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Biology

Visualizzazione dei Vascolare Ca 2 + Segnalazione Innescato dal paracrini Derivato ROS

doi: 10.3791/3511 Published: December 21, 2011

Summary

Un metodo efficiente per acquisire conoscenze in visualizzando il paracrino derivato induzione di ROS endoteliali Ca2 + segnalazione è descritto. Questo metodo si avvale della misurazione paracrini derivati ​​ROS innescato mobilitazione Ca2 + in cellule endoteliali vascolari in una co-coltura modello.

Abstract

Lo stress ossidativo è stato implicato in una serie di condizioni patologiche tra cui ischemia / riperfusione danni e sepsi. Il concetto di stress ossidativo si riferisce alla formazione aberrante di ROS (specie reattive dell'ossigeno), che includono O 2 • -, H 2 O 2, e di radicali idrossili. Specie reattive dell'ossigeno influenza una moltitudine di processi cellulari tra cui trasduzione del segnale, proliferazione cellulare e la morte delle cellule 1-6. ROS hanno il potenziale di danno vascolare e le cellule degli organi direttamente, e può avviare reazioni chimiche secondarie e alterazioni genetiche che alla fine risultare in un ampliamento del periodo iniziale di ROS-mediate danni ai tessuti. Una componente chiave della cascata di amplificazione che aggrava un danno irreversibile del tessuto è il reclutamento e l'attivazione delle cellule infiammatorie circolanti. Durante l'infiammazione, le cellule producono citochine infiammatorie come il tumor necrosis factor-α (TNF) e IL-1 cheattivare le cellule endoteliali (CE) e le cellule epiteliali e ulteriormente aumentare il 7 risposta infiammatoria. Disfunzione endoteliale vascolare è una caratteristica consolidata di infiammazione acuta. Macrofagi contribuire alla disfunzione endoteliale durante l'infiammazione con meccanismi che rimangono poco chiari. Attivazione dei macrofagi risultati nel rilascio extracellulare di O 2 • - e varie citochine pro-infiammatorie, che attiva segnali patologici nelle celle adiacenti 8. NADPH ossidasi sono la fonte principale e primario di ROS nella maggior parte dei tipi di cellule. Recentemente, è dimostrato da noi e gli altri 9,10 che ROS prodotta da NADPH ossidasi indurre la produzione mitocondriale di ROS durante molte condizioni fisiopatologiche. Quindi misurando la produzione mitocondriale di ROS è altrettanto importante oltre a misurare citosolico ROS. I macrofagi producono ROS dalla NADPH ossidasi enzima flavoproteina che svolge un ruolo primario nel processo infiammatorio. Una volta attivato,NADPH ossidasi fagocitica produce grandi quantità di O 2 • - che sono importanti nel meccanismo di difesa dell'ospite 11,12. Anche se paracrino derivati ​​O 2 • - gioca un ruolo importante nella patogenesi delle malattie vascolari, la visualizzazione di segnali paracrini intracellulare di ROS-indotta tra Ca 2 + mobilitazione è ancora un'ipotesi. Abbiamo sviluppato un modello in cui vengono utilizzati macrofagi attivati ​​come fonte di O 2 • - per trasdurre un segnale adiacente cellule endoteliali. Utilizzando questo modello abbiamo dimostrato che macrofagi derivati ​​O 2 • - portare al calcio di segnalazione in cellule endoteliali adiacenti.

Protocol

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Specie reattive dell'ossigeno può essere misurata in cellule vive con coloranti sensibili all'ossidazione (1 & 2) o utilizzando sensori plasmide (3 e 4) con la microscopia confocale.

