Summary
Эффективный способ получить представление о визуализации паракринной полученных АФК индукцию эндотелиальной Ca2 + сигнализация описано. Этот метод использует измерения паракринной производных АФК вызвало мобилизацию Са 2 + в сосудистых эндотелиальных клеток в культуре со-модели.
Abstract
Окислительный стресс был замешан в целом ряде патологических состояний, в том числе при ишемии / реперфузионного повреждения и сепсис. Концепция окислительного стресса относится к аберрантных образования АФК (активные формы кислорода), которые включают O 2 • -, Н 2 О 2, и гидроксильные радикалы. Активные формы кислорода влияет множество клеточных процессов, включая передачу сигналов, клеточной пролиферации и гибели клеток 1-6. АФК имеют потенциал для повреждения сосудов и клеток непосредственно органом, и может инициировать вторичных химических реакций и генетических изменений, которые в конечном итоге привести к усилению начальной РОС-опосредованного повреждения тканей. Ключевым компонентом усиления каскад, который усиливает необратимое повреждение ткани найма и активации циркулирующих воспалительных клеток. Во время воспаления, воспалительные клетки вырабатывают цитокины, такие как фактор некроза опухоли-α (ФНО) и ИЛ-1, чтоактивации эндотелиальных клеток (ЭК) и эпителиальных клеток и дальнейшего расширения воспалительного ответа 7. Сосудистой дисфункции эндотелия является признанным особенностью острого воспаления. Макрофаги способствуют дисфункции эндотелия при воспалении с помощью механизмов, остаются неясными. Активация макрофагов приводит к внеклеточной выпуск O 2 • - и различных провоспалительных цитокинов, который вызывает патологические сигнализации в соседние ячейки 8. NADPH оксидазы являются основным и главным источником АФК в большинстве типов клеток. В последнее время показано нами и другими 9,10, что АФК производства NADPH оксидазы вызвать митохондриальную производства АФК в течение многих патофизиологических условиях. Поэтому измерения митохондриальной производства АФК не менее важно в дополнение к оценке цитозольного АФК. Макрофаги производства АФК по NADPH флавопротеидом фермент который играет главную роль в воспалении. После активации,фагоцитарной NADPH оксидазы производит обильное количество O 2 • - которые имеют важное значение в механизме защиты организма 11,12. Хотя паракринной производных O 2 • - играет важную роль в патогенезе сосудистых заболеваний, визуализация паракринной РОС-индуцированных внутриклеточных сигнальных том числе Са 2 + мобилизации до сих пор гипотезы. Мы разработали модель, в которой активированными макрофагами используются в качестве источника O 2 • - для трансдукции сигнала на соседние эндотелиальные клетки. Используя эту модель, мы показываем, что макрофаг происхождения O 2 • - привести к кальциевой сигнализации в соседних эндотелиальных клеток.
Protocol
Активные формы кислорода могут быть измерены в живых клеток с использованием окисления чувствительных красителей (1 & 2) или с помощью плазмиды датчиков (3 и 4) с помощью конфокальной микроскопии.
1. Визуализация цитозольного АФК в клетках J774
- Расти J774.1 мыши моноцитарных макрофагов (10 6 клеток / мл) по стеклянным дном 35-мм блюда (Harvard аппарата) в течение 48 ч.
- Вызов клеток с TLR агонисты (2 мкг / мл, Lipo-тейхоевые кислотно-TLR2 агонист; 10μg/ml, поли (I: C)-TLR3 агонист; 1 мкг / мл LPS-TLR4 агонист) в течение 6 ч при температуре 37 ° C.
Примечание: Макрофаги рассматриваться в аналогичных условиях были использованы для совместной культуре модель Са 2 + мобилизации. - Добавить окислительно-чувствительных красителя H 2 DCF-DA (Invitrogen), чтобы дать конечной концентрации 10 мкМ в ECM (внеклеточной средой: 121 мМ NaCl, 5 мМ NaHCO 3, 10 мМ Na-HEPES, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ KH 2 PO 4, 1,2 мМ MgSO 4, 2 мМ CaCl 2, 10мМ глюкозы и 2,0% декстрана, рН 7,4; все полученные от Sigma), содержащий 2% BSA в блюда и инкубировать клетки в течение 20 мин до визуализации в конфокальной микроскопии.
- После загрузки красителя, визуализировать клетки размещены на контролируемой температурой этапе соответствующей системы визуализации. Мы используем Carl Zeiss LSM 510 Мета конфокальной системы визуализации в сочетании с аргоном лазерного ионного источника при возбуждении 488 нм для DCF флуоресценции с помощью 40x цель нефти 13 (рис. 1А и D).
- Анализ изображений с помощью программного обеспечения ImageJ (1,44), свободно доступного программного обеспечения из Национального института здоровья (Rasband, WS, ImageJ, американского Национального института здравоохранения, Bethesda, штат Мэриленд, США, http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).
2. Визуализация mROS в клетки J774
- Расти J774.1 мыши моноцитарных макрофагов (10 6 клеток / мл) по стеклянным дном 35-мм блюда (Harvard аппарата) в течение 48 ч.
- Вызов клеток с лигандами TLR, чтобы побудить mROS производства (2 мкг / мл, Lipo-тейхоевые кислотно-TLR2; 10μg/ml, поли (I: C)-TLR3; 1 мкг / мл LPS-TLR4) в течение 6 ч при 37 ° C.
- Добавить митохондриального супероксида индикатор MitoSOX Красный (Invitrogen), чтобы дать конечной концентрации 5 мкМ в ECM, содержащий 2% BSA в блюда и инкубировать клетки в течение 30 мин при 37 ° С, чтобы загрузка MitoSOX Red.
- После красителя загрузки, визуализации клеток на контролируемой температурой этапе Carl Zeiss LSM 510 Мета конфокальной микроскопии системы пара с аргонового ионного лазера источник в возбуждении 561 нм для MitoSOX Красной флуоресценции с помощью 40x цель масла (рис 1B и Е).
- Для контрольных опытов, после загрузки добавить краситель PBS или ДМСО (отрицательный контроль) или 2 мкм антимицином (как митохондриальной супероксид-генератор-положительный контроль) в клетки до изображения образца, как это описано в п. 2.4 (рис. 1в).
- Анализ изображений с помощью программного обеспечения ImageJ (1,44).
3. Visualizatiна из цитозольного АФК в стабильных Hyper-цито MPMVECs
- Мы используем pHyPer-цито (Евроген) млекопитающих кодирования вектор экспрессии флуоресцентных Hyper датчик, который локализуется в цитоплазме и, в частности чувств submicromolar концентрация H 2 O 2 14.
- Трансфекции мышей легких микрососудистой эндотелиальных клеток (MPMVECs) с pHyPer-цито вектор с использованием либо электропорации или трансфекции реагентов. Мы используем 10 х 10 6 клеток и трансфекции с 10 мкг pHyPer-цито через электропорации использованием BioRad Гена генератора electroporator системы (250, 500 мкФ). Культура MPMVECs в среде DMEM с добавлением 10% FBS, заменимые аминокислоты, эндотелиальные дополнения роста и антибиотиков.
Примечание: В соответствии трансфекции, плиты клетки при низкой плотности для облегчения роста колоний. - Замените среду с полной культуральной среде дополнена 500 мкг / мл G418, через 48 часов после трансфекции. Экран для клонов, которые имеют самый высокий процент H yPer положительных клеток и прохождение Hyper положительных клонов, чтобы увеличить количество Hyper-положительных клеток (рис. 2).
Примечание: Мы используем серийные разведения клеток для клональной селекции отдельных клеток и экран для стабильной клетки высоко выражения Hyper. - Расти стабильной Hyper-цито MPMVECs на 0,2% желатин покрытием покровные (80% слияния). На следующий день вызов клеток с лигандами TLR (2 мкг / мл, липотейхоевый кислотно-TLR2; 10μg/ml, поли (I: C)-TLR3; 1 мкг / мл LPS-TLR4) в течение 6 ч при 37 ° C. Необработанные клетки служат в качестве контроля.
- После лечения, смонтировать на покровные Attofluor ячейке камеры (Invitrogen). Добавить 1 мл предварительно нагревается Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS), чтобы камера и место камеры на контролируемой температурой этапе Carl Zeiss LSM 510 Мета система конфокальной микроскопии. Наглядное представление и изображение флуоресценции изменения на возбуждение 488 нм, используя 40х цель нефти (рис. 3А и D).
- Анализ изображений с помощью программного обеспечения ImageJ (1.44) (см. раздел 6).
- Мы используем pHyPer-dMito (Евроген) млекопитающих выражением вектора, кодирующего митохондрий ориентированных Hyper что локализуется в митохондриях и, в частности чувств submicromolar концентрация H 2 O 2.
