृहतभक्षककोशिका व्युत्पन्न ROS बिगड़ा endothelial सेल Ca 2 + जुटाना प्रकाश में लाना. (ए) endothelial कोशिकाओं / बृहतभक्षककोशिका मॉडल सह संस्कृति अध्ययन के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (बी) दोनों WT और gp91phox अशक्त चूहों (जैक्सन प्रयोगशाला) से हौसले से अलग murine मैक्रोफेज 1 / μg मिलीलीटर LPS द्वारा 6 एच. के लिए सक्रिय थे Macrophages सेल ट्रैकर लाल (लाल) के साथ लेबल रहे थे और Fluo-4 लोड PMVECs (हरा) पर जोड़ा paracrine 2 हे आकलन - संकेतन (सी) LPS सक्रिय WT चूहों से अलग मैक्रोफेज बड़े और तेजी से Ca 2 + लामबंदी शुरू PMVECs में gp91phox अशक्त चूहों से मैक्रोफेज की तुलना. बृहतभक्षककोशिका सक्रियण की मान्यता पहले प्रदर्शित किया गया है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

विधि यहाँ वर्णित कोशिकाओं रहने वाले या तो ऑक्सीकरण संवेदनशील रंजक या प्लाज्मिड सेंसर का उपयोग करने में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के तेजी से और मात्रात्मक माप की अनुमति देता है. TLRs के agonists (टोल की तरह रिसेप्टर्स) यौगिकों कि कोशिका की सतह पर मौजूद TLRs के माध्यम से कोशिकाओं को उत्तेजित और बहाव के संकेत 15 रास्ते ट्रिगर कर रहे हैं. हमारे प्रोटोकॉल में, हम तीन अलग अलग TLR agonists अर्थात उपयोग किया है, Lipo-teichoic एसिड TLR2 agonist, (मैं: सी) पाली. TLR3 agonist, LPS-TLR4 agonist जो एक मॉडल प्रणाली के रूप में ROS उत्पन्न ROS माप प्रदर्शित करने के लिए रिपोर्ट कर रहे हैं . ROS के मापन oxidants संवेदनशील डाई का उपयोग करते हुए तेजी से है और ROS प्रजातियों की विविधता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्लाज्मिड आधारित सेंसर अति के प्रयोग के चुनिंदा एच 2 हे 2 स्तर का पता लगाता है . एच 2 2 हे ऑक्सीडेंट और अधिक स्थिर है और एक स्थिर सेल की स्थापना में भी हाइपर cyto और अति dMito का उपयोग ROS संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक के फोटो autooxidation अधिक लाभ कहते हैं.हाइपर artifactual ROS पीढ़ी के कारण नहीं करता है और विभिन्न शारीरिक और रोग की शर्तों के तहत अलग अलग सेल के डिब्बों में एच 2 हे 2 एकाग्रता के तेजी से परिवर्तन का पता लगाने के के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Stably हाइपर सेंसर व्यक्त कक्ष जनसंख्या के clonal चयन है कि एच 2 हे 2 स्तर के और अधिक विश्वसनीय और सटीक मापन प्रदान करता है के लिए इस्तेमाल किया जाता है. महत्वपूर्ण बात, इस विधि का पता लगाने और Ca 2 के मात्रात्मक माप + जीना सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे पड़ोसी कोशिकाओं से paracrine व्युत्पन्न ROS द्वारा ट्रिगर कोशिकाओं में जुटाना भी वर्णन करता है. यह प्रयोगात्मक confocal माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त प्रक्रिया बहुत उदाहरण है जहाँ दो अलग अलग सेल प्रकार शामिल हैं में विशेष रूप से सेल संकेत transduction घटनाओं में महत्वपूर्ण spatio-अस्थायी परिवर्तन प्रकट करने के लिए उपयोगी हो सकता है. हालांकि, प्रतिनिधि इस पत्र में विस्तृत प्रयोगों अध्ययन बातचीत के प्रकार के सिर्फ एक उदाहरण हैं, इस तकनीक का एक आसानी से किया जा सकता हैएकाधिक रहते सेल प्रकार के बीच बातचीत सेलुलर अध्ययन करने के लिए dapted.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय संस्थानों स्वास्थ्य अनुदान के एम.एम. (HL086699 R01, HL086699 01A2S1, 1S10RR027327-01) द्वारा समर्थित किया गया. हमारे लेख आंशिक रूप से कार्ल Zeiss MicroImaging LLC द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor cell chamber Invitrogen A7816
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
DMEM low glucose medium Invitrogen 10567-014
Endothelial growth factor supplement (ECGS) Upstate, Millipore 02-102
Fetal Bovine Serum Invitrogen 12662011
G418 Invitrogen 10131-027
Gelatin Sigma-Aldrich G1393
H2DCFDA Invitrogen D-399
LPS Sigma-Aldrich L4516
LTA Sigma-Aldrich L2515
MitoSOX Red Invitrogen M36008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Invitrogen 51985091
Pen/Strep (10x) Invitrogen 15140163
pHyPer-cyto Evrogen FP941
pHyPer-dMito Evrogen FP942
Poly(I:C) Sigma-Aldrich P0913
Prism software 5.0 GraphPad Software Inc.
SigmaPlot 11.0 Systat software, Inc.
Trypsin-EDTA (10x) Invitrogen 15400054
T-25 Flasks Corning 430639
T-75 Flasks BD Biosciences 353136
96-well TC micro well plate BD Biosciences 353072
Zen 2009 software Carl Zeiss, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Madesh, M. Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis. J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).
  2. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).
  3. Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 Forthcoming.
  4. Hawkins, B. J. S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis. J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).
  5. Madesh, M., Hajnoczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
  6. Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
  7. Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. Harmful molecular mechanisms in sepsis. Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).
  8. Sanlioglu, S. Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa. 276, 30188-30198 (2001).
  9. Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling. Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).
  10. Vliet, A. vander NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more. Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).
  11. Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent. J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).
  12. Lambeth, J. D. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).
  13. Mukhopadhyay, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).
  14. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  15. Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
संवहनी Ca के विज़ुअलाइज़ेशन<sup> 2 +</sup> संकेतन Paracrine व्युत्पन्न ROS द्वारा ट्रिगर
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mallilankaraman, K., Gandhirajan, R. K., Hawkins, B. J., Madesh, M. Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS. J. Vis. Exp. (58), e3511, doi:10.3791/3511 (2011).More

Mallilankaraman, K., Gandhirajan, R. K., Hawkins, B. J., Madesh, M. Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS. J. Vis. Exp. (58), e3511, doi:10.3791/3511 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter