Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Vasküler Ca Görselleştirme 2 + Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal

doi: 10.3791/3511 Published: December 21, 2011

Summary

Endotel Ca2 + sinyalizasyon parakrin türetilen ROS indüksiyon görüntülenmesi anlayışlar kazanmak için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, bir ko-kültür modeli vasküler endotelyal hücreler Ca2 + seferberlik tetikleyen parakrin elde edilen ROS ölçme yararlanır.

Abstract

Oksidatif stres, iskemi / reperfüzyon hasarı ve sepsis de dahil olmak üzere bir dizi patolojik durumların oluşmasında rol oynar. H 2 O 2 ve hidroksil radikalleri oksidatif stres kavramı O 2 ROS (reaktif oksijen türleri), anormal oluşumunu ifade eder . Reaktif oksijen türleri, sinyal iletimi, hücre proliferasyonu ve hücre ölümü 1-6 da dahil olmak üzere çok sayıda hücresel süreçleri etkiler. ROS doğrudan damar ve organ hücreleri hasar potansiyeline sahiptir ve sonuçta ilk ROS aracılı doku hasarının bir amplifikasyon sonucu ikincil kimyasal reaksiyonlar ve genetik değişiklikler başlatabilir. Geri dönüşümsüz doku hasarı exacerbates amplifikasyon kaskadın temel bileşeni dolaşımdaki inflamatuar hücreler işe alma ve aktivasyon. Inflamasyon sırasında, inflamatuar hücreler, tümör nekroz faktörü-α (TNF) ve IL-1 gibi sitokinler üretirendotel hücreleri (EC) ve epitel hücreleri aktif hale getirmek ve daha fazla inflamatuvar yanıt 7 arttırır. Vasküler endotel disfonksiyonu, akut inflamasyon kurulmuş bir özelliktir. Makrofajlar belirsizdir mekanizmaları tarafından inflamasyon sırasında endotel işlev bozukluğuna katkıda bulunur. • - komşu hücreler patolojik sinyalizasyon 8 tetikler ve çeşitli pro-inflamatuvar sitokinler, O 2 ekstraselüler sürümde makrofaj aktivasyonu sonuçları. NADPH oksidaz hücre tiplerinin çoğu ROS en önemli ve birincil kaynak. Son zamanlarda, biz ve diğerleri 9,10 tarafından NADPH oksidaz tarafından üretilen ROS mitokondriyal ROS üretimi sırasında birçok fizyopatolojik koşullardaki neden olduğu gösterilmiştir . Bu nedenle mitokondriyal ROS üretimi sitozolik ROS ölçmek için ek olarak ölçüm eşit derecede önemlidir. Makrofajlar inflamasyon birincil rol oynar flavoprotein NADPH oksidaz enzimi tarafından ROS üretir. Bir kez aktivefagositik NADPH oksidaz bol miktarda O 2 • üretir ana savunma mekanizması 11,12 önemlidir. Parakrin-kökenli O 2 rağmen - damar hastalıkları, Ca 2 de dahil olmak üzere parakrin ROS-kaynaklı hücre içi sinyal görselleştirme patogenezinde önemli bir rol oynar + seferberlik hala hipotezdir. - Biz, komşu endotel hücreleri için bir sinyal uyum sağlamak aktive makrofajlar, O 2 kaynağı • olarak kullanıldığı bir model geliştirdik. Komşu endotel hücreleri sinyal kalsiyum neden bu modeli kullanarak, makrofaj kaynaklı O 2 göstermektedir.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Reaktif oksijen türleri, canlı hücreleri oksidasyona duyarlı boyalar (1 & 2) kullanarak veya plazmid sensörleri (3 ve 4) konfokal mikroskobi kullanarak ölçülebilir.