- Трансфекции MPMVECs с pHyPer-dMito и генерировать стабильные Hyper-dMito MPMVECs следующие шаги, описанные в разделе 3.2-3.3.
- Расти стабильной Hyper-dMito MPMVECs на 0,2% желатин покрытием покровные (80% слияния).
- На следующий день вызов клеток с лигандами TLR (2 мкг / мл, липотейхоевый кислотно-TLR2; 10μg/ml, поли (I: C)-TLR3; 1 мкг / мл LPS-TLR4) в течение 6 ч при 37 ° C. Необработанные клетки служат в качестве отрицательного контроля. Добавить 2 мкм антимицином (митохондриального супероксида индуктор-положительный контроль) до визуализации образца.
- После лечения, смонтировать на покровные Attofluor ячейке камеры (Invitrogen). Добавить 1 мл подогретого Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS), чтобы камераи разместить камеры на контролируемой температурой этапе Carl Zeiss LSM 510 Мета системы визуализации конфокальной. Наглядное представление и изображение флуоресценции изменения на возбуждение 488 нм, используя 40х цель нефти (рис. 3В, С и Е).
- Анализ изображений с помощью программного обеспечения ImageJ (1.44) (см. раздел 6).
5. Сотрудничество культуры модели для визуализации паракринной полученных АФК вызвало Са 2 + сигнализации в эндотелиальных клетках
Для визуализации и измерения [Ca 2 +] я изменениях мы используем Са 2 + чувствительны флуоресцентного красителя флуоресценции-4 AM (Invitrogen).
- Расти MPMVECs на 0,2% желатин покрытием 25 мм покровные стекла (80% слияния).
- Инкубируйте клетки, выращенные на покровных при комнатной температуре в течение 30 мин в ECM, содержащий 2% BSA и 0,003% плуроник кислоты с 5 мкМ флуоресцентных-4 AM (Invitrogen) конечная концентрация разрешить загрузку флуоресцен-4 утра. После загрузки, мыть клетки с экспериментального решения томографии (ECM, содержащий 0.25% BSA), содержащий сульфинпиразон, чтобы минимизировать потери красителя.
- После загрузки флуоресцентных-4, крепление на покровные Attofluor ячейке камеры (Invitrogen). Добавить 800μl предварительно нагревается экспериментального решения визуализации для камеры и разместить его на контролируемой температурой этапе Carl Zeiss LSM 510 Мета системы визуализации конфокальной.
- В отдельной этикетке трубки неактивированной или активированными макрофагами изолированы от любого дикого типа или gp91 phox-/ - мышей (обработанные LPS в течение 6 ч) с клеточными трекера красной CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) в ECM, содержащий 2% BSA и 0,003% плуроник кислоты. Вымойте и ресуспендирования клеток с 200 мкл экспериментального решения визуализации.
- Добавить помечены макрофагов к флуоресцен-4 утра загружены MPMVECs в камере сборки.
- Запись зеленый и красный флуоресценции каждые 3 сек в течение 10-20 мин с использованием Carl Zeiss LSM510 Мета конфокальной микроскопии система с лазерным источником ионов аргона при возбуждении на 488 и 561 нм для флуоресцентных-4 утра и клетка трекера красной флуоресценции respectivelу (рис.4 переменного тока).
Примечание: Кроме того, J774.1 клеточная линия может быть использована для выявления MPMVECs Са 2 + мобилизации. - Анализ флуоресценции-4 изменений интенсивности флуоресценции использованием ImageJ программного обеспечения (1.44) (см. раздел 6).
6. Данные анализа с использованием программного обеспечения ImageJ
Передача изображений, полученных с конфокальной системы. LSM формат файлов для анализа данных. ZEN ZEN 2009 и 2010 программное обеспечение, поставляемое с LSM 510 Мета конфокальной микроскопии или LSM 710 многофотонной конфокальной микроскопии соответственно сохраняет файлы в формате. LSM формате. Мы рекомендуем использовать этот родной. LSM файлы для анализа изображения, как исходное качество сохраняется. Этот формат может быть напрямую открыт в программе анализа изображения Изображение J. следующие шаги представляют собой пример количественного анализа одного изображения. Никакие дополнительные плагины, необходимые для анализа данные.