1. Visualizzazione dei citosolico ROS nelle cellule J774

  1. Crescere J774.1 topo derivate da monociti macrofagi (10 6 cellule / ml) sul fondo di vetro da 35 mm piatti (Apparecchi di Harvard) per 48 h.
  2. Cellule sfida con TLR agonisti (2 mg / ml, Lipo-teichoic acido-TLR2 agonista; 10μg/ml, Poli (I: C)-TLR3 agonista; 1 mg / ml LPS-TLR4 agonista) per 6 ore a 37 ° C.
    Nota: I macrofagi trattati in condizioni simili sono state utilizzate per la co-coltura modello mobilitazione Ca 2 +.
  3. Aggiungere l'ossidazione sensibile colorante H 2 DCF-DA (Invitrogen) per ottenere una concentrazione finale di 10 micron di ECM (extracellulare medio: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO 3, 10 mM Na-HEPES, 4.7 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10mM glucosio e 2,0% destrano, pH 7,4, tutti ottenuti da Sigma) contenente il 2% BSA ai piatti e cellule incubare per 20 minuti prima visualizzazione al microscopio confocale.
  4. Dopo aver caricato colorante, visualizzare le cellule posto su un palcoscenico temperatura controllata di un adeguato sistema di imaging. Noi usiamo Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema di imaging confocale accoppiato con sorgente laser ad argon ionizzato ad una eccitazione di 488 nm per DCF fluorescenza con obiettivo 40x olio 13 (Fig. 1 A e D).
  5. Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ (1,44), il software liberamente disponibile presso il National Institutes of Health (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).

2. Visualizzazione di cellule J774 MROS nel

  1. Crescere J774.1 topo derivate da monociti macrofagi (10 6 cellule / ml) sul fondo di vetro da 35 mm piatti (Apparecchi di Harvard) per 48 h.
  2. Sfida le cellule con ligandi TLR per indurre la produzione MROS (2 mg / ml, Lipo-teichoic acido-TLR2; 10μg/ml, Poli (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) per 6 ore a 37 ° C.
  3. Aggiungi superossido mitocondriale indicatore MitoSOX Rosso (Invitrogen) per ottenere una concentrazione finale di 5 micron di ECM contenente il 2% BSA ai piatti e cellule incubare per 30 min a 37 ° C per consentire il caricamento di MitoSOX Rosso.
  4. Dopo aver caricato colorante, visualizzare le cellule su un palco a temperatura controllata di un obiettivo Carl Zeiss LSM 510 Meta paio sistema di imaging confocale con sorgente laser ad argon ionizzato ad una eccitazione di 561 nm per MitoSOX Red fluorescenza con obiettivo 40x olio (Fig. 1B ed E).
  5. Per gli esperimenti di controllo, dopo aver caricato colorante aggiungere PBS o DMSO (controllo negativo) o antimicina 2μM A (come superossido mitocondriale generatore-positivo di controllo) per le cellule prima immagine del campione, come descritto in 2.4 (Fig. 1C).
  6. Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ (1,44).

3. Visualizatisu di citosolica ROS in stabile Hyper-cito MPMVECs

  1. Noi usiamo pHyPer-cito (Evrogen) un mammifero codifica vettore di espressione Hyper sensore fluorescente che localizza nel citoplasma e in particolare la concentrazione sensi submicromolar di H 2 O 2 14.
  2. Trasfettare murini polmonare delle cellule endoteliali microvascolari (MPMVECs) con pHyPer-cito vettore utilizzando elettroporazione o reagenti di trasfezione. Noi utilizziamo 10 x 10 6 cellule e trasfezione con 10μg di pHyPer-cito tramite elettroporazione utilizzando BioRad Gene pulser sistema elettroporatore (250V, 500 uF). MPMVECs cultura nel medio DMEM supplementato con 10% FBS, aminoacidi non essenziali, supplemento di crescita endoteliale e antibiotici.
    Nota: Dopo la trasfezione, le cellule piastra a bassa densità per facilitare la crescita della colonia.
  3. Sostituire media con terreno di coltura completo integrato con 500 mg / ml di G418, 48 ore dopo la trasfezione. Schermo di cloni che hanno più alta percentuale di H yPer cellule positive e passaggio cloni Hyper positivo per aumentare il numero di Hyper cellule positive (Fig. 2).
    Nota: utilizzare la diluizione seriale di cellule per la selezione clonale delle singole cellule e schermo per le cellule che esprimono Hyper altamente stabile.
  4. Crescita stabile Hyper-cito MPMVECs il 0,2% coprioggetto gelatina rivestito (80 confluenza%). Prossima sfida cellule giornata con ligandi TLR (2 mg / ml, acido-TLR2 lipoteichoic; 10μg/ml, Poli (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) per 6 ore a 37 ° C. Cellule non trattate servire come controllo.
  5. Dopo il trattamento, montare il coprioggetto sul Attofluor cellule in camera (Invitrogen). Aggiungere 1 ml di pre riscaldato soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) alla camera e posizionare la camera su un palcoscenico temperatura controllata di Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema di imaging confocale. Visualizzare e fluorescenza cambiare immagine ad una eccitazione di 488 nm, usando obiettivo 40x olio (Fig. 3A e D).
  6. Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ (1,44) (vedi paragrafo 6).
DENOMINAZIONE "> 4. Visualizzazione mitocondriale di ROS in stabile Hyper-dMito MPMVECs

  1. Noi usiamo pHyPer-dMito (Evrogen) un mammifero vettore di espressione codifica mitocondri mirati Hyper che localizza nella concentrazione sensi submicromolar mitocondri e in particolare di H 2 O 2.
  2. MPMVECs trasfezione con pHyPer-dMito e generare stabile Hyper-dMito MPMVECs seguenti passaggi descritti nella sezione 3,2-3,3.
  3. Crescita stabile Hyper-dMito MPMVECs il 0,2% coprioggetto gelatina rivestito (80 confluenza%).
  4. Prossima sfida cellule giornata con ligandi TLR (2 mg / ml, acido-TLR2 lipoteichoic; 10μg/ml, Poli (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) per 6 ore a 37 ° C. Cellule non trattate servono come controllo negativo. Aggiungi antimicina 2μM Un campione (superossido mitocondriale induttore-positivo di controllo) prima visualizzazione.
  5. Dopo il trattamento, montare il coprioggetto sul Attofluor cellule in camera (Invitrogen). Aggiungere 1 ml di pre-riscaldato soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) alla camerae posizionare la camera su un palcoscenico temperatura controllata di Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema di imaging confocale. Visualizzare e cambiare l'immagine di fluorescenza a un'eccitazione di 488 nm, usando obiettivo 40x olio (Fig. 3B, C ed E).
  6. Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ (1,44) (vedi paragrafo 6).

5. Co-coltura modello per la visualizzazione di paracrini derivati ​​ROS innescato Ca 2 + di segnalazione nelle cellule endoteliali

Per la visualizzazione e la misurazione del [Ca 2 +] i cambiamenti usiamo un Ca 2 + colorante fluorescente sensibile fluo-4 AM (Invitrogen).

