Summary
En teknikk for å sondere lipid flåten partisjonering av fluorescerende proteiner på plasmamembranen av levende celler er beskrevet. Det tar nytte av misforhold i diffusjon tider med proteiner lokalisert innenfor eller utenfor lipid flåter. Oppkjøp kan utføres dynamisk i kontroll forhold eller etter narkotika tillegg.
Abstract
I de siste femten årene den oppfatningen at cellemembraner er ikke homogent og stole på microdomains å utøve sine funksjoner er blitt allment akseptert. Lipid flåter er membran microdomains anriket på kolesterol og sphingolipids. De spiller en rolle i cellulære fysiologiske prosesser som signalering og menneskehandel 1,2, men er også antatt å være sentrale aktører i flere sykdommer, inkludert virus-eller bakterieinfeksjoner og nevrodegenerative sykdommer 3.
Likevel deres eksistens er fortsatt et spørsmål om uenighet 4,5. Faktisk har lipid flåte størrelsen er anslått å være rundt 20 nm 6, langt under oppløsningen grensen av konvensjonell mikroskopi (rundt 200 NM), og dermed utelukker deres direkte avbildning. Inntil nå, var de viktigste teknikkene som brukes til å vurdere delingen av proteiner av interesse inne lipid flåter Vaskemiddel Resistente membraner (DRMS) isolasjon og co-patching med antistoffer. Selv om mye brukt becabruk av deres ganske enkel implementering, var disse teknikkene tilbøyelige til gjenstander og dermed kritisert 7,8. Tekniske forbedringer var derfor nødvendig å overvinne disse gjenstandene, og for å kunne undersøke lipid flåter partisjon i levende celler.
Her presenterer vi en metode for sensitiv analyse av lipid flåtene partisjon av fluorescently-merkede proteiner eller lipider i plasmamembranen av levende celler. Denne metoden kalles fluorescens korrelasjon spektroskopi (FCS), avhengig av ulikheten i diffusjon tider med fluorescerende prober plassert innsiden eller utsiden av lipid flåter. Faktisk, noe som gjenspeiles i både kunstig membraner og cellekulturer, ville sonder spre mye raskere ute enn inne tette lipid flåter 9,10. For å bestemme diffusjon ganger, er liten fluorescens svingninger målt som en funksjon av tid i en fokal volum (ca. 1 femtoliter), som ligger ved plasma membran av celler med en confocal mikroskop (Fig.1). De auto-korrelasjon kurver kan da trekkes fra disse svingningene og utstyrt med egnede matematiske spredning modeller 11.
FCS kan brukes til å bestemme lipid flåten oppdeling av ulike sonder, så lenge de er fluorescently tagget. Fluoriserende tagging kan oppnås ved uttrykk av fluorescerende fusion proteiner eller ved binding av fluorescerende ligander. Videre kan FCS brukes ikke bare i kunstige membraner og cellelinjer, men også i grunnskolen kulturer, som beskrevet nylig tolv. Den kan også brukes til å følge dynamikken i lipid flåte partisjonering etter narkotika tillegg eller membran lipidsammensetning forandring 12.
Protocol
1. Kalibrering av FCS Setup
- Start confocal mikroskop, lasere, datamaskiner, inkubator for temperatur og CO 2 kontroll.
- Kontroller at SPAD (Single Photon Avalanche Diode) er på og fluorescens filteret inne i SPAD er godt egnet til prøven din. Kontroller at SPAD er synkronisert i tid. Beware å bare starte FCS programvare så snart dine SPAD innstillingene er klare for oppkjøp.
- Forbered en frisk løsning av koleratoksin-Alexa488 fortynnet i PBS å nå en konsentrasjon på 1 mg / ml (17,5 nM).
- Optimalisere confocal avbildning av løsningen ved hjelp av intern overvåkning av mikroskopet.
- Bytt til peke skanning modus og velge et punkt i løsningen utvalget. Pass på at varigheten av laser belysning er lang nok til å utføre dine FCS oppkjøp (> 5 minutter).
- Bytt til ekstern påvisning av SPAD og til FCS programvaren. Overvåk fluorescens signal og sørge for at det er godt Suited til SPAD (nok signal, men ingen metning, 10 000 til 50 000 teller / s er fin). Om nødvendig, endre z posisjon, gevinst og / eller laser makt for å oppnå riktig fluorescens signal.
- Erverve 10 sett på 30 sekunder målinger. Oppkjøp tid bør være optimalisert for prøven (kompromiss mellom beste prøvetaking og photobleaching problemer).
- Analysere dataene (se trinn 4) for å sikre at du har en auto-korrelasjon kurve tilsvarer en fluorescerende art spre i løsningen (likningen i fig. 2) og at spredning tiden innhentet etter montering er korrekt (ca 0,2 ms) (Fig . 3).