- Открыть. LSM или. TIFF файлы в изображения J программы с помощью File> Open
- Перейдите на вкладку ИЗОБРАЖЕНИЕ> COLOR> КАНАЛЫ SPLIT и разделить зеленый и DIC каналов. Используйте изображения из зеленого канала для последующего анализа.
- Двойной клик и выберите "Эллиптический кисти выбор" вкладки и установите значение пиксела до 20.
- Для Hyper-цито изображения, нажмите на одну ячейку для определения площади круга измерений. Затем нажмите кнопку "M" для измерения интенсивности выбранной области. Значения сохраняются в новом окне результатов.
- Следующая, удерживая клавишу "Shift" ключ нажать на другую ячейку, чтобы выбрать другую область, а затем, нажав кнопку "M" ключ. Интенсивность записывается в окне результатов. Повторите шаги 4-5 на 50 различных клеток.
- Для Hyper г-мито изображения, установите значение пиксела до 10 в овальное выделение кистью. Регион интереса (ROI) должно быть вручную прослеживается в том числе митохондрии частности клеток.
- Использование руки, следом область вокруг митохондрий, а затем нажмите кнопку "М". Повторите шаги 6-7 на 50 различных клеток.
- Скопируйте меня значения из результатов окна и вставить в лист Excel или любое программное обеспечение для построения результаты. Мы используем либо SigmaPlot или GraphPad PRISM для построения данных граф.
7. Представитель Результаты
На рисунке 1 показана цитозольного и митохондриальных АФК на вызов с TLR лигандами. Представитель конфокальной изображения показывают увеличение DCF (цитозольного) и MitoSOX Красный (митохондрии) флуоресценции после 6 часов стимуляции. Флуоресценция изменения были нормализованы и выражается в раз измениться.
На рисунке 2 показан поколения стабильной Hyper-цито и Hyper-dMito эндотелиальных клеток. Мышь эндотелиальные клетки трансфицированных pHyPer-цито или pHyPer-dMito плазмиды конструкций с помощью электропорации. Клетки стабильно выражения плазмиды были отобраны с G418 в течение двух недель. После выбора, разбавленный клетки высевали в 96-луночных. Индивидуальные колоний были выделены и отображаемого для однородных выражения.
e_content "> На рисунке 3 показано измерение эндотелиальных цитозольного и митохондриальной Н 2 О 2 уровня. представителю конфокальной изображения показывают увеличение Hyper-цито (цитозольного) и Hyper-dMito (митохондрии) флуоресценции после 6 часов стимуляции. изменений интенсивности флуоресценции были нормализованы и выражается в раз измениться.На рисунке 4 показана оценка макрофагов полученных АФК индуцированной эндотелиальной цитозольного Са 2 + мобилизации. ЛПС-стимулированной макрофаги были добавлены на легочные клетки эндотелия микрососудов (PMVEC), которые были ранее загружены внутриклеточного Са 2 + ([Ca 2 +] я) индикатор красителя Fluo-4. Применение дикого типа LPS-активированными макрофагами вызывали [Ca 2 +] я ростом PMVECs, который был ослабленный нокаутом функциональных НАДФН-оксидазы (gp91 phox-/ -).
Рисунок 1. Visualizatiна макрофагов порожденных сотовой АФК и митохондриального супероксида. J774.1 клетки сталкиваются с проблемой TLR2, 3 и 4 лигандами (2 мкг / мл, липотейхоевый кислотно-TLR2; 10μg/ml, поли (I: C)-TLR3; 1 мкг / мл LPS-TLR4). Течение 6 ч при 37 ° C. После обработки клетки были загружены () сотовой АФК индикатор (H 2 DCF-DA, зеленая флуоресценция) или (В) митохондриального супероксида индикатор (красный MitoSOX; красной флуоресценции). (C) антимицином был использован в качестве положительного контроля для митохондриальных производство АФК. Изменений интенсивности флуоресценции оценивались с помощью конфокальной микроскопии. (D) и (Е) Количественный средней флуоресценции изменения.
Рисунок 2. Схематическое изображение генерации стабильная экспрессия эндотелиальных клеток и цитозольного митохондриальной показатели АФК.