1. J774 hücrelerinde sitozolik ROS Görselleştirme

  1. 48 saat 35 mm yemekleri (Harvard Apparatus) cam alt J774.1 fare monosit kökenli makrofajlar (10 6 hücre / ml) büyütün
  2. 6 saat 37 ° ° C.: TLR agonistleri (1 mcg / ml LPS-agonist TLR4; C)-TLR3 agonist 10μg/ml, Poli (2 mcg / ml, Lipo-teikoik asit-TLR2 agonist) ile meydan hücreleri
    Not: Makrofajlar benzer koşullar altında tedavi, ko-kültür modeli Ca 2 + seferberlik için kullanılmıştır .
  3. Oksidasyon boya H 2 DCF-DA (Invitrogen) ECM 10 mcM bir final konsantrasyonu (Ekstrasellüler orta vermek için duyarlı: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO 3, 10 mM Na-HEPES, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH ekle 2 PO 4, 1.2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10mM glukoz ve% 2.0 dekstran, pH 7.4 Sigma elde edilen)% 2 BSA görselleştirme konfokal mikroskobu altında 20 dakika önce yemekler ve inkübe hücreleri içeren.
  4. Boya yükledikten sonra, uygun bir görüntüleme sistemi, sıcaklık kontrollü bir sahne üzerine yerleştirilen hücrelerin görselleştirmek. DCF floresan 40x yağ hedefi 13 (Şekil 1A ve D) kullanarak 488 nm eksitasyon Argon iyon lazer kaynağı ile birleştiğinde, Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal görüntüleme sistemi kullanıyoruz.
  5. ImageJ yazılımı (1.44), Ulusal Sağlık Enstitüleri (Rasband, WS, ImageJ Sağlık, Bethesda, Maryland, ABD,, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri serbestçe mevcut yazılım kullanarak görüntüleri analiz http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).

2. J774 hücreleri mROS Görselleştirme

  1. 48 saat 35 mm yemekleri (Harvard Apparatus) cam alt J774.1 fare monosit kökenli makrofajlar (10 6 hücre / ml) büyütün
  2. MROS üretimine neden TLR ligandları ile hücreleri Challenge (2 mcg / ml, Lipo-teikoik asit-TLR2; 10μg/ml, Poli (I: C) TLR3; 1 mcg / ml LPS-TLR4) 6 saat 37 ° C.
  3. 5 mcM yemekleri ve inkübe hücreleri az 30 dakika süreyle 37 ° C izin ECM% 2 BSA içeren bir nihai konsantrasyonu vermek için mitokondriyal süperoksit göstergesi MitoSOX Kırmızı (Invitrogen) MitoSOX Red yükleniyor.
  4. Boya yükledikten sonra, hücreleri MitoSOX Red floresan 40x yağlı objektif (Şekil 1B ve E) kullanarak 561 nm uyarma Argon iyon lazer kaynağı ile Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal görüntüleme sistemi çift bir sıcaklık kontrollü sahne gözünüzde canlandırın.
  5. Kontrol deneyleri için, boya yükleme eklemek PBS veya DMSO (negatif kontrol) veya 2μM Antimycin sonra A (mitokondrial süperoksit olarak jeneratör pozitif kontrol) hücrelere örnek görüntü 2.4 (Şekil 1C) açıklandığı gibi önce.
  6. ImageJ yazılımı (1.44) kullanarak görüntüleri analiz edin.

3. Visualizatiistikrarlı Hyper-sito MPMVECs sitozolik ROS

  1. Biz pHyPer-sito (Evrogen) bir memeli ifade vektör kodlama sitoplazma ve H 2 O 2 14 özel duyular submicromolar konsantrasyon lokalize bir floresan sensörü Hyper kullanın.
  2. PHyPer-sito elektroporasyon veya transfeksiyon reaktifler kullanarak vektör ile Transfect murin Pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri (MPMVECs). Biz BioRad Gene üreteci Elektroporatör sistemi 250V) (500 μF kullanarak elektroporasyon ile pHyPer-sito 10μg ile 10 x 10 6 hücre ve transfect kullanın. DMEM orta Kültür MPMVECs% 10 FBS, aminoasitlerin, endotelyal büyüme ek ve antibiyotikler ile desteklenmiş.
    Not: Aşağıda transfeksiyon, koloni gelişimini kolaylaştırmak için düşük yoğunluklu plaka hücreleri.
  3. 500 mg / ml G418, 48 saat sonra transfeksiyon ile desteklenmiş tam bir kültür ortamı ile birlikte, orta değiştirin. H en yüksek yüzdeye sahip klonlar için Ekran yPer pozitif hücreler ve Hyper pozitif hücreler (Şekil 2) sayısını artırmak geçiş Hyper olumlu klonlar.
    Not: Biz, son derece Hyper ifade stabil hücreleri için tek hücre ve ekran klonal seçimi için hücreler seri seyreltme kullanın.
  4. % 0.2 jelatin kaplı lamelleri (80% izdiham) istikrarlı Hyper-sito MPMVECs büyütün. 6 saat 37 ° ° C: TLR ligandları (1 mcg / ml LPS-TLR4; C)-TLR3 10μg/ml, Poli (2 mcg / ml, Lipoteichoic asit-TLR2) Sonraki gün meydan hücreleri Tedavi edilmeyen hücrelerin kontrol olarak hizmet vermektedir.
  5. Tedaviden sonra, lamelleri Attofluor hücre odası (Invitrogen) üzerine monte edin. Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) odaya ısındı ön 1ml ekle ve Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal görüntüleme sistemi, sıcaklık kontrollü bir sahnede odasına yerleştirin. Görselleştirin ve 40x yağlı objektif (Şekil 3A ve D) kullanılarak 488 nm eksitasyon görüntü floresan değişimi.
  6. ImageJ yazılımı (1.44) (bkz. Bölüm 6) kullanarak görüntüleri analiz edin.
istikrarlı Hyper-dMito MPMVECs mitokondriyal ROS itle "> 4 Görselleştirme

  1. Biz pHyPer dMito (Evrogen) H 2 O 2, özellikle mitokondri ve duyuları submicromolar konsantrasyon lokalize bir memeli ifade vektör kodlama mitokondri hedefli Hyper kullanın.
  2. Transfect pHyPer-dMito MPMVECs ve istikrarlı Hyper-dMito MPMVECs bölümünde 3,2-3,3 açıklanan adımları izleyerek oluşturur.
  3. % 0.2 jelatin kaplı lamelleri (80% izdiham) istikrarlı Hyper-dMito MPMVECs büyütün.
  4. 6 saat 37 ° ° C: TLR ligandları (1 mcg / ml LPS-TLR4; C)-TLR3 10μg/ml, Poli (2 mcg / ml, Lipoteichoic asit-TLR2) Sonraki gün meydan hücreleri Tedavi edilmeyen hücreler negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. 2μM Antimycin A (mitokondrial süperoksit indükleyicisi pozitif kontrol) görselleştirmek için önce örnek ekleyin.
  5. Tedaviden sonra, lamelleri Attofluor hücre odası (Invitrogen) üzerine monte edin. Odasına önceden ısıtılmış Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) 1ml ekleve Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal görüntüleme sistemi, sıcaklık kontrollü bir sahnede odasına koyun. Görselleştirin ve 40x yağlı objektif (Şekil 3B, C ve E) kullanarak 488 nm eksitasyon görüntü floresan değişimi.
  6. ImageJ yazılımı (1.44) (bkz. Bölüm 6) kullanarak görüntüleri analiz edin.

5. Co-kültür modeli + Ca 2 tetiklenen parakrin türetilen ROS görünüm için endotel hücreleri sinyal

Görselleştirme ve ölçümü için [Ca 2 +] i Ca 2 + hassas floresan boya fluo 04:00 (Invitrogen).

  1. % 0.2 jelatin kaplı 25mm cam lamelleri (80% izdiham) MPMVECs büyütün.
  2. PM fluo-4 yükleme izin ECM 5 mcM fluo 04:00 (Invitrogen) son konsantrasyon ile,% 2 BSA ve% 0.003 pluronic asit içeren 30 dakika oda sıcaklığında lamelleri yetiştirilen hücreler inkübe edin. Yükledikten sonra, (ECM 0 içeren hücreler deneysel görüntüleme çözümü ile yıkayın.Sülfinpirazon içeren boya kaybı en aza indirmek için% 25 BSA).
  3. Fluo-4, montaj lamelleri Attofluor hücre odası (Invitrogen) üzerine yerleştirdikten sonra. Odaya deneysel görüntüleme çözümü ısındı öncesi 800μl ekleyin ve Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal görüntüleme sistemi, sıcaklık kontrollü bir sahne üzerine yerleştirin.
  4. % 2 BSA içeren ECM hücre tracker kırmızı CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) ile (6 saat LPS ile tedavi) farelerde - ayrı bir tüp etiket nonactivated veya aktive makrofajlar yabani tip ya da gp91 phox / veya izole ve% 0.003 pluronic asit. Deneysel görüntüleme çözümü 200μl hücreleri yıkayın ve tekrar süspansiyon.
  5. Oda montaj fluo-4 yüklü PM MPMVECs etiketli makrofajlar ekleyin.
  6. Fluo-04:00 ve hücre tracker kırmızı floresan respectivel için 488 ve 561 nm dalga boyunda eksitasyon ile Argon iyon lazer kaynağı ile Carl Zeiss LSM510 Meta konfokal görüntüleme sistemi kullanılarak 10-20 dakika süreyle yeşil ve kırmızı floresan her 3s kaydediny (Şekil 4 AC).
    Not: Alternatif olarak, J774.1 hücre hattı MPMVECs Ca 2 + seferberlik ortaya çıkarmak için kullanılan olabilir.
  7. Analiz fluo-4 ImageJ yazılımı (1.44) (bkz. Bölüm 6) kullanılarak floresans yoğunluğunu değiştirir.