  1. Crescere MPMVECs sul 0,2% di gelatina coprioggetto lastre di vetro 25 millimetri (80 confluenza%).
  2. Incubare le cellule coltivate su vetrini a temperatura ambiente per 30 minuti in ECM contenente il 2% BSA e acido Pluronic 0,003% con 5 mM fluo-4 AM (Invitrogen) concentrazione finale per consentire il caricamento di fluo-4 AM. Dopo il caricamento, lavare le cellule con soluzione di imaging sperimentale (ECM contenente 0.25% BSA) contenente sulfinpirazone per minimizzare la perdita colorante.
  3. Dopo aver caricato fluo-4, montare coprioggetto sul Attofluor cellule in camera (Invitrogen). Aggiungere 800μl di pre riscaldato soluzione sperimentale di imaging per la camera e metterla su un palco a temperatura controllata di Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema di imaging confocale.
  4. In un'etichetta tubo separare i macrofagi attivati ​​nonactivated o isolate sia da wild-type o gp91 phox-/ - mice (trattati con LPS per 6 ore) con cella inseguitore rosso CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) in ECM contenente il 2% BSA e l'acido Pluronic 0,003%. Lavare e risospendere le cellule con 200μl di soluzione di imaging sperimentale.
  5. Aggiungi macrofagi etichettati a fluo-4:00 caricato MPMVECs nell'assemblea camera.
  6. Registrare la fluorescenza verde e rosso ogni 3 secondi per 10-20 min con Carl Zeiss LSM510 Meta sistema di imaging confocale con una sorgente laser ad argon ionizzato con eccitazione a 488 e 561 nm per fluo-4 AM e cellula inseguitore fluorescenza rossa respectively (Fig.4 AC).
    Nota: in alternativa, J774.1 linea cellulare potrebbe essere usata per suscitare MPMVECs Ca 2 + mobilitazione.
  7. Analizzare fluo-4 cambia intensità di fluorescenza utilizzando il software ImageJ (1,44) (vedere paragrafo 6).

6. Analisi dei dati utilizzando il software ImageJ

Trasferire le immagini ottenute dal sistema confocale come. LSM formato file per l'analisi dei dati. ZEN 2009 e 2010 ZEN software fornito con LSM 510 Meta microscopio confocale LSM 710 o microscopio confocale multiphoton salva rispettivamente i file in formato. LSM. Si consiglia di utilizzare questo natale. Lsm file per l'analisi dell'immagine come qualità originale viene mantenuto. Questo formato di file possono essere aperti direttamente in immagine Immagine analisi J. programma I passi che seguono forniscono un esempio di analisi quantitativa singola immagine. Nessun plugin aggiuntivi sono necessari per questo l'analisi dei dati.

  1. Aperto. Lsm o file. TIFF in programma Image J utilizzando File> Apri
  2. Fare clic sulla scheda IMAGE> COLOR> CANALI SPLIT e dividere i canali verde e DIC. Utilizzare l'immagine dal canale verde per successive analisi.
  3. Fare doppio clic e selezionare la 'selezione ellittica "scheda pennello e impostare il valore del pixel a 20.
  4. Per Hyper-cito le immagini, cliccare su una singola cella per definire l'area circolare di misura. Quindi premere il tasto "M" per misurare l'intensità della zona selezionata. I valori vengono conservati in una nuova finestra dei risultati.
  5. Avanti tenendo cliccare su "Shift" in una cella diversa per selezionare un'altra area, seguito premendo il tasto "M". L'intensità è registrato nella finestra dei risultati. Ripetere i passaggi 4-5 a 50 cellule diverse.
  6. Per Hyper d-mito immagini, impostare il valore del pixel a 10 nella selezione pennello ellittica. Regione di interesse (ROI) deve essere manualmente tracciata tra i mitocondri delle cellule particolari.
  7. Utilizzando freehand, traccia la regione di circa mitocondri e quindi premere "M". Ripetere i passaggi 6-7 su 50 cellule diverse.
  8. Copiare il me uno dei valori dalla finestra dei risultati e pasta in un foglio Excel o qualsiasi altro software per tracciare i risultati. Noi usiamo sia SigmaPlot o PRISM GraphPad per tracciare i dati come grafico.

7. Rappresentante Risultati

La figura 1 mostra citosolica e mitocondriale produzione di ROS su sfida con ligandi TLR. Rappresentante immagini confocale mostrano aumento del DCF (citosolica) e MitoSOX Rosso (mitocondri) a fluorescenza, dopo 6 ore di stimolazione. Cambiamenti fluorescenza sono stati normalizzati ed espressi come fold change.