2. Farging av levende celler med Lipid Rafts Marker
- Plate HEK293 celler på åtte-brønns Labteks belagt med poly-L-lysin (1mg/ml) dagen før fotografering for å sørge for at deres adhesjon er riktig. Bruk medium uten fenol rødt for å sikre at det ikke endringen av den fluorescens signalet.
- Vask cellene to ganger med HBSS (Hank bufret Salt Solution).
- Legg koleratoksin-Alexa488 (1 mg / ml) / BSA (0,1%) i 500 mL HBSS til cellene i 30 minutter ved 37 ° C. Koleratoksin vil binde seg til ganglioside GM1, kjent for å være fortrinnsvis partisjonert i lipid flåter.
- Vask cellene to ganger med HBSS (Hank bufret Salt Solution).
3. FCS Datainnsamling på levende celler
- Plasser de fargede cellene i mikroskop scenen. Pass på temperaturen og CO 2 forholdene er optimale ellers kan dette føre til artefakter i diffusjon ganger.
- Optimalisere confocal avbildning av en celle av interesse å bruke intern overvåkning av mikroskop (Fig. 4).
- Bytt til peke skannemodusen og velge et punkt i plasmamembranen av cellen av interesse. Utfør 1-2 levende bilder av cellen for å sørge for at cellen ikke beveger seg under oppkjøpet.
- Bytt til ekstern påvisning av SPAD og til FCS mykeware. Overvåk fluorescens signalet og sørg for at den er godt egnet til SPAD (nok signal, men ingen metning, 10 000 til 50 000 teller / s er fin). Om nødvendig, endre z posisjon, gevinst og / eller laser makt for å oppnå riktig fluorescens signal. Hvis dette ikke er nok, kan du vurdere å endre flekker forhold.
- Erverve 10 prøver av 30 sekunder målinger. Som de fleste celler er auto-fluorescerende, kan du se en reduksjon i fluorescens i løpet av de første oppkjøpene, på grunn av auto-fluorescens falming.
4. FCS Data Analysis
- Angi korrelasjonen intervallet og generere auto-korrelasjon kurver med FCS programvaren. Korrelasjonen intervall vil typisk variere fra den korteste løses lag tid opp til lengst mulig tid (som statistikken over målingen blir mer og mer utilstrekkelig når maksimal korrelasjon tiden nærmer seg total anskaffelse tid, er den maksimale lag tid begrenset til 80% av Kjøpet tid på Picoquant programvare).
- For hver prøve, eksportere filer som tilsvarer fluorescens svingninger og auto-korrelasjon som funksjon av tid.
- Bruk en dataanalyse og montering programvare som Origin Pro for å importere filene.
- For hver prøve, sørg for det er ingen fotobleking under oppkjøpet dvs. fluorescens forblir stabil gjennom de 30 sekunder. Kast alle tiltak viser photobleaching da dette kan forårsake kunstige lengre diffusjon ganger.
- Kontroller at formen på den gjenværende FCS kurvene er riktig (se fig 5). Bestem gjennomsnittlig FCS kurven.
- Monter kurven med den aktuelle matematiske modellen (Fig. 2). Dette passform vil gi deg diffusjon tid (er) og andelen av molekyler spre med dette (ESE) diffusjon time (s).
5. Representative Resultater
Et eksempel på en FCS kalibrering med en koleratoksin-Alexa488 løsning er vist i figur 3 (Figur 3a), individuell og gjennomsnittlig FCS kurver ble beregnet. Bety FCS kurver ble utstyrt med ligninger tilsvarende ulike diffusjon modeller (eksempler i figur 2). Parameteren klassisk ansett for å avgjøre kvaliteten på en passform er koeffisienten R 2. Jo nærmere R 2 er 1, desto bedre passform. I dette tilfellet er den mest nøyaktige modellen til å passe gjennomsnittet FCS kurven den ene beskriver en befolkning av fluorescerende molekyler spre seg fritt i tre dimensjoner (likning 1 i Figur 2 og Figur 3B). Spredningen tid utledet fra passformen er 0,32 ms. Residualene fra kurvetilpasning (Figur 3C) og R 2 faktor (0,99906) gir et anslag på kvaliteten på passform.
Et eksempel på FCS analyse for koleratoksin-Alexa488 beiset HEK293 celler er vist i figur 5. Den multiphasic gjennomsnittlig FCS kurveform avslører eksistensen av bestander av fluorescerende molekyler med forskjellige diffusjon ganger. Den passer best for denne kurven tilsvarer en modell med tre populasjoner av fluorescerende prober: to med en hindret diffusjon (diffusjon i to dimensjoner som i membranen planet) og ett fritt spredende i tre dimensjoner (ligning 2 i figur 2 og figur 5) . Denne sistnevnte befolkningen tilsvarer fluorescerende molekyler beveger seg utenfor membranen flyet, dvs. enten binding eller uforpliktende til sine membran mål, nådde membranen gjennom sekresjon eller resirkulering gangsti, eller forlater membranen ved endocytose. De to diffusjon ganger på membranen, tilsvarende koleratoksin bundet til GM1, var 2 ms (25% av molekyler), tilsvarende spredning utenfor lipid flåter, og 75 ms (50% av molekyler), tilsvarende diffusjon i lipid flåter . Vær oppmerksom på at photobleaching i løpet av oppkjøpet vil føre til kunstige lengre diffusjon ganger og dermed muligens skape en bias mot lokalisering av GM1 i lipid flåte domener.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av FCS set-up (bildet endret fra Marquer et al. 12)
Figur 2. Eksempel på diffusjon modeller og tilsvarende ligningene som brukes til å passe Autokorrelasjonskoeffisienter kurver. Strukturen parameter S kan skrives som S = z 0 / w 0 med z 0 effektiv brennvidde radius langs den optiske aksen ved 1 / e 2 intensitet og W0 effektiv lateral fokal radius på 1 / e 2 intensitet. Disse verdiene kan utvinnes fra en klassisk punkt spread funksjon (PSF) måling.
Figur 3.. Vurdering av diffusjon tid koleratoksin-Alexa488 i løsningen for FCS kalibrering. A) Fluorescens svingning som en funksjon av tid for et representativt eksempel på en 30 sekunder oppkjøp. B) Mean autokorrelasjon kurve hentet fra 10 prøver av 30 sekunder oppkjøpet utstyrt med ligning 1 (se figur 2). C) residualene fra kurvetilpasning.
Figur 4. HEK-293 celle farget med koleratoksin-Alexa488. Celler ble fotografert på en SP5 confocal mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar Tyskland) med den interne 488nm laser linje. Fluorescens ble samlet inn med en X60 plan apochromat oljeneddyppingsobjektivet mellom 500650 nm og.
Figur 5. Vurdering av diffusjon tid koleratoksin-Alexa488 på plasma membran av HEK293 celler. A) Mean autokorrelasjon kurve utstyrt med likning 2 (se figur 2). B) residualene fra kurvetilpasning. (Modifisert fra Marquer et al. 12)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den FCS metoden presenteres her gir en sensitiv og rask analyse av lipid flåten partisjonering av fluorescerende prober interessante i levende celler. FCS kombinerer nøyaktigheten av lokalisering av konfokalmikroskopi med følsomheten enkelt foton telling. Den største forskjellen mellom FCS og standard biokjemiske teknikker er at FCS gjør den absolutte bestemmelse av lipid flåter partisjonen av målet og ikke relative partisjonen som er tilfellet for DRMS isolasjon eller co-patching.
Anskaffelse av FCS data tar ca 5 minutter (10 oppkjøp av 30 sekunder) for hver prøve, og er således ganske rask i forhold til vanlige biokjemiske teknikker. Dette hurtighet gjør det mulig å følge med tiden forstyrrelse i lipid flåte partisjonering som kan resultere fra narkotika tillegg. Imidlertid kan analyser av Autokorrelasjonskoeffisienter kurver være litt vanskelige som de ulike modeller for montering må bla gjennom for å bestemmemest nøyaktige ett. Videre photobleaching under oppkjøpet må unngås da dette kan føre til artefakter.
Her beskriver vi et eksempel hvor vi kan avgrense lipid flåten oppdeling av en lipid: ganglioside GM1 (Fig. 5). En slik studie ville ikke vært mulig med standard biokjemiske prosedyrer som bare kan brukes til proteiner. FCS er ikke begrenset til lipider skjønt, og kan også brukes for proteiner, enten merket med et fluorescerende ligand (f.eks transferrin-Alexa555 binder seg til transferrin reseptor, kjent for å være lokalisert utenfor flåtene 9) eller uttrykt som en fusjon med et fluorescerende protein (f.eks APP-YFP eller Bace1-GFP 9, to viktige protein aktørene i Alzheimers sykdom). Det kan dermed brukes til en rekke mål. Videre kan FCS implementeres ikke bare i cellelinjer, som beskrevet her, men også i primære kulturer 9.
Vedrørende koleratoksin, bør du huske påat den har en tendens til å aggregere GM1 i pentamers, og dermed skape membran mikro-domener som kan være forskjellig fra innfødte lipid flåter. Det er derfor du ikke kan bruke colocalisation med koleratoksin å finne ut om protein av interesse er innsiden eller utsiden av flåter. Likevel, diffus membran proteiner, slik som APP-YFP og Bace1-GFP, i lipid flåter med diffusjon tider 60-80 9 ms, svært likt det ble observert med koleratoksin (75 ms). Dermed koleratoksin kan brukes til å kalibrere ditt oppsett og sjekk at du kan skille mellom raske og langsomme diffusjon ganger.
FCS er også egnet for mange andre bruksområder 13,14 eksempel fastsettelse av oligomerisation tilstand av et protein 15 eller ligand / reseptor farmakologiske studier 16. Det kan også kobles til andre mikroskopi teknikker som Total Internal Reflection Fluorescens (TIRF) 17,18 eller stimulert Emission Nedbryting (Schibsted) 19.Faktisk gjør Sted-FCS en enda mer nøyaktig fastsettelse av lipid flåte partisjonering 19, men opp til nå, er Schibsted mikroskopi fortsatt kostbart og dermed lite utbredt.
De viktigste rammene av FCS er behovet for lave konsentrasjoner av fluorophores (i nanomolar området) og rask diffusjon ganger slik at fluorophores vil ikke photobleach før du forlater eksitasjon volum. Komplementære teknikker for å vurdere diffusjon av proteiner inkluderer FRAP (Fluorescens Recovery Etter photobleaching) og ICS (Bilde korrelasjon spektroskopi) teknikker (anmeldt i 20).
I FRAP, er en høy intensitet laserstråle brukes til photobleach en region av en celle og utvinning av fluorescens etter photobleaching blir deretter overvåket. Dette utvinning kommer fra spredningen av fluorophores fra ikke-blekede områder til bleket området. Dermed diffusjon tider kan utvinnes fra utvinning kinetikk. FRAP kan brukes med høye konsentrasjoner of fluorophores og kan få tilgang til stort utvalg av diffusjon ganger, og dermed gjør det komplementære til FCS. FRAP har blitt brukt til å vurdere om en fluoroforen var majoritarily innsiden eller utsiden av flåtene 21,22, men det er fortsatt en ganske bulk metode for å kvantifisere andelen fluorophores spre inne eller utenfor flåter i området av interesse.
ICS er en avbildning analog av FCS, hvor romlig korrelasjon beregnes piksel for piksel for en gitt bilde 23. Det har den fordelen å være mottakelig for studiet av sakte spre fluorescerende prober men er begrenset til 2D-analyse. Denne grensen ble overmannet av utviklingen av ICS kalt spatio-Temporal ICS (STICS) 24. STICS gjør spatio-temporal korrelasjon av fluorescerende prober på en bunke med bilder og er dermed en kraftig teknikk om det krever mye beregningsorientert implementering og har en lavere tidsoppløsning enn FCS. Faktisk er både ICS og STICS begrenset til å behandle mye tregere then oppkjøpet tid en bilderamme. En annen utvidelse av ICS kalles raster ICS (RICS) 25,26 muliggjør analyse av raske spredning prosessen ved å utnytte den raster skannemodus tilgjengelig på de fleste kommersielle confocal mikroskoper. RICS er allsidig som den kan brukes for en stor spredning utvalg (fra μs til ms) men gjennomføringen (skanningsparametere, databehandling) kan være tungvint. Vi fant ikke mange papirer i litteraturen som rapporterer bruk av ICS og avledet teknikker for å studere lipid flåter 27-29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Agence Nationale de la Recherche (ChoAD). Vi er også takknemlige til Fondation ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) for deres økonomiske støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cholera toxin subunit B-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57 kg/mol |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | |
| Incubator for temperature and CO2 control | Life imaging services | The Cube and the Box | |
| SPAD (Single Photon Avalanche Diode) | MPD (Micro Photon Devices) | PDM serie (100 µm sensitive area) | |
| High pass 488 nm filter | Semrock | 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25 | |
| FCS detection unit | Picoquant | Picoharp 300 module | |
| Acquisition and auto-correlation software | Picoquant | SymPhoTime | |
| Fitting software | OriginLab | OriginPro8 |
References
- Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Gerl, M. J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
- Simons, K., Ehehalt, R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).
- Munro, S. Lipid rafts: elusive or illusive. Cell. , 115-377 (2003).
- Shaw, A. S. Lipid rafts: now you see them, now you don't. Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).
- Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).
- Brown, D. A., London, E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).
- Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).
- Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes. Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).
- Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in living cells. Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).
- Marquer, C. Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).
- Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications. Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).
- Ilien, B. Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process. J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).
- Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).
- Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy. Biophys. J. 33, 435-454 (1981).
- Thompson, N. L., Steele, B. L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).
- Eggeling, C. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457, 1159-1162 (2009).
- Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).
- Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts. J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).
- White, R. Holin triggering in real time. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).
- Digman, M. A. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).
- Digman, M. A. Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure. Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).
- Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells. Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys. J. 92, 613-621 (2007).
- Bates, I. R. Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones. Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).