6. Veri analizi ImageJ yazılımını kullanarak

Konfokal sistem veri analizi. Lsm dosya biçimi olarak elde edilen görüntü aktarma. ZEN 2009 ve ZEN 2010 yazılımı LSM 510 Meta konfokal mikroskop veya LSM ile sağlanan 710 multiphoton konfokal mikroskop sırasıyla. Lsm formatındaki dosyaları kaydeder. Bu yerli kullanmanızı öneririz. Lsm dosyaları görüntü analizi için orijinal kalitesi korunur. Bu dosya biçimi, doğrudan aşağıdaki adımları bir örnek tek bir görüntü kantitatif analiz, görüntü analiz programı Resim J. açılabilir. Hiçbir ek eklentileri bu veri analizi için gereklidir.

  1. Dosya> Aç kullanarak J programında açın. Lsm veya TIFF dosyası
  2. Sekmesini tıklayın IMAGE> COLOR> SPLIT KANALLAR ve yeşil ve DIC kanallar ayrıldı. Sonraki analiz için yeşil kanal görüntüyü kullanın.
  3. Çift tıklayın ve 'Eliptik fırça seçimi "sekmesini seçin ve 20 piksel değeri ayarlayın.
  4. Hyper-sito görüntüler için, dairesel ölçüm alanını tanımlamak için tek bir hücre tıklatın. Daha sonra seçilen alanın yoğunluğunu ölçmek için "M" tuşuna basın. Değerleri, yeni bir sonuç penceresinde korunur.
  5. Sonraki "M" tuşuna basarak ve ardından başka bir alan, farklı bir hücre seçmek için "Shift" tuşuna tıklayın tutarak. Şiddeti sonucu penceresinde kaydedilir. 50 farklı hücreler 4-5 adımları tekrarlayın.
  6. Hiper d-mito görüntüler için, Oval fırça seçimi 10 piksel değeri ayarlayın. Ilgi Bölgesi (ROI), özellikle hücrelerin mitokondri de dahil olmak üzere elle izlenebilir.
  7. "M" tuşuna basın, daha sonra mitokondri ve çevresinde freehand kullanarak, bölgede iz. 50 farklı hücreler 6-7 adımları tekrarlayın.
  8. Bana kopyalayın sonuç penceresinde bir Excel sayfasına veya arsa için herhangi bir yazılım ve yapıştırma bir değer. Biz, grafik gibi verileri çizmek için SigmaPlot veya GraphPad Prism kullanır.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 TLR ligandları ile mücadele üzerine sitozolik ve mitokondriyal ROS üretimi gösterir. Temsilci konfokal görüntüleri DCF (sitozolik) ve MitoSOX Kırmızı (mitokondri) floresan stimülasyon 6 saat sonra artış göstermektedir. Floresan değişiklikler kat değiştirmek gibi normalleştirilmiş ifade edildi.