La figura 2 mostra la generazione di stabili Hyper-cito e iper-dMito cellule endoteliali. Topo cellule endoteliali sono state trasfettate con pHyPer-cito o pHyPer-dMito costruisce plasmide tramite elettroporazione. Plasmidi cellule che esprimono stabilmente sono stati selezionati con G418 per due settimane. Dopo la selezione, le cellule sono state seminate diluito in 96 pozzetti. Singole colonie sono stati isolati e ripreso per l'espressione omogenea.

e_content "> La figura 3 mostra la misura della endoteliale citosolica e mitocondriale H 2 O 2 livelli. rappresentante immagini confocale mostrano aumento di Hyper-cito (citosolica) e Hyper-dMito (mitocondri) a fluorescenza, dopo 6 ore di stimolazione. variazioni di intensità di fluorescenza sono stati normalizzati ed espressi come fold change.

La figura 4 mostra la valutazione dei macrofagi derivati ​​ROS endoteliali citosolico indotto mobilitazione Ca 2 +. LPS-stimolato macrofagi sono stati aggiunti sul microcircolo polmonare delle cellule endoteliali (PMVEC) che era stato precedentemente caricato con il intracellulare di Ca 2 + ([Ca 2 +] i) indicatore colorante Fluo-4. Applicazione di tipo selvaggio LPS-macrofagi attivati ​​evocato un [Ca 2 +] i PMVECs aumento che è stato attenuato per KO di NADPH ossidasi funzionale (gp91 phox-/ -).

Figura 1
Figura 1. Visualizatisul cellulare di macrofagi generato ROS e superossido mitocondriale. J774.1 cellule si sono sfidati con leganti TLR2, 3 e 4 (2 mg / ml, acido-TLR2 lipoteichoic; 10μg/ml, Poli (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4). Per 6 ore a 37 ° C. Dopo il trattamento le cellule sono stati caricati con (A) cellulare ROS indicatore (H 2 DCF-DA; fluorescenza verde) o (B) Indicatore superossido mitocondriale (MitoSOX Rosso; fluorescenza rossa). (C) antimicina A è stato utilizzato come controllo positivo per la produzione mitocondriale di ROS. Variazioni di intensità di fluorescenza sono stati valutati usando la microscopia confocale. (D) e (E) La determinazione quantitativa di variazione media fluorescenza.

Figura 2
Figura 2. Rappresentazione schematica di generare l'espressione stabile di citosolica delle cellule endoteliali e indicatori ROS mitocondriali.

Figura 3
Figura 3. V. isualization di endoteliali citosolica e mitocondriale H 2 O 2 livelli MPMVECs esprimono stabilmente (A) di Hyper-cito o (B) di Hyper-dMito si sono sfidati con leganti TLR2, 3 e 4 (2 mg / ml, acido-TLR2 lipoteichoic; 10μg / ml, Poli (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) per 6 ore a 37 ° C. (C) antimicina A è stato utilizzato come controllo positivo per la produzione mitocondriale di ROS. Dopo il trattamento, i cambiamenti intensità di fluorescenza sono stati valutati usando la microscopia confocale. (D) e (E) La determinazione quantitativa di variazione media fluorescenza.

Figura 4
Figura 4. Macrofagi derivati ​​ROS suscitare alterata delle cellule endoteliali Ca 2 + mobilitazione. (A) Rappresentazione schematica delle cellule endoteliali / macrofagi di co-coltura studio del modello. (B), macrofagi murini appena isolate sia da topi WT e gp91phox null (The Jackson Laboratory) sono stati attivati ​​da 1 mg / ml LPS per 6 ore Macrophages sono stati etichettati con cellule-tracker Red (rosso) e adattata Fluo-4 PMVECs caricato (verde) per valutare paracrino O 2 • -. segnalazione (C) LPS-activated macrofagi isolati da topi WT innescato ampie e rapide mobilitazione Ca 2 + in PMVECs rispetto ai macrofagi da topi nulli gp91phox. Validazione di attivazione dei macrofagi è stato dimostrato in precedenza.

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Discussion

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Il metodo qui descritto consente di misurare rapidamente e quantitativa delle specie reattive dell'ossigeno nelle cellule viventi sia utilizzando coloranti ossidazione sensibili o sensori plasmide. Agonisti dei TLR (Toll-like receptors) sono composti che stimolano le cellule attraverso il TLR presenti sulla superficie cellulare e attivare le vie di segnalazione a valle 15. Nel nostro protocollo, abbiamo utilizzato tre diversi cioè TLR agonisti, Lipo-teichoic acido-TLR2 agonista, Poli (I: C). TLR3-agonista; LPS-TLR4 agonista che sono riportati di indurre ROS come sistema modello per dimostrare la misura ROS . Misurazione del ROS con colorante sensibile ossidanti è rapido e può essere utilizzato per misurare la varietà di specie ROS. L'uso di plasmide Hyper sensore basato rileva selettivamente H 2 O 2 livelli. H 2 O 2 è ossidante più stabile e anche l'uso di Hyper cito e Hyper-dMito in un ambiente stabile cellula aggiunge il vantaggio rispetto ai foto-autooxidation di ROS coloranti fluorescenti sensibili.Hyper non causa artefatta generazione di ROS e può essere utilizzato per la rilevazione di cambiamenti veloci di H 2 O 2 concentrazione in compartimenti cellulari diversi in varie condizioni fisiologiche e patologiche. Cellule che esprimono stabilmente i sensori Hyper vengono utilizzati per la selezione clonale della popolazione che offre misurazioni più affidabili e precise di H 2 O 2 livelli. È importante sottolineare che questo metodo descrive anche la rilevazione e la misura quantitativa di Ca 2 + mobilitazione in cellule vive innescato da paracrino ROS derivate dalle cellule vicine, come cellule del sistema immunitario innato. Questa procedura sperimentale in combinazione con la microscopia confocale può essere molto utile per rivelare importanti variazioni spazio-temporale degli eventi di trasduzione del segnale delle cellule specialmente nei casi in cui sono coinvolti due tipi di cellule diverse. Anche se, gli esperimenti di rappresentanza dettagliato in questo articolo sono solo un esempio del tipo di interazione studiata, questa tecnica può essere facilmente undapted per studiare le interazioni cellulari tra più tipi di cellule vive.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di sovvenzione (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) a MM. Il nostro articolo è in parte supportato da Carl Zeiss Microimaging LLC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor cell chamber Invitrogen A7816
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
DMEM low glucose medium Invitrogen 10567-014
Endothelial growth factor supplement (ECGS) Upstate, Millipore 02-102
Fetal Bovine Serum Invitrogen 12662011
G418 Invitrogen 10131-027
Gelatin Sigma-Aldrich G1393
H2DCFDA Invitrogen D-399
LPS Sigma-Aldrich L4516
LTA Sigma-Aldrich L2515
MitoSOX Red Invitrogen M36008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Invitrogen 51985091
Pen/Strep (10x) Invitrogen 15140163
pHyPer-cyto Evrogen FP941
pHyPer-dMito Evrogen FP942
Poly(I:C) Sigma-Aldrich P0913
Prism software 5.0 GraphPad Software Inc.
SigmaPlot 11.0 Systat software, Inc.
Trypsin-EDTA (10x) Invitrogen 15400054
T-25 Flasks Corning 430639
T-75 Flasks BD Biosciences 353136
96-well TC micro well plate BD Biosciences 353072
Zen 2009 software Carl Zeiss, Inc.

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References

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Mallilankaraman, K., Gandhirajan, R. K., Hawkins, B. J., Madesh, M. Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS. J. Vis. Exp. (58), e3511, doi:10.3791/3511 (2011).More

Mallilankaraman, K., Gandhirajan, R. K., Hawkins, B. J., Madesh, M. Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS. J. Vis. Exp. (58), e3511, doi:10.3791/3511 (2011).

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