Рисунок 3. V. isualization эндотелиальных цитозольного и митохондриальной Н 2 О 2 уровня MPMVECs стабильно, выражающие () Hyper-цито или (В) Hyper-dMito были оспорены с TLR2, 3 и 4 лигандами (2 мкг / мл, липотейхоевый кислотно-TLR2; 10 мкг / мл, Поли (I: C)-TLR3; 1 мкг / мл LPS-TLR4) в течение 6 ч при 37 ° C. (C) антимицином был использован в качестве положительного контроля для митохондриальных производство АФК. После лечения изменений интенсивности флуоресценции оценивались с помощью конфокальной микроскопии. (D) и (Е) Количественный средней флуоресценции изменения.
Рисунок 4. Макрофаги полученных АФК вызывают нарушение эндотелиальных клеток Са 2 + мобилизации. (А) Схематическое изображение эндотелиальных клеток / макрофагов совместно культуре модель исследования. (B) свежевыделенных мышиных макрофагов с обеих WT и gp91phox нулевых мышей (Jackson Laboratory) были активированы до 1 мкг / мл LPS в течение 6 ч. Macrophages были помечены ячейки-трекер Red (красный) и добавил на Fluo-4 загружаются PMVECs (зеленый) для оценки паракринной O 2 • -. сигнализации (C) LPS-активированными макрофагами изолированы от WT мышей вызвало большие и быстрые Са 2 + мобилизацию В PMVECs по сравнению с макрофагами мышей gp91phox пустым. Подтверждение активации макрофагов была продемонстрирована ранее.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь метод позволяет быстро и количественного измерения активных форм кислорода в живых клетках, либо с помощью окисления чувствительных красителей или плазмиды датчиков. Агонисты TLRs (звонок-подобных рецепторов) являются соединениями, которые стимулируют клетки через TLRs присутствует на поверхности клеток и вызывают сигнальные пути вниз по течению 15. В нашем протоколе, мы использовали три различных TLR агонисты а именно, Lipo-тейхоевые кислотно-TLR2 агонист; поли (I: C). TLR3-агонистов; LPS-TLR4 агонист которые, по сообщениям АФК вызывают в качестве модельной системы для демонстрации АФК измерения . Измерение АФК использованием окислителей чувствительной краситель быстро и может быть использован для измерения различных видов АФК. Использование плазмиды основаны Hyper датчик обнаруживает выборочно H 2 O 2 уровня. H 2 O 2 является более стабильным окислителем, а также использование технологии Hyper цито и Hyper-dMito в стабильной настройки ячейки добавляет преимущество перед фото-автоокисления АФК чувствительные флуоресцентные красители.Hyper не вызывает искусственной поколение ROS и может быть использован для обнаружения быстрых изменений H 2 O 2 концентрация в разных отсеках клетки в различных физиологических и патологических состояниях. Клетки стабильно выражения Hyper датчики используются для клональной селекции населения, которая предлагает более надежные и точные измерения H 2 O 2 уровня. Важно отметить, что этот метод также описывает обнаружение и количественное измерение Са 2 + мобилизация в живых клетках вызвано паракринной производных АФК из соседней клетки, такие как врожденные иммунные клетки. Эта экспериментальная процедура в сочетании с конфокальной микроскопии может быть очень полезно выявить важные пространственно-временные изменения в клеточной сигнальной трансдукции события, особенно в случаях, когда два различных типа клеток участвуют. Впрочем, представитель экспериментов подробно описаны в этой статье, лишь один из примеров типа взаимодействия изучены, эта техника может быть легкоdapted для изучения межклеточных взаимодействий между несколькими прямыми типов клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья гранта (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) в ММ. Наша статья частично поддержана Carl Zeiss Microimaging LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 | |
| Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate, Millipore | 02-102 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 | |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| H2DCFDA | Invitrogen | D-399 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4516 | |
| LTA | Sigma-Aldrich | L2515 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 | |
| Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 | |
| pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 | |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 | |
| Poly(I:C) | Sigma-Aldrich | P0913 | |
| Prism software 5.0 | GraphPad Software Inc. | ||
| SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | ||
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 | |
| T-25 Flasks | Corning | 430639 | |
| T-75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| 96-well TC micro well plate | BD Biosciences | 353072 | |
| Zen 2009 software | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Madesh, M. Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis. J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 Forthcoming.
- Hawkins, B. J. S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis. J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).
- Madesh, M., Hajnoczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
- Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
- Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. Harmful molecular mechanisms in sepsis. Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).
- Sanlioglu, S. Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa. 276, 30188-30198 (2001).
- Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling. Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).
- Vliet, A. vander NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more. Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).
- Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent. J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).
- Lambeth, J. D. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).
- Mukhopadhyay, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