Şekil 2, istikrarlı Hyper-sito ve Hyper-dMito endotel hücreleri üretimi gösterir. Fare endotel hücreleri pHyPer-sito veya elektroporasyon yoluyla pHyPer dMito plazmid yapıları ile transfekte. Hücreler stabil bir şekilde ifade plazmid, iki hafta boyunca G418 ile seçildi. Seçimden sonra, seyreltilmiş hücreler 96 kuyucuğu ekilirler. Bireysel kolonileri izole edilmiş ve homojen bir ifade için görüntülü edildi.

e_content "> Şekil 3 endotel sitozolik ve mitokondriyal H 2 O 2 seviyeleri ölçümü gösterir. Temsilcisi konfokal görüntüler Hyper-sito (sitozolik) ve Hyper-dMito (mitokondri) stimülasyon 6 saat sonra floresan artış olduğunu göstermektedir. Floresans şiddeti normalize edildi ve kat değişikliği olarak ifade edilmiştir.

Şekil 4 türevi makrofaj-ROS bağlı endotel sitozolik Ca 2 + seferberlik değerlendirme gösterir. LPS-uyarılmış makrofajların, hücre içi Ca 2 ile önceden yüklenmiş olan pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri (PMVEC) üzerine eklenmiştir + ([Ca 2 +] i) göstergesi boya Fluo-4 . Vahşi tip LPS ile aktive makrofajlar Uygulama [Ca 2 +] uyarılmış i fonksiyonel NADPH oksidaz nakavt ile zayıflatılmış oldu PMVECs artış (gp91 phox / -).

Şekil 1
Şekil 1. Visualizatimakrofaj hücresel ROS ve mitokondriyal süperoksit oluşturulur. J774.1 hücreleri TLR2, 3 ve 4 ligandları ile meydan okudu (2 mcg / ml, Lipoteichoic asit-TLR2; 10μg/ml, Poli (I: C) TLR3 1 mcg / ml LPS-TLR4) az 6 saat süreyle 37 ° C Tedavi hücreleri ile yüklü sonra (A) hücresel ROS göstergesi (H 2 DCF-DA, yeşil floresan) veya (B) mitokondriyal süperoksit göstergesi (MitoSOX Kırmızı, kırmızı floresan). (C) Antimycin A, mitokondriyal ROS üretimi için bir pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Floresan değişiklikleri konfokal mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. (D) ve (E) ortalama floresan değişimi kantitasyonu.

Şekil 2
Şekil 2. Endotel hücre sitozolik ve mitokondriyal ROS göstergeleri istikrarlı ifade üretme şematik.

Şekil 3
Şekil 3. Vendotel sitozolik ve mitokondriyal H 2 O 2 seviyeleri isualization stably (A) Hyper-sito ifade MPMVECs veya (B) Hyper-dMito TLR2, 3 ve 4 ligandlar (2 mcg / ml, Lipoteichoic asit-TLR2 meydan; 10μg / ml, Poli (I: C) TLR3; 37, 6 saat 1 mcg / ml LPS-TLR4) ° C (C) Antimycin A, mitokondriyal ROS üretimi için bir pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Tedaviden sonra, floresan değişiklikleri konfokal mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. (D) ve (E) ortalama floresan değişimi kantitasyonu.

Şekil 4
Şekil 4. ROS bozulmuş endotel hücre Ca 2 + seferberlik temin Makrofaj türetilmiştir. (A), endotel hücreleri / makrofaj ko-kültür modeli çalışma şematik gösterimi. WT ve gp91phox boş fareler (Jackson Laboratory) hem de (B) Taze izole fare makrofajlar, 6 saat boyunca 1 mg / ml LPS ile aktive Macrophages hücre tracker Red (kırmızı) ile etiketli ve parakrin O 2 değerlendirmek için Fluo-4 yüklü PMVECs (yeşil) üzerine eklenen - sinyalizasyon (C) WT farelerin izole LPS ile aktive makrofajlar büyük ve hızlı Ca 2 + seferberlik tetikleyen PMVECs içinde makrofajlar gp91phox boş farelere kıyasla. Makrofaj aktivasyon Doğrulama daha önce kanıtlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada anlatılan yöntem hücreli canlılar ya oksidasyona hassas boyalar veya plazmid sensörleri kullanarak reaktif oksijen türlerinin hızlı ve kantitatif ölçüm sağlar. TLR agonistleri (Toll-benzeri reseptörler), hücre yüzeyinde bulunan TLR aracılığıyla hücrelerini uyarmak ve downstream sinyal yollar 15 tetikleyebilir bileşiklerdir . Protokolde, biz üç farklı TLR agonistleri yani, Lipo-teikoik asit-TLR2 agonist; Poli (I: C). TLR3 agonist; ROS ölçüm göstermek için bir model sistem olarak ROS neden LPS-TLR4 agonist . ROS ölçümü oksidanlar duyarlı boya kullanarak hızlı ve ROS türlerin çeşitliliği ölçmek için kullanılabilir. Plazmid tabanlı sensör Hyper H 2 O 2 seviyeleri seçerek algılar. H 2 O 2, daha istikrarlı oksidan ve aynı zamanda, istikrarlı bir hücre ortamda Hyper sito ve Hyper-dMito ROS hassas floresan boyalar fotoğraf özyükseltgenme avantajlıyız ekler.Hyper artefakt ROS üretimi neden olmaz ve çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullar altında farklı hücre bölümlerinde H 2 O 2 konsantrasyonunun hızlı değişikliklerin tespiti için kullanılabilir. Stably Hyper sensörleri ifade Hücreler H 2 O 2 düzeylerinin daha güvenilir ve doğru bir ölçüm sunan nüfusun klonal seçimi için kullanılır . Daha da önemlisi, bu yöntem aynı zamanda algılama ve kantitatif ölçüm Ca 2 + canlı hücreler gibi doğuştan gelen bağışıklık hücreleri gibi komşu hücrelerin parakrin elde edilen ROS tarafından tetiklenen seferberlik açıklar . Konfokal mikroskobu ile birlikte bu deneysel prosedür, özellikle iki farklı hücre tipleri söz konusu durumlarda hücre sinyal iletimi olayları uzay-zamansal önemli değişiklikleri ortaya çıkarmak için çok yararlı olabilir. Rağmen, bu yazıda ayrıntılı temsilcisi deneyler çalışılan etkileşimin türü sadece bir örnektir, bu tekniği kolayca olabilirbirden fazla canlı hücre türleri arasındaki hücresel etkileşimleri çalışmak için dapted.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma, MM için, Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (HL086699 R01, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) tarafından desteklenmiştir. Bizim makale kısmen Carl Zeiss Microimaging LLC tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor cell chamber Invitrogen A7816
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
DMEM low glucose medium Invitrogen 10567-014
Endothelial growth factor supplement (ECGS) Upstate, Millipore 02-102
Fetal Bovine Serum Invitrogen 12662011
G418 Invitrogen 10131-027
Gelatin Sigma-Aldrich G1393
H2DCFDA Invitrogen D-399
LPS Sigma-Aldrich L4516
LTA Sigma-Aldrich L2515
MitoSOX Red Invitrogen M36008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Invitrogen 51985091
Pen/Strep (10x) Invitrogen 15140163
pHyPer-cyto Evrogen FP941
pHyPer-dMito Evrogen FP942
Poly(I:C) Sigma-Aldrich P0913
Prism software 5.0 GraphPad Software Inc.
SigmaPlot 11.0 Systat software, Inc.
Trypsin-EDTA (10x) Invitrogen 15400054
T-25 Flasks Corning 430639
T-75 Flasks BD Biosciences 353136
96-well TC micro well plate BD Biosciences 353072
Zen 2009 software Carl Zeiss, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Madesh, M. Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis. J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).
  2. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).
  3. Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 Forthcoming.
  4. Hawkins, B. J. S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis. J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).
  5. Madesh, M., Hajnoczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
  6. Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
  7. Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. Harmful molecular mechanisms in sepsis. Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).
  8. Sanlioglu, S. Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa. 276, 30188-30198 (2001).
  9. Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling. Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).
  10. Vliet, A. vander NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more. Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).
  11. Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent. J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).
  12. Lambeth, J. D. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).
  13. Mukhopadhyay, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).
  14. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  15. Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
Vasküler Ca Görselleştirme<sup> 2 +</sup> Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mallilankaraman, K., Gandhirajan, R. K., Hawkins, B. J., Madesh, M. Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS. J. Vis. Exp. (58), e3511, doi:10.3791/3511 (2011).More

Mallilankaraman, K., Gandhirajan, R. K., Hawkins, B. J., Madesh, M. Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS. J. Vis. Exp. (58), e3511, doi:10.3791/3511 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter